一种抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂
阅读说明：本技术 一种抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂 (Compound Chinese herbal medicine preparation for resisting fish rhabdovirus ) 是由 牛银杰 李宁求 付小哲 林强 罗霞 刘礼辉 梁红茹 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂。本发明的复方中草药制剂包括以下重量份数计的组分：连翘苷提取物1-2份、柠檬苦素提取物0.5-1份、香豆素提取物1-2份、甘草酸提取物3-4份。本发明的复方中草药制剂可显著抑制鱼类弹状病毒复制,延缓其发病及降低死亡率；为鱼弹状病毒防治提供了新的方法,为鱼药的开发提供了新的思路。(The invention discloses a compound Chinese herbal medicine preparation for resisting fish rhabdovirus. The compound Chinese herbal medicine preparation comprises the following components in parts by weight: 1-2 parts of phillyrin extract, 0.5-1 part of limonin extract, 1-2 parts of coumarin extract and 3-4 parts of glycyrrhizic acid extract. The compound Chinese herbal medicine preparation can obviously inhibit the replication of the fish rhabdovirus, delay the morbidity of the fish rhabdovirus and reduce the mortality; provides a new method for preventing and treating the fish rhabdovirus and provides a new idea for developing fish drugs.)
技术领域
本发明涉及中草药技术领域，尤其涉及一种抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂。
背景技术
鱼类弹状病毒病是由鱼弹状病毒引起的一种高度传染性病毒病。1999年，中国学者张其亚在广东患病的鳜组织中首次观察到了鳜弹状病毒(Siniperca chuatsirhabdovirus,SCRV)。SCRV为弹状病毒科(Rhabdoviridae)成员之一，为单股负链不分节段的RNA病毒。该病毒可感染鳜、鲈及海水鱼类，给渔业养殖造成了巨大的经济损失。目前，针对鱼类弹状病毒引起的疾病，其防制主要靠疫苗预防，尚无有效药物，综合防制较为困难。因此，寻找安全、高效和低毒的抗弹状病毒药物成为亟待解决的问题。
中草药是天然植物，来源广泛，具有高效低毒的特点，日益成为抗病毒药物研发的热点。目前，抗弹状病毒复方中草药鲜见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂，包括以下重量份数计的组分：连翘苷提取物1-2份、柠檬苦素提取物0.5-1份、香豆素提取物1-2份、甘草酸提取物3-4份。
优选地，所述抗鱼类弹状病毒的复方中草药制剂包括以下重量份数计的组分：连翘苷提取物2份、柠檬苦素提取物1份、香豆素提取物2份、甘草酸提取物4份。
优选地，所述鱼类弹状病毒为鳜弹状病毒(SCRV)。
优选地，所述复方中草药制剂的应用方式为：将复方中草药制剂添加到饲料中。
优选地，所述复方中草药制剂的添加量为10g制剂每kg饲料。
所述复方中草药制剂的体外细胞抗病毒安全浓度为：连翘苷提取物50μg/mL、柠檬苦素提取物25μg/mL、香豆素提取物50μg/mL、甘草酸提取物100μg/mL。
优选地，所述细胞为鲤鱼上皮细胞(EPC)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、发明人选取鳜弹状病毒作为模式病毒，以鲤鱼上皮细胞系为依托，发现连翘苷、柠檬苦素、香豆素和甘草酸提取物组合的复方中草药制剂体内体外均可显著抑制SCRV复制，延缓发病，降低死亡率。
2、本发明的复方中草药制剂为鱼类弹状病毒防控提供了新的方法，为渔药的开发提供了新的思路。
附图说明
图1是中药提取物对EPC细胞最大安全浓度的测定结果图；其中，A为连翘苷提取物，B为柠檬苦素提取物，C为香豆素提取物，C为甘草酸提取物。
图2是四种中药提取物对SCRV复制的影响检测结果图；其中，A为连翘苷提取物，B为柠檬苦素提取物，C为香豆素提取物，D为甘草酸提取物。
图3是四种中药提取物配制的复方中草药制剂对SCRV复制的影响检测结果图。
图4是四种中药提取物配制的复方中草药制剂在鱼体上对SCRV的作用检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1材料与方法
1.1细胞与病毒
鲤鱼上皮细胞(Epithelioma Papulosum Cyprini,EPC)购自通派生物科技有限公司。EPC在含有10％胎牛血清(FBS)的M199培养基中增殖，并在28℃培养。鳜弹状病毒(SCRV-SS)由本实验分离及保存(文献“Fu X,Lin Q,Liang H,Liu L,Huang Z,Li N,Su J.Thebiological features and genetic diversity of novel fish rhabdovirus isolatesin China.Arch Virol.2017Sep；162(9):2829-2834.”中公开)。SCRV-SS在含有5％FBS的M199培养基中增殖，并在28℃培养，待完全病变后，反复冻融2次，分装保存于-80℃备用。
1.2主要试剂及中药提取物
M199培养基、胎牛血清和胰酶购自Gibco公司。CellTiter 96@AQueous onesolution Cell proliferation Assay试剂盒购自Promega公司。连翘苷、柠檬苦素、香豆素、和甘草酸四种中药提取物购自成都曼思特生物科技有限公司。
1.3中药提取物对EPC细胞最大安全浓度的测定
将连翘苷、柠檬苦素、香豆素、和甘草酸四种中药的提取物用含2％二甲基亚砜(DMSO)的M199基本培养基配制成2mg/mL。使用前再以含10％FBS的L15完全培养基将四种中药提取物均依次稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL 5个浓度。将EPC细胞接种至96孔板，待长满单层，弃掉培养液，分别加入四种中药提取物，每孔100μL，每个稀释度3个重复；同步设置空白细胞对照；28℃温箱培养，每天观察EPC细胞的形态及生长情况。培养72h后采用CellTiter 96@AQueous one solution Cell proliferation Assay试剂盒检测细胞活力，即每孔加入20μL CellTiter 96@AQueous One Solution Reagent，在28℃、5％CO2温箱中孵育4h，测定D490nm值。计算细胞的活力。计算公式为：药物组D490nm值/细胞对照组D490nm值。
1.4四种中药提取物对SCRV复制的影响
根据测定的四种中药提取物的安全浓度，取单层EPC细胞的24孔板，分别按照最大安全浓度加入4个中草药提取物，400μL/孔，28℃温箱培养2h；每个药物设4个重复；同步设置加入DMSO的空白对照，作用4h。弃掉药液，Hank’s缓冲液洗涤3次，含有各药物安全浓度的孔中加入SCRV病毒液至病毒4×103TCID50/孔。28℃温箱继续培养2h后，弃掉病毒液，Hank’s缓冲液洗涤3次，加入含有药物的5％FBS的M199培养基继续培养，每天观察统计细胞的病变效应(CPE)。待SCRV的阳性对照全部病变时，收取病毒液测定半数组织培养感染剂量(TCID50)。
1.5四种中药提取物配制的复方中草药制剂对SCRV复制的影响
在四个中药提取物都抗SCRV的基础上，根据各个药物的最大安全浓度配制药物。在EPC细胞长至单层的12孔培养板中，分别以DMSO作为空白对照；连翘苷提取物、柠檬苦素提取物和香豆素提取物(A+B+C)；柠檬苦素提取物、香豆素提取物和甘草酸提取物(B+C+D)；连翘苷提取物、柠檬苦素提取物和甘草酸提取物(A+B+D)；连翘苷提取物、香豆素提取物和甘草酸提取物(A+C+D)；连翘苷提取物、柠檬苦素提取物、香豆素提取物和甘草酸提取物(A+B+C+D)四个提取物最大安全浓度组合混合孵育细胞4h。弃掉药液，Hank’s缓冲液洗涤3次，加入含不同组合混合药物的SCRV病毒液4×103TCID50/孔，孵育2h，Hank’s缓冲液洗涤3次，加入含混合药物的5％FBS的M199培养基继续培养观察细胞的CPE情况。待SCRV的阳性对照全部病变时，收取每个稀释度的病毒液测定TCID50。
1.6复方中草药制剂在鱼体上对SCRV的作用
选取100条4～5cm的加州鲈，分为对照组(Con)和药物试验组(Experiment)各50条。将连翘苷提取物、柠檬苦素提取物、香豆素提取物、甘草酸提取物按照2：1：2：4的质量比进行配比，得到复方中草药制剂，以10g复方中草药制剂/kg饲料的比例将制剂混合到饲料中，4g/天进行喂食，连续喂食3天。对照组以正常饲料喂食。之后以104TCID50/尾进行腹腔注射攻毒，观察10天，记录鱼的死亡时间和数量。
1.7数据统计分析
实验所得数据均采用实验所有的数据分析，均用Graphpad prism5.0分析及绘制。
2结果
2.1中药提取物对EPC细胞的最大安全浓度测定
高浓度中药提取物对EPC细胞会产生毒性，药物浓度越大，对细胞的毒性越大，D490nm值越小。为了测定中药提取物体外抗病毒的作用，需预先测定中药提取物对EPC细胞的最大安全浓度，避免药物自身毒性对EPC细胞生长产生影响。如图1所示，连翘苷、柠檬苦素、香豆素、甘草酸提取物的最大安全浓度分别为：50μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。
2.2各中药提取物对SCRV复制的影响
待SCRV阳性对照全部病变时，收取病毒液，测定TCID50。如图2所示，四种中药提取物均对SCRV复制有一定抑制作用。
2.3复方中草药制剂对SCRV复制的抑制作用
以连翘苷提取物、柠檬苦素提取物、香豆素提取物、甘草酸提取物的复方中草药制剂(体系中各提取物浓度依次为50μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)处理EPC细胞，待SCRV阳性对照全部病变时，测定滴度。由图3结果可知，四种药物联合使用，可显著抑制SCRV复制，其抑制作用大于任一单一药物。
2.4复方中草药制剂在鱼体上对SCRV的作用
动物实验结果表明，复方中草药制剂可延缓SCRV发病，加州鲈的存活率提高了30％。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
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