具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

实施例1：配体H-L^c的制备

在100mL圆底烧瓶中加入2-乙酰基吡啶(2.24mL，20mmol)、3-溴水杨醛(2.01g，10mmol)，量取50mL乙醇加入到圆底烧瓶中，摇匀，再量取0.75mL浓度为25％的氨水加入的氨水约为10mmol)加入其中，称取氢氧化钾0.14g小心加入到圆底烧瓶中(氢氧化钾溶解搅拌均匀后体系的pH在12～13之间)，放入磁子，安装好回流反应装置后，在40℃水浴下反应24小时(起初溶液为淡褐色，随着反应的进行有浅黄色固体产生)。反应结束后，将圆底烧瓶取下，进行旋蒸，将瓶内溶剂蒸出一半，之后进行抽滤，收集滤饼，用乙醇洗涤，干燥，得浅黄色粉末状固体。产率为92.3％(3.72g，基于3-溴水杨醛为基准计算)。

对本实施例所得产物进行表征：

(1)高分辨质谱：ESI–MS m/z:405.4[M+H]⁺，其中M为配体H-L^a的分子量。

(2)核磁氢谱：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):

δ15.71(s,1H),9.08(d,J＝1.3Hz,1H),8.90(d,J＝1.2Hz,1H),8.86–8.84(m,2H),8.49(d,J＝8.2Hz,1H),8.37(d,J＝6.9Hz,1H),8.23(d,J＝7.9Hz,1H),8.13(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),8.09–8.05(m,1H),7.72–7.69(m,1H),7.61–7.57(m,2H),6.96(d,J＝7.9Hz,1H)。

(3)核磁碳谱：¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆):

δ156.98,156.41,153.60,153.52,153.14,150.52,150.50,149.71,138.49,138.20,135.27,127.50,125.49,125.47,122.52,121.12,120.42,120.33,117.75,117.57,111.92.

(4)元素分析(C₂₁H₁₄BrN₃O):

计算值(％)：C62.39，H3.49，N10.39。

实测值(％)：C 62.36，H 3.55，N10.37。

(5)红外光谱：Selected IR(KBr,cm^–1):

3491,3054,3013,1563,1470,1392,1226,1177,1078,795。

由此，可以确定本实施例所得浅黄色粉末状固体为目标产物配体H-L^c。

对比例1-1

重复实施例1，不同的是，在加入氢氧化钾之前不加氨水。

结果没有得到浅黄色粉末状固体。

实施例2：配体H-L^c的制备

重复实施例1，不同的是，用甲醇代替乙醇，用氢氧化钠代替氢氧化钾，控制氢氧化钠的加入量为调节体系的pH＝12，反应在50℃水浴下进行。

结果得到浅黄色粉末状固体。产率为90.6％(基于3-溴水杨醛为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、核磁表征、元素分析及红外分析，确定所得的浅黄色粉末状固体为目标产物配体H-L^c。

实施例3：配体H-L^d的制备

重复实施例1，不同的是，用5-溴水杨醛代替3-溴水杨醛。

结果得到浅黄色粉末状固体3.67g。产率为91.1％(基于5-溴水杨醛为基准计算)。

对本实施例所得产物进行表征：

(1)高分辨质谱：ESI–MS m/z:404.04[M+H]⁺，其中M为配体H-L^d的分子量。

(2)核磁氢谱：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：

δ10.31(s,1H),8.74(ddd,J＝4.8,1.8,0.9Hz,2H),8.68(t,J＝1.1Hz,1H),8.66(d,J＝1.1Hz,1H),8.65(s,2H),8.03(td,J＝7.7,1.8Hz,2H),7.65(d,J＝2.5Hz,1H),7.54–7.51(m,2H),7.50(dd,J＝3.3,1.8Hz,1H),7.03(dd,J＝8.7,3.0Hz,1H)。

(3)核磁碳谱：¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)：

δ155.55,155.39,154.71,154.54,149.81,147.25,147.22,137.91,133.23,132.51,127.85,124.90,121.32,121.12,119.11,111.29,111.23。

(4)元素分析(C₂₁H₁₄BrN₃O):

计算值(％)：C62.39，H3.49，N10.39。

实测值(％)：C62.37，H 3.57，N10.34。

(5)红外光谱：SelectedIR(KBr,cm^–1):

3545,3049,3012,1585,1567,1471,1385,1282,1256,1239,790。

由此，可以确定本实施例所得浅黄色粉末状固体为目标产物配体H-L^d。

对比例3-1

重复实施例3，不同的是，在加入氢氧化钾之前不加氨水。

结果没有得到浅黄色粉末状固体。

实施例4：配体H-L^d的制备

重复实施例3，不同的是，用正丙醇代替乙醇，氨水的加入量改为2mL，控制氢氧化钾的加入量为调节体系的pH＝13，反应在35℃水浴下进行，反应时间改为48小时。

结果得到浅黄色粉末状固体。产率为84.3％(基于5-溴水杨醛为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、核磁表征、元素分析及红外分析，确定所得的浅黄色粉末状固体为目标产物配体H-L^d。

实施例5：配体H-L^d的制备

重复实施例3，不同的是，用正丁醇代替乙醇，反应在25℃室温下进行，反应时间改为72小时。

结果得到浅黄色粉末状固体。产率为80.2％(基于5-溴水杨醛为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、核磁表征、元素分析及红外分析，确定所得的浅黄色粉末状固体为目标产物配体H-L^d。

实施例6：式(II)所示三联吡啶铜配合物[Cu(H-L^c)Cl]ClO₄(即配合物5)的制备

称取10mg(0.025mmol)配体H-L^c和10mg(0.027mmol)Cu(ClO₄)₂·6H₂O于一端闭合的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加0.05mL氯仿和0.6mL甲醇(氯仿和甲醇的体积比为1：12)，将玻璃管开口端熔封后置于50℃的烘箱中反应72小时。反应结束后梯度降温至室温，可观察到管内有蓝色块状晶体生成，收集晶体，干燥。产率为65.9％(9.84mg，基于配体H-L^c为基准计算)。

挑选出大小、形状适合的单晶，采用单晶X-射线衍射分析等方法确定其结构，具体表征数据如下：

(1)高分辨质谱：ESI–MS m/z:542.8[M-CH₃CN-H₂O+H]⁺，其中M为配合物5的分子量。

(2)元素分析(C₂₁H₁₄BrCl₂CuN₃O₅):

计算值(％)：C 41.85，H 2.34，N 6.97；

实测值(％)：C 41.83，H 2.39，N 6.96.

(3)红外分析Selected IR(KBr,cm^–1):

ν(O-H)3396(m)；ν(Ar-H)3081(m)；ν(C-O)1235(m)；ν(C-Br)737(m).

(4)单晶X-射线衍射分析：

选取尺寸适中的蓝色块状晶体置于安捷伦SuperNova X-射线单晶衍射仪上，采用经石墨单色器单色化的Mo-K_α 射线作为光源进行单晶结构测定。本实施例所得产物的初始晶体结构均采用SHELXS-97直接法解出，衍射数据经LP因子和经验吸收校正，对全部非氢原子坐标及其各向异性热参数进行全矩阵最小二乘法精修，所有氢原子坐标由理论计算确定。所得晶体学和结构精修数据如下述表1所示，部分键长键角数据分别如下述表2所示，所得蓝色块状晶体的晶体结构如图1所示，平面结构如下述式(II)所示。因此，确定所得的蓝色块状晶体为本发明目标产物式(II)所示三联吡啶铜配合物[Cu(H-L^c)Cl]ClO₄，即配合物5。

表1配合物5和7的晶体学和结构修正数据

^aR₁＝Σ||F_o|–|F_c||/Σ|F_o|；^bωR₂＝[Σw(F_o ²–F_c ²)²/Σw(F_o ²)²]^0.5.

表2配合物5和7的部分键长和键角[°]

单晶X-射线衍射分析结果表明：配合物5属于单斜晶系,P2₁/n空间群，配合物5由阳离子[Cu(H-L^c)(Cl)]⁺和阴离子ClO₄ ^-组成。阳离子[Cu(H-L^c)(Cl)]⁺的中心Cu(Ⅱ)离子与一个氯离子以及来自配体H-L^c的三个N原子配位，形成四配位平面四边形几何构型。

实施例6-1

重复实施例6，不同的是，滴加0.05mL氯仿和0.55mL甲醇(氯仿和甲醇的体积比为1：11)。

结果没有目标产物的晶体或沉淀生成。

实施例6-2

重复实施例6，不同的是，滴加0.05mL氯仿和0.65mL甲醇(氯仿和甲醇的体积比为1：11)。

结果没有目标产物的晶体或沉淀生成。

实施例6-3

重复实施例6，不同的是，将混合溶剂改为甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、DMF或DMSO等单一的溶剂。结果没有目标产物的晶体或沉淀生成。

对比例6-4

重复实施例6，不同的是，将混合溶剂中的甲醇用乙醇、乙腈、DMF或DMSO替代，或者是将混合溶剂中的氯仿用丙酮、DMF或DMSO等替代。结果均没有目标产物的晶体或沉淀生成。

实施例7：配合物5的制备

重复实施例6，不同的是，滴加0.05mL二氯甲烷和0.575mL甲醇(二氯甲烷和甲醇的体积比为1：11.5)，反应改在40℃水浴下进行，反应时间改为96小时。

结果得到蓝色块状晶体。产率58.7％(8.76mg，基于配体H-L^c为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、元素分析、红外分析及单晶衍射分析，确定所得的蓝色块状晶体为本发明目标产物配合物5。

实施例8：配合物5的制备

重复实施例6，不同的是，滴加0.05mL氯仿和0.62mL甲醇(氯仿和甲醇的体积比为1：12.4)。

结果得到蓝色块状晶体。产率63.7％(9.51mg，基于配体H-L^c为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、元素分析、红外分析及单晶衍射分析，确定所得的蓝色块状晶体为本发明目标产物配合物5。

实施例9：配合物5的制备

重复实施例6，不同的是，反应改在60℃水浴下进行。

结果得到蓝色块状晶体。产率71.8％(10.07mg，基于配体H-L^c为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、元素分析、红外分析及单晶衍射分析，确定所得的蓝色块状晶体为本发明目标产物配合物5。

实施例10：式(III)所示三联吡啶铜配合物[Cu(H-L^d)(CH₃OH)(DMSO)](Cl O₄)₂(即配合物7)的制备

称取10mg(0.025mmol)配体H-L^d和10mg(0.027mmol)Cu(ClO₄)₂.6H₂O于一端闭合的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加0.02mL DMSO和0.5mL甲醇(DMSO和甲醇的体积比为1：25)，将玻璃管开口端熔封后置于65℃的烘箱中反应72小时。反应结束后梯度降温至室温，可观察到管内有蓝色条状晶体生成，收集晶体，干燥。产率为61.8％(11.9mg，基于配体H-L^d为基准计算)。

挑选出大小、形状适合的单晶，采用单晶X-射线衍射分析等方法确定其结构，具体表征数据如下：

(1)高分辨质谱：ESI–MS m/z:502.3[M-DMSO-(ClO₄)₂+H]⁺，其中M为配合物7的分子量。

(2)元素分析(C₂₄H₂₃BrCl₂CuN₃O₁₁S):

计算值(％):C 37.15，H 2.99，N 5.42。

实测值(％):C 37.12，H 3.06，N 5.40。

(3)红外分析Selected IR(KBr,cm^–1):

ν(O-H)3481(m)；ν(Ar-H)3063(m)；ν(C-O)1239(s)；ν(C-Br)788(s)。

(4)单晶X-射线衍射分析：

选取尺寸适中的蓝色条状晶体置于安捷伦SuperNova X-射线单晶衍射仪上，采用经石墨单色器单色化的Mo-K_α 射线作为光源进行单晶结构测定。本实施例所得产物的初始晶体结构均采用SHELXS-97直接法解出，衍射数据经LP因子和经验吸收校正，对全部非氢原子坐标及其各向异性热参数进行全矩阵最小二乘法精修，所有氢原子坐标由理论计算确定。所得晶体学和结构精修数据如上述表1所示，部分键长键角数据分别如上述表2所示，所得蓝色条状晶体的晶体结构如图2所示，平面结构如下述式(III)所示。因此，确定所得的蓝色条状晶体为本发明目标产物式(III)所示三联吡啶铜配合物[Cu(H-L^d)(CH₃OH)(DMSO)](ClO₄)₂，即配合物7。

单晶X-射线衍射分析结果表明：配合物7属于单斜晶系,P2₁/c空间群，中心铜(Ⅱ)离子与一个甲醇分子中的O原子、一个DMSO分子中的S原子以及来自配体H-L^d的三个N原子配位，形成五配位扭曲四方锥几何构型。整个配离子呈+2价，外界有2个ClO₄ ^-作为抗衡阴离子。

对比例10-1

重复实施例10，不同的是，滴加0.02mL DMSO和0.48mL甲醇(DMSO和甲醇的体积比为1：24)。

结果没有目标产物的晶体或沉淀生成。

对比例10-2

重复实施例10，不同的是，滴加0.02mL DMSO和0.52mL甲醇(DMSO和甲醇的体积比为1：26)。

结果没有目标产物的晶体或沉淀生成。

实施例11：配合物7的制备

重复实施例10，不同的是，滴加0.02mL DMSO和0.49mL甲醇(DMSO和甲醇的体积比为1：24.5)，反应改在65℃水浴下进行，反应时间改为24小时。

结果得到蓝色条状晶体。产率58.7％(11.3mg，基于配体H-L^d为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、元素分析、红外分析及单晶衍射分析，确定所得的蓝色条状晶体为本发明目标产物配合物7。

实施例12：配合物7的制备

重复实施例10，不同的是，滴加0.02mL DMSO和0.51mL甲醇(DMSO和甲醇的体积比为1：25.5)，反应改在40℃水浴下进行。

结果得到蓝色条状晶体。产率53.2％(10.2mg，基于配体H-L^d为基准计算)。

对本实施例所得产物进行高分辨质谱分析、元素分析、红外分析及单晶衍射分析，确定所得的蓝色条状晶体为本发明目标产物配合物7。

实验例1：本发明所述配体及配合物稳定性实验

1.1紫外-可见光谱法测定化合物稳定性

申请人应用紫外-可见光谱法来检测所合成化合物在pH 7.35的Tris-HCl缓冲液中的稳定性，为后续的细胞水平实验提供实验基础。

将浓度为2×10^-5mol/L的配体及配合物在pH 7.35的Tris-HCl缓冲液中，置于室温下0和48小时后，分别用紫外光谱仪各测一次吸光度。实验结果显示，各组吸收峰没有发生红移或蓝移现象，也没有新的吸收峰出现，说明本发明所合成的配体及配合物在Tris-HCl缓冲液中能够稳定存在至少48h。

1.2高效液相色谱法(HPLC)测定化合物稳定性及纯度

图3和图4分别是配体H-L^c及其配合物5、H-L^d及其配合物7的高效液相色谱图(所有高效液相色谱图(LC-20AT,SPD-20A HPLCCOLUMN,150mm×5.0μm I.D.，株温：40℃，流动相：methol/H2O(90:10)，流速：1.0Ml/min，进样量：1.50×10^-4M))。液相色谱实验表明：48小时后配体及配合物没有新的峰出现，而且峰的位移几乎没有变化，说明在室温下配体及配合物在DMSO储备液中能稳定存在至少48小时，实验结果与用紫外-可见光谱法测定结果一致，说明化合物具备足够的稳定性。此外，HPLC实验也说明了化合物纯度皆在99％以上，可以进行细胞实验。

实验例2：本发明所述配体及配合物体外抗肿瘤活性研究

2.1实验仪器及试剂，如下述表3所示。

表3实验所用仪器与试剂

2.2细胞株及培养

本例所用细胞株有：MGC80-3胃癌细胞、T-24人膀胱癌细胞、NCI-H460人肺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞、BEL-7402人肝癌细胞、Hep-G2肝癌细胞、SK-OV-3卵巢癌细胞以及HL-7702人正常肝细胞。所有细胞株均在5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养。使用倒置显微镜观察细胞生长状态，待细胞贴壁80～90％后用PBS缓冲液洗涤细胞2次，再用胰蛋白酶消化，取对数生长期的细胞进行实验。

2.3MTT法测定化合物细胞水平的IC₅₀值

①消化细胞，取状态良好的对数生长期细胞于96孔培养板中，每孔180μL(约4500-5000个细胞)；

②待细胞贴壁生长至约2/3的孔面积后，每孔加入20μL的样品，平行设5个复孔，同时设置相应的空白对照组；

③培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mLPBS)；

④孵育4～6h后，将培养液吸弃，每孔加入150μL DMSO，震荡5～8min，使甲瓒结晶充分溶解；

⑤使用酶标仪测定OD值(波长570/630nm)。

对筛选化合物，通常设置5个浓度梯度(20,10,5,2.5,1.25μM)，但对于活性较好的配合物，设置的浓度梯度为(6,3,1.5，0.75，0.375μM)，所有实验均重复3次以上取平均值。对本发明合成的化合物均使用分析纯的DMSO来溶解，顺铂则使用生理盐水来溶解。

2.4结果与讨论

本实验利用Bliss法计算得到了本发明合成的化合物对7种肿瘤细胞株和1种正常细胞株的IC₅₀值(如表4所示，单位:μM)。

表4配体H-L^c和H-L^d及配合物5和7对不同细胞株的IC₅₀值(μM)

由表4可知，配体H-L^c和H-L^d和配合物5和7对所选的肿瘤细胞株的抑制作用均高于顺铂，H-L^c和H-L^d对所选肿瘤细胞株的IC₅₀值都在7μM内，而配合物5和7对所选肿瘤细胞株的IC₅₀值都在3μM内。其中，配合物5和7对BEL-7402人肝癌细胞的抑制作用最高，IC₅₀值分别为0.91±0.14和1.01±0.17，远低于顺铂的IC₅₀值(17.10±0.87μM)。同时，由表4可知配合物5和7对BEL-7402人肝癌细胞的选择性抑制指数分别为3.4、2.8(选择性抑制指数＝正常细胞的IC₅₀/7402的IC₅₀)。因配合物对BEL-7402人肝癌细胞在一定程度上具有选择性抑制作用，因此对配合物5和7进行初步的抗肿瘤机制研究。

实验例3：本发明所述配合物体外抗肿瘤作用机制研究

3.1实验仪器与试剂，如下述表5所示。

表5实验所用仪器及试剂

3.2实验方法

3.2.1流式细胞术检测细胞周期

在肿瘤细胞中，细胞周期与细胞凋亡密切相关。碘化丙啶(PI)可以透过受损的细胞膜，对凋亡细胞的细胞核进行染色，根据荧光的强弱程度来分析细胞内的DNA含量，从而检测细胞周期阻滞的情况。

①消化生长状态良好的对数期细胞，取约2×106个细胞接种于70mm的培养皿中，置于培养箱。

②待细胞贴壁至约2/3皿面积后，加入配置好的样品与细胞共培养48小时，设置空白对照组。

③用PBS洗涤细胞2～3次，胰蛋白酶消化并将所有细胞收集与15mL离心管中。

④1000rpm/min离心10分钟，倒掉上清液，加入PBS洗涤后再离心。

⑤吸除PBS，加入1mLPBS吹匀细胞后，边震荡边加入9mL冷冻后的消毒酒精，放入-20℃过夜。

⑥取出后，1500rpm/min离心10分钟，弃去上清液后再用PBS洗涤。

⑦加入0.5mL RNase A(50μg/mL)，吹匀细胞后，37℃孵育20～30min。

⑧加入20μL PI(50μg/mL)，避光染色后过膜，用流式细胞仪检测细胞周期。

3.2.2蛋白质印迹法(Western Blot)法检测配合物对周期相关蛋白表达的影响

蛋白质印迹法常常被用来检测蛋白质表达水平，基本实验步骤如下：

(1)提取蛋白

①培养、加药及收集细胞的方法参考3.2.1的步骤①、②和③。

②加入适量的裂解液(含PMSF，浓度为1mM)后转移至1.5mL离心管中，置于冰上裂解30min。

③4℃离心15min(13000rpm)，取上清液并分装少量于新的离心管中用于测定蛋白浓度。

④按体积比3：1(上清液：4*SDS-PAGE蛋白上样缓冲液)加入上样缓冲液，混匀后煮沸。

⑤自然冷却后置于-20℃保存。

(2)蛋白定量

按BCA蛋白定量试剂盒处理蛋白样品，在96孔板中加入各种试剂(如表6所示)，37℃孵育30分钟后，用酶标仪测定在波长562nm处的吸光度值，绘制标准曲线并计算样品总蛋白量的相对浓度。

表6 BCA标准曲线制作表

(3)SDS-PAGE电泳

表7分离胶与浓缩胶配制方法

①制胶：按照表7配制分离胶与浓缩胶，用移液枪移取适量体积的分离胶加入夹好的玻璃板中，加入二次水覆盖。待凝固后倒掉上层的水。将浓缩胶灌满玻璃板后插入梳子，凝固后将梳子拔出。

②上样：把制好的胶放入电泳槽，加电泳液，按顺序上样(样品20μg/lane，Marker4μL)。

③电泳：80V、150min，待溴酚蓝即将跑出时停止。

④转膜：剪好PVDF膜，在无水甲醇中活化2min。按海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫的顺序放置，放入转膜槽中，再加入预冷的转膜液。PVDF膜在正极，凝胶在负极，电流250A，时间按照目的蛋白的分子量进行调整。

⑤免疫反应：TBST洗PVDF膜两次，每次5min，转移至封闭液中2h。用TBST洗三次封闭后的膜，用滤纸吸干TBST后将膜放入稀释后的一抗里面，4℃孵育过夜。TBST洗三次后将膜放入稀释后的二抗中室温孵育1h。TBST洗膜三次，每次10min。

⑥化学发光：化学发光液试剂A与试剂B等体积混合，吸取适量的混合液与膜充分接触，曝光1～10min。

⑦凝胶成像与图像分析。

3.2.3流式细胞术检测细胞凋亡

本实验采用Annexin-V-FITC和PI对细胞进行双重染色，通过流式细胞术定量地检测细胞发生凋亡的百分数。实验操作步骤如下：

①消化对数期细胞，接种于六孔板(每孔2mL，约1×106个细胞)；

②待细胞贴壁生长至孔面积的80～90％时，加入化合物与细胞共培养48h。

③收集细胞，PBS洗涤(2次)，离心5min(1200rpm/min)，弃去上清液。

④按凋亡试剂盒说明书对细胞进行染色，应用流式细胞仪检测细胞凋亡。

3.2.4线粒体膜电位(Δψm)的检测

流式细胞术可以检测Δψm的变化，从而分析细胞凋亡的情况。实验过程：

①培养细胞、加药孵育及收集细胞参考3.2.1的第①、②、③步。

②按照线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)说明书对细胞进行染色，应用流式细胞仪检测Δψm的变化。

3.2.5细胞内活性氧(ROS)检测

DCFH-DA荧光探针可检测细胞内活性氧水平的变化，其本身无荧光，但可以被ROS氧化为有荧光的DCF，通过检测细胞内的DCF即可了解细胞内ROS水平的变化。具体实验步骤如下：

①培养细胞及加药的方法参考3.2.1的步骤①、②。

②用无血清的培养基洗细胞2～3遍，往六孔板中加入稀释好的DCFH-DA，每孔1mL，避光染色20min。

③用PBS洗涤细胞2～3遍，再加入1mL无血清的培养基，使用荧光倒置显微镜检测细胞内活性氧水平的变化。

3.2.6细胞内Ca²⁺浓度检测

使用流式细胞仪可以检测细胞内钙离子水平的变化，Ex/Em＝506nm/526nm。操作如下：

①培养细胞、加药孵育及收集细胞参考3.2.1的第①、②、③步。

②按钙离子检验试剂盒说明书对细胞进行染色，应用流式细胞仪检测Ca2+浓度。

3.2.7Caspase-3/9的活性检测

采用CaspGLOWTM Fluorescein Active Caspase-3/9Staining Kit试剂盒来检测Caspase-3/9。简单操作过程如下：

①培养细胞、加药孵育及收集细胞参考4.2.1的第①、②、③步。

②用300μL PBS重悬细胞，加入1μL的Caspase-3/9染液，混匀后37℃避光孵育30min。

③离心3min(1200rpm/min)，除去工作液，用相应的Caspase-3/9Buffer洗涤2～3次。

④离心后重新加入0.5mL的Buffer，过膜后用流式细胞仪检测。

3.2.8Western Blot检测配合物对凋亡相关蛋白表达的影响

实验步骤参考4.2.2。

3.3结果与讨论

3.3.1流式细胞术检测细胞周期

细胞周期是一个参与细胞生长、组织再生、DNA修复和细胞凋亡等事件的高度有序的过程。真核细胞的细胞周期分为两个主要阶段：间期和分裂期，其中，间期主要由由三个阶段组成：G1期(DNA合成前期)，S期(DNA合成期)，G2期(胞有丝分裂准备期)。细胞周期调控需要大量信号的参与，信号缺失则会导致细胞周期阻滞。当癌细胞在外界条件影响下发生周期阻滞时，细胞增殖被抑制，同时也有可能诱导细胞凋亡。

图5是BEL-7402细胞与配合物5(0.45、0.9和1.8μM)孵育48h后的细胞周期分布图。与对照组相比，配合物5作用于BEL-7402细胞后，G1期的细胞由51.31％增至70.48％、72.82％、76.25％，细胞相对含量分别增加了：19.17％、21.51％、24.94％。

图6是BEL-7402细胞与配合物7(0.5、1.0和2.0μM)孵育48h后的细胞周期分布图。与对照组相比，配合物7作用于BEL-7402细胞后，G1期的细胞由51.52％增至67.38％、72.90％、72.21％，G1期的细胞相对含量分别增加了：15.86％、21.38％、20.69％。

3.3.2Western Blot检测配合物对肿瘤细胞周期相关蛋白的影响

为确保细胞周期有序进行，大量的蛋白质参与了细胞周期的调控，细胞周期检查点是保证细胞周期准确无误进行的检查机制。检查点传感器Chk1(checkpoint kinase 1)和Chk2(checkpoint kinase 2)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，也是顶端检查点激酶ATM和ATR的底物。哺乳动物细胞对DNA损伤的主要检查点反应是ATM(ATP)/Chk2(Chk1)-p53-p21通路，它可以诱导长时间甚至是永久性的G1期阻滞。DNA复制检查点(即S期内阶段检查点)在DNA复制异常时被激活，此时效应激酶Chk1使下游的Cdc25A磷酸化，Cdc25A主要在G1-S期过渡期间激活cyclin E-CDK2和cyclin A-CDK2复合物。所以，细胞可以通过Chk1/Cdc25A-CDK2通路来阻止DNA复制，并将细胞阻滞于S期，而当cyclin E/A-CDK2复合物失活时，也会导致细胞被阻滞在G1期。

图7和8分别为Western Blot检测配合物5(0.45、0.9和1.8μM)和7(0.5、1.0和2.0μM)对BEL-7402细胞Chk1、Chk2、Cdc25A、CyclinA、CyclinE、CDK2、P53和P21蛋白的表达情况。与对照组相比，随着配合物的加入，P53和P21蛋白的表达水平上升；而Chk1、Chk2、Cdc25A、CyclinA、CyclinE和CDK2蛋白的表达水平则受到抑制。实验结果表明配合物5和7可以通过抑制cyclin E/A-CDK2复合物的活性来使BEL-7402细胞阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖。该结果与流式细胞术检测的细胞周期实验一致。

3.3.3流式细胞术检测配合物诱导肿瘤细胞凋亡

Annexin-V-FITC是一种荧光探针，可在钙离子存在的情况下与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。当细胞发生早期凋亡时，PS开始由胞内转移到细胞膜外部，此时，Annexin-V可以与外翻的PS结合，可检测细胞的早期凋亡。细胞发生晚期凋亡时，PI(碘化吡啶)可以通过受损的细胞膜进而将DNA染色，可检测细胞的晚期凋亡。因此，本节通过流式细胞术来检测配合物诱导细胞凋亡的百分数。

图9是配合物5(0.45、0.9和1.8μM)作用BEL-7402细胞48h后，细胞凋亡的情况。加入配合物5后，细胞凋亡百分数分别是：17.74％、28.4％和56.4％，与对照组(0.487％)相比，凋亡百分数分别增加了：17.253％、27.91％和55.91％，凋亡百分数随加药量增加而增加。说明配合物5可以诱导BEL-7402细胞产生凋亡。

图10是配合物7(0.5、1.0和2.0μM)作用BEL-7402细胞48h后，细胞凋亡的情况。加入配合物7后，细胞凋亡百分数分别是：14.66％、30.6％和39.9％，与对照组(0.487％)相比，凋亡百分数分别增加了：14.173％、30.11％和39.41％，凋亡百分数随加药量增加而增加。实验说明配合物7可以诱导BEL-7402细胞产生凋亡。

3.3.4线粒体膜电位(Δψm)的检测

线粒体在细胞凋亡过程中发挥了关键作用(比如：影响细胞内ATP水平，Δψm的改变，线粒体膜通透性改变，活性氧的产生等)。线粒体外膜通透化是线粒体介导凋亡通路中的一个重要事件，它通过线粒体将细胞色素c(CYT-c)等促凋亡蛋白释放到细胞质中，CYT-c可以启动caspases依赖通路，从而裂解PARP(poly ADP-ribose polymerase,一种DNA修复酶，是caspases的切割底物)，最终导致细胞凋亡。而线粒体膜电位(Δψm)的破坏在线粒体膜通透性的增加中起着关键作用，被认为是线粒体介导凋亡的先决条件。

图11和12分别是配合物5(0.45、0.9和1.8μM)和7(0.5、1.0和2.0μM)对BEL-7402细胞作用48h后，细胞的细胞线粒体膜电位的变化情况。与对照组(1.88％)相比，BEL-7402细胞的Δψm都下降了：配合物5作用后，下降的百分比分别是：23.9％、32.0％、54.9％；配合物7作用后，下降的百分比分别是：17.9％、27.9％、38.5％；实验结果说明了配合物5和7都可以诱导BEL-7402细胞的Δψm下降，且有可能通过线粒体诱导BEL-7402细胞发生凋亡。

3.3.5配合物对癌细胞内活性氧(ROS)的影响

细胞内活性氧(ROS)水平升高作为氧化应激的信号，也可激活细胞凋亡信号通路。线粒体既是ROS的靶细胞，也是产生更多ROS的来源。一些研究表明，ROS的产生会加剧线粒体膜电位的破坏，然后释放更多的细胞色素c(CYT c)，从而导致caspase-3裂解和最终的细胞凋亡。此外，活性氧可以与嘌呤碱、嘧啶碱和核糖相互作用，可以破坏DNA的单链或双链，激活依赖DNA的蛋白激酶和P53，导致细胞凋亡。

图13和14分别是配合物5(0.45、0.9和1.8μM)和7(0.5、1.0和2.0μM)对BEL-7402细胞作用48h后，细胞内ROS的释放情况。通过荧光倒置显微镜观察发现：与对照组相比，配合物作用后，细胞发出的绿色荧光增强，说明配合物5和7均可引起BEL-7402细胞的ROS水平升高，从而诱导细胞凋亡。

3.3.6钙离子(Ca²⁺)释放的检测

线粒体介导的细胞凋亡的内在机制涉及线粒体及相关的线粒体蛋白，DNA受损或者细胞中的癌基因过表达可以激活这一凋亡途径。同时，其他的一些因素(如：生长因子剥夺、Ca²⁺水平上调、氧化剂和靶向药物等)也会使该通路被激活。我们已经知道，Ca²⁺信号控制着许多重要的细胞功能，其在细胞内的稳态对于细胞的生存和死亡都极为重要。有研究表明，在细胞接收到凋亡信号时，钙离子由内质网向线粒体转移，使线粒体膜受损并增加膜通透性，从而导致细胞色素c(Cyt c)和凋亡蛋白酶激活因子1(Aapaf-1)的释放，进而引起一系列导致细胞凋亡的关键事件，最终导致细胞凋亡。

图15是配合物5(0.45、0.9和1.8μM)和7(0.5、1.0和2.0μM)对BEL-7402细胞作用48h后，对细胞内Ca²⁺的影响。流式细胞术实验结果表明：在配合物作用下，癌细胞内Ca²⁺浓度增加，与对照组(黑色峰)相比，加入相应配合物后荧光增强(峰右移)，Ca²⁺释放水平提高，说明配合物5和7有可能是通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞凋亡。

3.3.7配合物激活肿瘤细胞中Caspase-3/9的表达

凋亡细胞具有与病理坏死细胞不一样的形态特征，而细胞凋亡时大多数的形态学变化都是由一组半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspases)引起的，这些蛋白酶在凋亡细胞中被特异性激活，由于Caspases的活化是凋亡成功的关键，其家族成员在细胞凋亡的发生和执行中起着重要的作用。Caspases家族分为两组：启动因子(Caspase-2,8,9和10)和执行因子(Caspase-3,6和7)。其中，Caspase-9是触发细胞凋亡的关键启动因子，细胞色素c(Cyt-c)从线粒体膜间间隙释放到细胞质后，结合凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)和procaspase-9形成凋亡小体，促进caspase-9的激活，活化的caspase-9裂解并激活下游的caspases(如caspase-3,caspase-6,caspase-7等)，从而形成caspases级联反应来整合促凋亡信号，最终导致细胞凋亡。而caspase-3则是细胞凋亡的关键执行者，被caspase-9裂解并激活后，caspase-3切割并裂解细胞内的数百种目标蛋白，最终导致细胞死亡。本节应用流式细胞术检测配合物5和7对癌细胞中Caspase-3/9表达的影响。

应用流式细胞术检测配合物5(0.45、0.9和1.8μM)和7(0.5、1.0和2.0μM)对BEL-7402细胞作用48h后，细胞中Caspase-3/9激活的情况。

如图16所示，配合物5作用于细胞后，细胞中Caspase-3激活的百分数分别增加了9.08％、17.54％、46.77％。Caspase-9激活的百分数分别增加了17.23％、22.5％、58.99％。

如图17所示，配合物7作用于细胞后，细胞中Caspase-3激活的百分数分别增加了21.01％、36.14％、50.55％。Caspase-9激活的百分数分别增加了33.28％、44.24％、73.62％。

实验结果显示，配合物5和7均可以激活BEL-7402细胞中的Caspase-3/9。而Caspase-3和Caspase-9在线粒体通路中是导致细胞凋亡的关键因子，说明配合物5和7有可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

3.3.8 Western Blot检测配合物对凋亡相关蛋白表达的影响

线粒体功能障碍已被证明有助于细胞凋亡的发生，并且是凋亡通路的中心。该通路涉及三种关键的蛋白：B细胞淋巴癌-2(BCL-2)家族蛋白、Caspases和线粒体促凋亡蛋白。BCL-2家族蛋白通过调控线粒体膜的通透性，在线粒体介导的凋亡中起关键作用。BCL-2家族蛋白中的Bcl-2蛋白是一种线粒体外膜蛋白，作为抗凋亡因子，Bcl-2蛋白过表达可以阻断细胞的凋亡过程。以Bcl-2等抗凋亡蛋白为靶点的分子治疗可启动癌细胞凋亡，比如我们知道的Bcl-2拮抗剂ABT-737可以有效地杀死白血病和淋巴瘤细胞。Bax是一种促凋亡蛋白，在未激活时，Bax蛋白可作为单体存在于胞浆内或与线粒体膜松散结合，但在活化过程中，Bax向线粒体外膜移位并插入线粒体外膜。被激活的Bax可以和Bak形成同源低聚物，此聚合物参与线粒体膜孔的形成，并导致线粒体膜通透性增加，使细胞色素c(Cyt c)释放到细胞溶胶中。Cyt c与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)及dATP一起使启动因子procaspase-9在凋亡小体内聚集并活化。随后，凋亡小体驱动caspases的活化，激活的caspases在整个细胞内裂解并使众多关键蛋白失效，最终导致细胞凋亡。

如图18和19所示，配合物5(0.45、0.9和1.8μM)和7(0.5、1.0和2.0μM)对BEL-7402细胞作用48h后，能明显上调Apaf-1、Bax、Bak与Cytochrome-c蛋白的表达量，同时下调Bcl-2蛋白的表达量，实验结果表明：配合物5和7有可能是通过线粒体途径诱导细胞产生凋亡。