左旋一叶萩碱及其可药用盐在制备抗抑郁症药物中的应用
阅读说明：本技术 左旋一叶萩碱及其可药用盐在制备抗抑郁症药物中的应用 (Application of L-securinine and its medicinal salt in preparing antidepressant drug ) 是由 师蕾 叶文才 王英 吴振龙 彭颖慧 陶丽君 张清华 肖涵琳 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了左旋一叶萩碱及其可药用盐在制备抗抑郁症药物中的应用。本发明专利所述的抗抑郁药物为单一成分的左旋一叶萩碱及其可药用盐或含有左旋一叶萩碱及其可药用盐的药物组合物；上述药物或药物组合物所采用的剂型为片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、散剂、丸剂、喷雾剂、悬浮液、注射剂或滴注液。该类药物或药物组合物及其可药用盐可应用于急性抑郁和慢性抑郁症的治疗,具有疗效显著、起效快、毒副作用小的特点。(The invention discloses application of L-securinine and a medicinal salt thereof in preparing an anti-depression medicament. The antidepressant drug disclosed by the invention is single-component L-securinine and a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutical composition containing the L-securinine and the pharmaceutically acceptable salt thereof; the medicament or the pharmaceutical composition adopts the dosage forms of tablets, capsules, solutions, granules, powder, pills, sprays, suspensions, injections or instillations. The medicine or the medicine composition and the medicinal salt thereof can be applied to the treatment of acute depression and chronic depression and have the characteristics of obvious curative effect, quick response and small toxic and side effect.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及左旋一叶萩碱及其可药用盐在制备抗抑郁症药物中的应用。
背景技术
抑郁症是以情绪低落为主要特征的一种常见精神疾病，常伴有***倾向（FerrariA J, et al. PLoS Medicine, 2013, 10(11): e1001547）。据世界卫生组织公布的资料显示，全球约有3.5亿人患有抑郁症，且每年约100万抑郁症患者***，在中国约有6100多万抑郁症患者。随着社会发展、生活节奏的加快，预计患病人数还会不断增加，给社会带来沉重的经济负担（Phillips MR, et al, Lancet, 2009, 373(9680): 2041-2053）。目前临床上使用的一线抗抑郁药物主要是选择性5-羟色氨的再摄取抑制剂，如氟西汀、帕罗西汀和舍曲林等药物，其基本原理是基于早期研究认为抑郁症患者脑内的5-羟色氨水平较低。然而，这些药物具有两个明显的局限性：1）药效产生慢，一般在患者服用5–7周后才开始产生效果；2）响应低，只有约三分之一的患者对药物有反应。更值得注意的是，在一些案例中，药物发挥了抗抑郁治疗效果但并没有检测到5-羟色胺的升高。这些证据说明，5-羟色胺的水平可能不与抑郁水平具有直接联系，亦不是抗抑郁药物的最有效靶点。
研究表明，抑郁症患者的脑部多个区域发生病变，其中变化最稳定的是海马和前额皮层部位的神经元丢失、萎缩、树突蛋白表达下降、树突棘和突触数量减少（Krishnan Vand Nestler EJ, Nature, 2008, 455(7215): 894; Kang HJ, et al, Nature Medicine, 2012, 18(9): 1413-1417）。在抑郁症的动物模型中，也出现与患者相一致的脑部病理特征，如海马神经元的分支减少、长度变短、树突棘减少、突触萎缩等（Duman RS, etal, Nature Medicine, 2016, 22(3): 238）。mTOR分子信号通路作为神经元中的重要调控通路，可通过调整自噬、转录、翻译等过程，改善神经突触蛋白的表达从而促进突触功能，而且多种传统抗抑郁药也具有一定激活mTOR的作用；因此，mTOR可能成为抗抑郁药的一个重要靶点（Ignácio ZM, et al, Br J Clin Pharmacol, 2016, 82(5):1280-1290）。近年来发现的第一种不同于5-羟色氨的再摄取抑制剂的抗抑郁药——***，具有见效快、响应高的优势。***可通过抑制NMDA受体功能和激活mTOR通路等途径调整神经网络及神经元突触的功能，但***过量可使病人产生致幻性和成瘾性，临床使用受限制。因此，亟需开发出高效低毒的新型抗抑郁药物。
一叶萩碱 (securinine) 属吲哚里西啶类生物碱，天然的一叶萩碱包括左旋一叶萩碱和右旋一叶萩碱。已发现左旋一叶萩碱具有拮抗神经递质受体GABAA受体从而兴奋中枢神经的作用(Beutler JA, et al, Brain Res, 1985, 3310(1):135-140)，在临床上已使用硝酸左旋一叶萩碱注射剂，用于治疗面部神经麻痹、神经衰弱、嗜睡症和小儿麻痹后遗症等疾病。然而，左旋一叶萩碱在抑郁症中的应用尚未见报道。发明人发现，左旋一叶萩碱可提高抑郁小鼠脑部的mTOR通路水平及突触蛋白水平，对于急性抑郁和慢性抑郁的小鼠均有显著疗效，有望开发为治疗抑郁症的新型药物。
发明内容
本发明的首要目的在于提供左旋一叶萩碱或其可药用盐在制备抗抑郁症药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种左旋一叶萩碱，具有如式（1）所示的化学结构：
上述左旋一叶萩碱及其可药用盐的制备方法，包括以下步骤：
一叶萩植物原材料干燥后粉碎，用95%乙醇渗漉提取，减压浓缩得一叶萩提取物总浸膏；总浸膏用水混悬，加10%盐酸水溶液调pH至2–3，经氯仿萃取后，酸水层加氨水调pH至9–10，再用氯仿萃取，氯仿层减压浓缩，得一叶萩总生物碱；总生物碱经硅胶柱层析纯化，得左旋一叶萩碱富集部位，将该富集部位重结晶，得左旋一叶萩碱晶体。
取左旋一叶萩碱晶体，缓慢加入稀酸溶液，使左旋一叶萩碱晶体完全溶解，冰水浴冷却后减压干燥，得到左旋一叶萩碱的盐，再用无水乙醇溶解，放置重结晶，过滤干燥，得到左旋一叶萩碱可药用盐的纯品。
上述所述的可药用的盐包括但不限于：无机阴离子，例如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、亚硫酸根、硝酸根、亚硝酸根、磷酸根和磷酸氢根等；有机阴离子，例如乙酸根、丙酸根、肉桂酸根、苯甲硫磺根、柠檬酸根、乳酸根和葡萄糖酸根等。
左旋一叶萩碱及其可药用盐可以制成多种剂型，包括片剂、丸剂、糖锭剂、颗粒剂、凝胶剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂以及喷雾剂。这些剂型既能用于局部或全身给药又能用于速释或缓释给药。当注射给药时，可以用水溶性或脂溶性的溶剂将化合物配制成溶液剂、悬浊剂和乳剂。当口服给药时，可以采用常用技术将其与可药用的赋形剂制成复合物。这些赋形剂可以将这些化合物制成多种可以被病人接受的剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、混悬剂、凝胶剂等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明提供了左旋一叶萩碱及其可药用盐在治疗抑郁症的新应用。实验数据表明，左旋一叶萩碱对于急性抑郁和慢性抑郁的小鼠均有显著疗效，单次给药后即有效果且起效快速，且对动物的自主运动无影响。因此，左旋一叶萩碱及其可药用盐所制备的抗抑郁症药物，具有疗效显著、起效快、安全性好的特点。
附图说明
图1：左旋一叶萩碱单次腹腔给药入血和入脑的药物动力学曲线，其中A为左旋一叶萩碱腹腔给药不同时间后的血药浓度，B为左旋一叶萩碱腹腔给药不同时间后的脑药浓度。
图2：左旋一叶萩碱降低小鼠在强迫游泳模型中的急性抑郁水平：腹腔给药左旋一叶萩碱30min(A)或90min(B)后，强迫实验中的不动时间结果。每组实验15 只小鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA；*p＜0.05，**p＜0.01。
图3：左旋一叶萩碱激活小鼠脑中的AKT-mTOR-S6K、ERK及p38通路：(A)左旋一叶萩碱腹腔注射给药90min 后，取前脑部位(主要为脑皮层和海马)匀浆后进行Western blot实验，检测各个信号通路的响应。(B-G)不同信号通路蛋白变化的统计结果；结果为6 组样品的平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA；*p＜0.01，***p＜0.001。
图4：口服左旋一叶萩碱的抗急性抑郁作用：口服一叶萩碱3 小时后，强迫游泳不动时间的统计结果。每组15 只鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA，*p＜0.05。
图5：左旋一叶萩碱对慢性抑郁模型小鼠的治疗作用：慢性抑郁模型小鼠给药一叶萩碱后，测试糖水偏好(A)、强迫游泳(B)、mTOR 通路激活(C)、以及PSD95 表达(D)。可看出单次给药即可改善糖水偏好失调及增加强迫游泳中的不动时间；多次给药后效果更加明显。对于mTOR 通路激活和PSD95 表达方面，单次给药效果不明显，多次给药效果显著。每组15 只鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA，**p＜0.01，***p＜0.001，抑郁模型+DMSO组vs 正常鼠组；#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，抑郁模型+左旋一叶萩碱组vs 抑郁模型+DMSO 组；＆＆，抑郁模型+单次左旋一叶萩碱组vs 抑郁模型+多次左旋一叶萩碱组。
图6：左旋一叶萩碱未对小鼠的自主行为产生毒副作用：左旋一叶萩碱给药60min后，测试小鼠在旷场中运动的各项指标：(A)中心区域停留时间；(B)外周区域停留时间；(C)中心区域运动距离；(D)外周区域运动距离；(E)总运动距离；(F)中心区域运动速度；(G)外周区域
运动速度；(H)总运动速度。各项指标均无统计学差异。每组15 只小鼠，结果为平均值每组15 只鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：左旋一叶萩碱的分离纯化
取干燥一叶萩枝叶1 kg，粉碎后用95%乙醇5 L渗漉提取，提取3次，合并提取液，减压浓缩得总浸膏80 g；总浸膏用800 mL水混悬，加10%盐酸水溶液50 mL调pH至2~3，经氯仿萃取后，酸水层加氨水30 mL调pH至9–10，再用氯仿萃取，氯仿层减压浓缩，得一叶萩总生物碱0.9 g；总生物碱再经硅胶柱层析纯化，氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，合并富含左旋一叶萩碱的流分，重结晶，得左旋一叶萩碱晶体约200 mg。
实施例2：左旋一叶萩碱盐的制备
左旋一叶萩碱晶体（纯度>95%）100 mg，缓慢加入6 mL 1%盐酸溶液使其完全溶解，冰水浴下放置2 h，减压干燥后用3 mL无水乙醇溶解，静置重结晶，晶体经甲醇洗涤后过滤干燥，得到左旋一叶萩碱盐酸盐（103 mg）。
左旋一叶萩碱晶体（纯度>95%）100 mg，缓慢加入2 mL 1%硫酸溶液使其完全溶解，冰水浴下放置2 h，减压干燥后用3 mL无水乙醇溶解，静置重结晶，晶体经甲醇洗涤后过滤干燥，得到左旋一叶萩碱硫酸盐（108 mg）。
左旋一叶萩碱晶体（纯度>95%）100 mg，缓慢加入3 mL 1%硝酸溶液使其完全溶解，冰水浴下放置2 h，减压干燥后用3 mL无水乙醇溶解，静置重结晶，晶体经甲醇洗涤后过滤干燥，得到左旋一叶萩碱硝酸盐（110 mg）。
实施例3：左旋一叶萩碱及其几种盐的促神经细胞分化活性
目的：考察左旋一叶萩碱及其硝酸盐、盐酸盐、硫酸盐的促神经细胞分化活性
方法：Neuro-2a细胞（购于American type culture collection细胞库）复苏后，以生长培养基（MEM+10%FBS +100 U/ mL的青霉素和 100μg/mL的链霉素）培养，种植在100 mm的培养皿中，放入37℃、含5 % CO2的恒温培养箱培养。细胞长至60–70%进行传代，吸去培养皿中的培养液，加入适量PBS清洗后用0.25%的胰蛋白酶消化45秒，待贴壁细胞呈圆球状后加生长培养基终止消化，混匀按1:10传代，三天一传。诱导神经细胞株分化时，细胞种植密度为2×104个/35 mm培养皿或1×104个/孔（12孔板），以生长培养基培养24小时后换为分化培养基（MEM +0.5% FBS +100 U/ mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素），并加入左旋一叶萩碱或其几种可药用盐处理48小时。用4%多聚甲醛/4%蔗糖固定细胞20–30 min，神经细胞株的分化形态和神经突起采用β-tubulin III（神经突起特异表达的标志蛋白）抗体免疫荧光染色的方法观察。采用高内涵仪器进行自动扫描拍照，并利用Cellomics view 软件进行统计分析。定义神经突起长度大于两倍胞体的细胞为神经细胞，并进行统计分析每个分化细胞的总神经突起的平均长度。
结果：左旋一叶萩碱及其硝酸盐、盐酸盐和硫酸盐均具有相似的促进神经细胞分化的活性（表1）。
表1. 左旋一叶萩碱及其几种盐的促神经细胞分化活性
a表中数值为神经突起长度（单位：μm），结果为三次独立实验的平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA。b为阳性对照物反式视黄酸 (all-trans retinoic acid; RA)。
实施例4：左旋一叶萩碱及其几种可药用盐的促神经突触形成活性
目的：考察左旋一叶萩碱及其硝酸盐、盐酸盐、硫酸盐的促神经突触形成活性
方法：取胚胎期18天的斯普拉-道来（Sprague Dawley）大鼠胎鼠的海马组织，用胰酶消化后得到单个分离神经元，种植于多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）包被的18 mm玻片上，密度为0.2×105/玻片，置于添加了2% B27的Neurobasal培养基中培养。每三天换一次液（加入2% B27的Neurobasal培养基），每次半换。于培养第14天时加入DMSO或左旋一叶萩碱或其几种可药用盐（10 μM），处理48小时。先用4%多聚甲醛固定5分钟，再用预冷的甲醇在冰上固定15分钟。之后采用PSD-95 (兴奋性神经突触后部特异表达的标志蛋白) 抗体免疫荧光染色的方法评价突触形成的情况。用Zeiss Imager A2荧光显微镜拍照，统计各组中平均树突长度上PSD-95簇集的数量。
结果：左旋一叶萩碱及其硝酸盐、盐酸盐和硫酸盐均具有相似的促进PSD-95簇集的活性（表2）。
表2. 左旋一叶萩碱及其几种盐促进PSD-95簇集的活性
实施例5：左旋一叶萩碱腹腔注射给药后入血和入脑的药物动力学结果
目的：研究左旋一叶萩碱入血和入脑的药物动力学参数
方法：
7–8月龄的雄性C57BL/6J小鼠，实验前1天禁食12小时，自由饮水，按7.5 mg/kg剂量腹腔注射左旋一叶萩碱，配制方法见实施例3。分别于给药前（0 min）和给药后1.5、5、9、15、30、60、120、240、480 min这10个时间点（每个时间点3只鼠）摘眼球取血并取脑组织。血样离心（4 ℃，3000 rpm，8 min），分离血浆。
取小鼠血浆100 μL，加入600 μL含内标化合物的乙腈（internal standard，IS）溶液，涡旋振荡5 min，于4 ℃、15000 rpm离心15 min，取上清液，用真空浓缩仪挥干后（40℃，4 h），加入100 μL 50%甲醇复溶，涡旋3 min，超声5 min，再涡旋1 min，然后 15000 rpm离心15 min，取上清进LC/MS分析。
脑组织用生理盐水冲洗表面血污后，吸干水分，精密称重，按质量（g）与体积（mL）比为1:2加生理盐水，匀浆。取脑匀浆样品200 μL，分别加入1200 μL含内标化合物的乙腈溶液，涡旋5 min，于4 ℃、15000 rpm离心15 min，取上清液用真空浓缩仪挥干，100 μL 50%甲醇复溶，同上处理然后进LC/MS分析。
色谱条件：采用Waters ACQUITY QTOF四级杆串联时间飞行质谱对左旋一叶萩碱及内标物进行有效分离，柱温设为40℃，样品室温度5℃，流动相采用纯水和乙腈，水中包含0.1%甲酸。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.7 µm, 2.1 mm ×100 mm)反向色谱柱；时间：6 min；进样量：5 μL（具体条件见下表）。
质谱条件：正离子扫描模式，电喷雾电离源，离子源温度60℃；离子喷雾电压3000V；扫描范围：100–500 Da; (+)-SE的离子对 [M+H+]为218.12。根据各受试小鼠给药后各个时间点采集的血浆和脑部峰面积，通过各个化合物的血或者脑部相应的标准曲线计算各个时间点的血浆或者脑部的浓度，运用非房室模型法计算各主要药物动力学参数，通过WinNonlin version 6.3 (Pharsight, Mountain View, CA, USA)软件分析半衰期等参数。
结果：左旋一叶萩碱可以快速以原型入血和入脑，达峰时间分别为9分钟和30分钟，消除时间为4小时（表3和图1）。
表3. 左旋一叶萩碱腹腔注射给药后入血和入脑的药物动力学结果
实施例6：左旋一叶萩碱对于强迫游泳模型诱导的急性抑郁发作的治疗作用
目的：评价左旋一叶萩碱的抗急性抑郁作用
方法：
1)C57BL/6J（6-7周）雄性小鼠安置在12小时亮（8:00至20:00）、12小时暗循环（20:00至次日8:00）、相对湿度60–70%的动物房，自由取水取食。适应性的饲养一周后（7-8周），开始实验。
2)小鼠提前放置于行为学实验房间适应1 小时以上。
3)腹腔注射单次给药或口服给药：左旋一叶萩碱[(-)-SE]注射给药剂量为3.75mg/kg或7.5 mg/kg，口服给药剂量为10 mg/kg和30 mg/kg。药物配制方法如下：将左旋一叶萩碱完全溶解于DMSO中，浓度分别为37.5 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/kg和300 mg/kg，取1体积的DMSO，加入1体积的Tween-80充分混匀，接着加入98体积的生理盐水充分混匀，得到的浓度分别为0.375 mg/mL、0.75 mg/mL、1 mg/kg和3 mg/kg的溶液，注射或口服的体积为每10 g体重0.1 mL。空白组给予1% DMSO、1% Tween-80和98% 的生理盐水作为溶剂对照。每次给药前新鲜配制。每组设15只小鼠。给药30 min或90 min后进行强迫游泳实验。
4)打开录像机（角度为侧面拍射），将小鼠置于直径15 cm, 高25 cm, 水深13 cm（此时小鼠后爪够不到底部）的有机玻璃缸中, 水温为（25±1℃）。全程录像6 min，后4分钟小鼠的不动时间表示小鼠的抑郁（绝望）情绪水平。完成实验的小鼠用纸擦干身体，***麻醉后立即取脑，存放在-80℃以备后续的病理实验。下一只小鼠实验前清洗玻璃缸并换水。
5)通过ForcedSwim Version 2.0 (Clever Sys Inc.)软件分析视频中最后4 分钟的小鼠不动时间。
结果：左旋一叶萩碱在7.5 mg/kg的剂量单次腹腔给药30 min或90 min后，均表现出抗抑郁作用，而3.75 mg/kg的剂量在给药90 min后也具有抗抑郁作用（图1）。同时取抑郁组和抑郁给药组的脑组织进行分析，发现给药后mTOR通路被显著激活，神经突触中重要的功能蛋白PSD-95的表达也上调，说明神经突触功能提高（图2）。此外，口服给药在30 mg/kg的剂量下（给药时间为3小时），也表现出抗抑郁效果（图3）。
图2显示左旋一叶萩碱降低小鼠在强迫游泳模型中产生的急性抑郁水平：腹腔给药左旋一叶萩碱30 min（A）或90 min（B）后，强迫游泳实验中的不动时间结果。每组实验15只小鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA；*p <0.05，** p <0.01。
图3显示左旋一叶萩碱激活小鼠脑中的AKT-mTOR-S6K、ERK以及p38通路，其中（A）左旋一叶萩碱腹腔注射给药90 min后，取前脑部位（主要为脑皮层和海马）匀浆后进行Western blot实验，检测各个信号通路的响应。（B-G）不同信号通路蛋白变化的统计结果；结果为6组样品的平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA；*p <0.01，***p <0.001。
图4显示口服左旋一叶萩碱的抗急性抑郁作用：口服左旋一叶萩碱3小时后，强迫游泳不动时间的统计结果。每组15只鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA，*p <0.05。
实施例7：左旋一叶萩碱对慢性抑郁模型小鼠的治疗作用
目的：评价左旋一叶萩碱的抗慢性抑郁作用
方法：
1)C57BL/6J（6-7周）雄性小鼠安置在12小时亮（8:00至20:00）、12小时暗循环（20:00至次日8:00）、相对湿度60–70%的动物房，自由取水取食。适应性的饲养一周后（7–8周），开始实验。
2)慢性抑郁造模方法如下：小鼠依次给予下表所示的应激方式，每天应激种类为两种，持续30天。造模期间每5天称重一次，并在第15天和第30天通过糖水偏好实验检测小鼠的抑郁水平。
慢性抑郁造模所采用的应激方式
3)小鼠分为正常对照组、抑郁模型+DMSO溶剂单次给药组、抑郁模型+左旋一叶萩碱单次给药组、抑郁模型+DMSO多次给药组、抑郁模型+左旋一叶萩碱多次给药组，每组15只。单次给药组于造模结束后第二天给药，给药90 min后检测抑郁指标；多次给药组于造模第16天开始给药，每天一次，持续15天至造模结束；第二天检测抑郁指标。给药方式均为腹腔注射，左旋一叶萩碱给药剂量为7.5 mg/kg，配制方法见实施例6。
4)抑郁指标的评价实验包括：强迫游泳实验、糖水偏好实验、mTOR通路、PSD-95表达水平的检测。
结果：单次和多次给药组均表现出抗抑郁作用，包括强迫游泳实验中不动时间减少、糖水偏好实验中糖水摄入增加、血清中皮质酮水平下降，并且增加mTOR通路激活和PSD-95表达水平（图5）。
图5显示左旋一叶萩碱对慢性抑郁模型小鼠的治疗作用：慢性抑郁模型小鼠给药左旋一叶萩碱后，测试糖水偏好（A）、强迫游泳（B）、血清中皮质酮水平（C）、mTOR通路激活（D）、以及PSD95表达（E）。结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA，**p <0.01，***p<0.001，抑郁模型+DMSO组 vs 正常鼠组；#p <0.05，##p <0.01，###p <0.001，抑郁模型+左旋一叶萩碱组 vs 抑郁模型+DMSO组；&&，抑郁模型+单次左旋一叶萩碱组 vs 抑郁模型+多次左旋一叶萩碱组。
实施例8：左旋一叶萩碱未对小鼠的自主运动行为产生毒副作用
目的：左旋一叶萩碱的毒副作用评价
方法：
C57BL/6J（7–8周）雄性小鼠于实验房间适应（温度为23–25℃）1小时后，腹腔给予左旋一叶萩碱在3.75 mg/kg或7.5 mg/kg，药物配置方法如实施例6所述。单次给药30 min后，采取旷场实验（Open field）对小鼠的自主行为进行评价，步骤如下：
1）旷场为40 × 40 × 40 cm的不透明聚丙烯材质（Polypropylene）的顶部开口实验箱，将老鼠从笼子取出，在箱子中心放入，顶部拍摄开始计时，用视频系统记录30 min；
2）用TopScan Version 3.0（Clever Sys Inc.）软件分析小鼠运动轨迹、速率、在中央区域（面积50%）和四周区域停留时间，进行数据统计。
结果：左旋一叶萩碱给药（3.75 mg/kg或7.5 mg/kg）后小鼠的运动距离、速率、在中心和四周的停留时间均无异常，说明这两个剂量对于小鼠的自主运动行为无毒副作用（图6）。
图6显示左旋一叶萩碱未对小鼠的自主运动行为产生毒副作用：左旋一叶萩碱给药30 min后，测试小鼠在旷场中运动的各项指标：（A）中心区域停留时间；（B）外周区域停留时间；（C）中心区域运动距离；（D）外周区域运动距离；（E）总运动距离；（F）中心区域运动速度；（G）外周区域运动速度；（H）总运动速度。各项指标均无统计学差异。每组15只小鼠，结果为平均值每组15只鼠，结果为平均值±SEM，统计方法为one-way ANOVA。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。