具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针及其制备方法、应用
阅读说明：本技术 具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针及其制备方法、应用 (Water-soluble fluorescent probe with aggregation-induced emission characteristic and preparation method and application thereof ) 是由 陈杜刚 冯杨振 闫志国 余响林 李婉青 梁文杰 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针及其制备方法、应用。首先利用化合物1与4-吡啶硼酸频哪醇酯在有机溶剂中于65-120℃下催化反应得到化合物2,化合物2与碘甲烷在有机溶剂中于25-80℃下反应得到化合物3,化合物3与三溴化硼在有机溶剂中于20-40℃下反应得到目标产物。本发明方法具有原料易得、合成工艺简单、收率较高等优点,实验证明制得的荧光探针可以用于线粒体内粘度的监测,并且具有高选择性、高灵敏度响应、高抗干扰性、高成像对比度等优点。(The invention relates to a water-soluble fluorescent probe with aggregation-induced emission characteristics, and a preparation method and application thereof. Firstly, a compound 1 and 4-pyridine boronic acid pinacol ester are subjected to catalytic reaction in an organic solvent at 65-120 ℃ to obtain a compound 2, the compound 2 and methyl iodide are subjected to reaction in the organic solvent at 25-80 ℃ to obtain a compound 3, and the compound 3 and boron tribromide are subjected to reaction in the organic solvent at 20-40 ℃ to obtain a target product. The method has the advantages of easily obtained raw materials, simple synthesis process, high yield and the like, and experiments prove that the prepared fluorescent probe can be used for monitoring the viscosity in mitochondria and has the advantages of high selectivity, high sensitivity response, high anti-interference performance, high imaging contrast ratio and the like.)
技术领域
本发明涉及有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体是细胞的动力房，其在信号转导、细胞分化、凋亡、钙调节等方面发挥着重要作用，而这些功能都与线粒体粘度的波动密切相关。线粒体粘度的变化会进一步影响许多细胞的生理活动过程，如膜融合、代谢物扩散、蛋白质聚集、信号转导等。据报道，细胞内粘度异常往往与阿尔茨海默症、糖尿病、动脉粥样硬化以及高血压等疾病有关联，因此通过检测细胞内粘度可以有效诊断某些疾病。然而，由于细胞内环境十分复杂，选择性的对粘度进行实时原位检测仍然是一个巨大的挑战。所以开发出对线粒体具有靶向作用且能特异性的对粘度进行响应的探针工具非常有意义，将为揭示粘度在相关疾病中扮演的化学与生物学作用提供依据。
传统的粘度测量手段主要包括毛细管粘度计、旋转粘度计、落球粘度计，这些方法只能用于宏观领域，不能在细胞水平对粘度进行监测。荧光探针具有灵敏度高、时空分辨率好、可视化、无损伤检测等优势，已广泛用于生物体内各种组分的选择性成像。通过理性的分子设计，可以开发出对细胞内乃至特定细胞器内粘度有选择性响应的探针工具。
近年来，具有聚集诱导发光(AIE)特性的荧光分子因其优异的光稳定性、大斯托克斯位移和高成像对比度而受到广泛关注。基于分子内运动受限的机制，当细胞内粘度增大时，分子内的转动、振动等非辐射跃迁会受到抑制，从而使其荧光增强实现对粘度的响应。然而常规的AIE型荧光探针是疏水性的，在生理环境中发生聚集也会导致荧光增强，这将对粘度的检测产生严重干扰。因此，设计出在细胞环境中具有优异水溶性且不受聚集影响、只对粘度有特异性响应的AIE分子，并将其用于粘度的监测具有重要意义。
检索发现，中国专利CN108516950B公开了一种基于四苯乙烯的靶向线粒体粘度荧光探针Mito-AIE1和Mito-AIE2，该方案虽然解决了AIE型探针的水溶性问题，但是依然存在抗干扰能力不强和检测灵敏度不够等问题。分析可知该荧光探针分子通过“碳碳双键”将强受体吡啶盐或者吲哚盐基团与四苯乙烯相连，而此处的双键容易与活性氧(如次氯酸)和亲核试剂(如硫离子)反应导致探针的荧光发生变化，使其在细胞中应用时很容易受到活性氧和亲核组分的干扰。当溶液的粘度从1.4cP增加到563.6cP时，上述两个探针的荧光开启倍数分别为38倍和6倍，还有较大的提高空间。
针对现有技术中水溶性AIE型粘度荧光探针抗干扰能力不强、成像灵敏度不高的问题，本发明研发了一种新型分子结构的荧光探针。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针，其分子结构如式(I)所示：
本发明的第二重目的在于提供上述具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
(a)在有机溶剂I、催化剂I、添加剂I的参与下，化合物1与4-吡啶硼酸频哪醇酯反应，得到化合物2
(b)在有机溶剂II参与下，化合物2与碘甲烷反应，得到化合物3
(c)在有机溶剂III参与下，化合物3与三溴化硼反应，得到式(I)化合物
进一步的，步骤(a)中所述有机溶剂I选自甲苯、四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种，优选为四氢呋喃；所述催化剂I选自四(三苯基膦)钯、二(三苯基膦)氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯中的至少一种，优选为四(三苯基膦)钯；所述添加剂I选自碳酸钾水溶液、碳酸钠水溶液、磷酸钾水溶液、四乙基氢氧化铵水溶液中的至少一种，优选为碳酸钾水溶液。反应所需添加剂为碱溶液，必须和钯催化剂配套使用，反应才能顺利进行。
进一步的，步骤(a)中化合物1与4-吡啶硼酸频哪醇酯、催化剂I、添加剂I的摩尔比为1:(1-2)：(0.01-0.1)：(3-10)。
进一步的，步骤(a)中在保护气氛下将化合物1和4-吡啶硼酸频哪醇酯溶于有机溶剂Ⅰ中，再加入催化剂Ⅰ和添加剂I搅拌均匀，所得混合物升温至65-120℃搅拌反应12-24h，最后萃取分液得到有机相，将有机相干燥后通过硅胶柱层析分离得到化合物2，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v，4/1)。
进一步的，步骤(b)所述有机溶剂II选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醇、甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种，优选为N,N-二甲基甲酰胺。
进一步的，步骤(b)中化合物2与碘甲烷的摩尔比为1：(1-5)。
进一步的，步骤(b)中在保护气氛下将化合物2溶于有机溶剂Ⅱ中，再缓慢加入碘甲烷，接着避光升温至25-80℃搅拌反应2-6h，最后通过硅胶柱层析分离得到化合物3，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(v/v，15/1)。
进一步的，步骤(c)所述有机溶剂Ⅲ选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、甲苯中的至少一种，优选为二氯甲烷。
进一步的，步骤(c)中化合物3与三溴化硼的摩尔比为1：(1-5)。
进一步的，步骤(c)中在保护气氛下将化合物3、三溴化硼分别溶于有机溶剂Ⅲ中，得到化合物3溶液、三溴化硼溶液；将化合物3溶液置于冰水浴中，向其中加入三溴化硼溶液，所得混合物加热至20-40℃搅拌反应12-24h，最后重结晶提纯分离出式(I)化合物，重结晶所使用的溶剂为二氯甲烷/正己烷(v/v，2/1)。
本发明的第三重目的在于提供一种利用上述水溶性荧光探针通过荧光成像的方式在监测细胞内(尤其是线粒体内)粘度变化方面的应用。
本发明的水溶性荧光探针分子基于四苯乙烯骨架，拥有以酚羟基作为电子给体(D)、吡啶盐作为电子受体(A)的D-π-A型结构。与以CN108516950B为代表的现有技术相比，本发明的分子设计策略具有如下优势：(1)水溶性好，分子结构更简单，合成更容易，总收率更高；(2)受体吡啶盐通过单键连入分子中，而不是常见的碳碳双键，彻底避免了生物环境中亲核组分和活性氧组分对探针分子结构的破坏，极大的提高了探针的抗干扰能力；(3)当溶液粘度从1.4cP增加到563.6cP时，荧光增强了128倍，成像的灵敏度显著增加。
综合来看，本发明从荧光基团、水溶性、化学稳定性和粘度响应等多方面同时着手合理构建探针分子，并将其应用于线粒体内粘度的荧光成像，具有成像对比度高、抗干扰能力强、灵敏度高等优势。
附图说明
图1为实施例1中式(I)化合物的核磁氢谱图。
图2为实施例1中式(I)化合物的质谱图。
图3为实施例1中式(I)化合物随溶液粘度变化的荧光光谱图。
图4为实施例1中式(I)化合物在磷酸盐缓冲溶液中的溶解度测试图。
图5为实施例I中式(I)化合物的抗干扰能力测试。
图6为实施例1中式(I)化合物对线粒体的共定位实验染色图。
图7为实施例1中式(I)化合物对粘度的细胞成像图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例及附图进行进一步说明。
本发明所有原料如无特殊说明均为普通市售，相关生物实验严格遵守了有关法律法规的要求。
实施例1
本实施例合成式(I)所述目标荧光探针的反应过程如下图所示
(1)化合物2的合成
在氩气保护下，将化合物1(1.50g，3.40mmol)、4-吡啶硼酸频哪醇酯(0.84g，4.08mmol)溶于干燥的四氢呋喃(30mL)中，再加入四(三苯基膦)钯(用量相当于化合物1摩尔数的5％)和K2CO3水溶液(8mL，2M)。将混合物加热至70℃后保温搅拌反应20h。反应完冷却至室温，加水萃取分液，收集有机相并用无水Na2SO4干燥，浓缩后将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(v/v，4/1)作为洗脱剂，得到化合物2(1.08g)，收率73％。
(2)化合物3的合成
在氩气保护下，将化合物2(1.00g，2.28mmol)、碘甲烷(0.97g，6.84mmol)溶于干燥的乙腈(15mL)中。避光条件下将混合物加热至80℃保温搅拌反应6h。反应完冷却至室温，直接浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v，15/1)作为洗脱剂，得到化合物3(1.17g)，收率89％。
(3)式(I)化合物的合成
在氩气保护下，将化合物3(0.50g，0.85mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，另将三溴化硼(0.86g，3.40mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中。将化合物3的二氯甲烷溶液置于冰水浴中，缓慢滴入三溴化硼的二氯甲烷溶液，室温下(25℃)搅拌反应12h。反应完将混合物直接浓缩，用二氯甲烷/正己烷(v/v，2/1)进行重结晶，得到式(I)化合物(0.27g)，收率46％。
式(I)化合物的核磁氢谱图、质谱图分别如图1-2所示。谱图结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ[ppm]:9.46(d,J＝12Hz,1H),8.95(t,J＝12Hz,2H),8.43(dd,J＝16Hz,2H),7.90(dd,J＝28Hz,2H),7.25-7.08(m,8H),7.07-6.94(m,4H),6.82(d,J＝8Hz,1H),6.76(d,J＝8Hz,1H),6.54(dd,J＝24Hz,2H),4.30(d,J＝4Hz,3H)。HRMS for C32H26NO+m/z:[M-I-]+Calcd:440.2009；Found:440.2002。上述核磁氢谱、碳谱和质谱数据证实了按照上述方法，确实合成了具有式(I)结构的目标产物。
参照实施例1的方法，通过改变反应条件(如表1所述)进行了实施例2-6。
表2实施例2-6不同反应条件结果对照表
为了进一步了解本发明制得的式(I)结构荧光探针的性能，以实施例1的产物为例进行了以下实验。
(1)荧光探针的粘度响应测试、水溶性测试和抗干扰能力测试
将实施例1制得的荧光探针溶于二甲基亚砜中，配制成1mM的测试母液待用。用不同甘油含量的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.40)模拟溶剂粘度的变化，所配溶剂中甘油的含量分别为：0，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％和99％。向不同粘度的溶剂中加入探针母液，配制出探针浓度为10μM的测试液。分别检测测试液的荧光光谱，结果如图3所示。由图3可知，探针的荧光强度随着溶剂粘度的增加而逐渐增强，且611nm处荧光强度的对数值与溶剂粘度的对数值成线性关系。
在PBS中测试了不同浓度探针的荧光图谱，结果如图4所示。探针浓度在0-40μM范围内时，荧光强度与浓度呈线性关系，这说明探针在PBS中水溶性很好，没有发生聚集。
向探针的PBS/甘油(v/v，4/6)混合溶液中，分别加入各种干扰组分(SO3 2-、S2-、GSH、H2O2、ONOO-、ClO-)，然后测试探针的荧光图谱，结果如图5所示(1：Control，无干扰组分；2：SO3 2-；3：S2-；4：GSH；5：H2O2；6：ONOO-；7：ClO-)。从图中可以看出，这些组分对探针的荧光都没有影响。
(2)荧光探针的线粒体共定位成像
取适当密度的人正常肝细胞LO2接种到灭菌的培养皿中，将该细胞分别用细胞核染料DAPI(5μM)、荧光探针(10μM)以及商业化的线粒体染色剂Mito-Tracker Green(5μM)进行共染色实验，然后在激光共聚焦扫描显微镜下观察，结果如图6所示。
图6中，A为蓝色通道的细胞成像图，只有细胞核被染色，说明此时细胞状态良好；B为Mito-Tracker Green在绿色通道的细胞成像图；C为本发明荧光探针在红色通道的细胞成像图；D为A、B、C的叠加图。由图6可知，探针的红色荧光与Mito-Tracker Green的绿色荧光高度重合，这说明本实施例1制得的荧光探针能精确定位在细胞的线粒体内，可以用来检测线粒体中的粘度变化。
(3)式I荧光探针对粘度的细胞成像
取适当密度的人正常肝细胞LO2接种到灭菌的培养皿中，随机分成5组。第一组为控制组，不做任何处理；第二组用荧光探针(10μM)孵育30min；第三组先用莫能菌素(Monensin，10μM)培养60min，再加入荧光探针(10μM)孵育30min；第四组先加入制霉菌素(Nystatin，10μM)培养60min，再加入荧光探针(10μM)孵育30min；第五组先加入3％的酒精培养60min，再加入荧光探针(10μM)孵育30min。将5组细胞分别放到激光共聚焦显微镜下观察成像情况，结果如图7所示。
从图7中可以看出，只用探针孵育的细胞发出微弱的荧光；而将细胞用莫能菌素、制霉菌素、乙醇进行培养，以刺激线粒体内粘度增加，再用荧光探针培养后，发出强烈的红色荧光。这说明实施例1制得的荧光探针确实能用于探测细胞内粘度的变化。
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