管路类和容器类医疗器械无菌检测方法
阅读说明：本技术 管路类和容器类医疗器械无菌检测方法 (Method for detecting sterility of pipeline and container medical instruments ) 是由 张萌萌 栾园园 郝树彬 王文庆 黄经春 栾同青 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于医疗器械无菌检测领域,提供管路类和容器类医疗器械无菌检测方法,步骤为：为向管路类和容器类医疗器械内加入无菌培养基,振荡冲洗之后将培养基转移到无菌容器内进行培养并进行菌落检查,即培养基冲洗法；或者向管路类和容器类医疗器械内加入无菌培养基直接进行培养并进行菌落检查,即培养基灌装法。本发明的培养基冲洗法与薄膜过滤法相比,无需使用无营养成分的冲洗液冲洗,直接采用有营养成分的培养基冲洗,检出率更高,无需过滤操作,降低了假阳性的概率；培养基灌装法直接将培养基灌装入容器内腔进行培养,无需对产品进行洗脱,大大减少了假阴性的可能,提高了检出率。(The invention belongs to the field of medical instrument sterility test, and provides a method for testing the sterility of pipeline and container medical instruments, which comprises the following steps: adding a sterile culture medium into the pipeline medical instruments and the container medical instruments, transferring the culture medium into a sterile container for culture after shaking and washing, and carrying out bacterial colony inspection, namely a culture medium washing method; or adding a sterile culture medium into the pipeline medical instruments and the container medical instruments to directly culture and carry out bacterial colony inspection, namely a culture medium filling method. Compared with a membrane filtration method, the culture medium flushing method does not need flushing liquid without nutrient components, directly adopts the culture medium with nutrient components for flushing, has higher detectable rate, does not need filtration operation, and reduces the probability of false positive; the culture medium filling method directly fills the culture medium into the inner cavity of the container for culture without eluting the product, thereby greatly reducing the possibility of false negative and improving the detection rate.)
技术领域
本发明属于医疗卫生技术领域，特别是管路类和容器类医疗器械无菌检测方法。
背景技术
医疗器械直接或间接作用于人体，其极高的卫生程度对于保证医疗效果和患者健康具有 重要意义，因此需要在医疗器械流入市场或者使用之前进行灭菌，尤其对于大批量一次性医 疗器械需要进行无菌检查，以降低在后续使用过程中对人体造成感染的风险。无菌检查法是 指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一 种方法。目前医疗器械行业内普遍采用的医疗器械成品无菌试验方法主要包括薄膜过滤法、 直接接种法。
薄膜过滤法需要对产品上的微生物进行洗脱，并收集洗脱液进行薄膜过滤，一方面由于 步骤较多，操作比较繁琐，容易引进外源污染而造成假阳性；另一方面，更为重要的是，此 技术可能无法对产品上的所有微生物进行洗脱，导致洗脱液不能完全代表产品的微生物水平， 从而提高了假阴性的可能，无法保证检出率。
直接接种法需要将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内进行培养，不适用 于只要求内腔无菌的医疗器械产品；此外，对于有细长管状的供试品而言，很难将其剖开剪 碎，使培养基接触管腔，增加了假阴性的概率，因此限制了其在具有容腔的医疗器械无菌检 验中的应用。
发明内容
本发明为了解决现有技术中对于管路类和容器类医疗器械的无菌检验存在假阳性、假阴 性、操作复杂的技术问题，提供了管路类和容器类医疗器械无菌检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
管路类和容器类医疗器械无菌检测方法，其特征在于，步骤如下：
培养基冲洗法：向管路类和容器类医疗器械内加入无菌培养基，振荡冲洗之后将培养基 转移到无菌容器内进行培养并进行菌落检查；
或者，培养基灌装法：向管路类和容器类医疗器械内加入无菌培养基直接进行培养并进 行菌落检查；
优选的，所述管路类医疗器械进一步优选为输液器，容器类医疗器械进一步优选为血袋；
优选的，所述无菌培养基为胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基)或硫乙醇酸盐流体培 养基(FTM培养基)；
优选的，向血袋中加入无菌培养基的振荡方法为手动振摇2min；
优选的，输液器的冲洗方法为使无菌培养基匀速流过管内腔，流量约为10mL/min。
优选的，转移方式为直接将冲洗液导入无菌培养容器中。
优选的，所述无菌培养容器包括无菌试管、一次性使用无菌取样杯和无菌培养瓶；
优选的，所述培养基冲洗法的培养条件为在培养仪中培养2天，培养基灌装法的培养条 件为在培养箱中培养14天，TSB培养基的培养温度为22.5℃，FTM培养基的培养温度为32.5℃。
优选的，菌落检查方法为通过检测微生物生长产生的代谢产物来监测微生物的生长状况， 具体方法为将冲洗医疗器械之后的培养基加入带有硅胶膜和pH指示剂的培养瓶，培养2天 之后，若pH指示剂颜色变化则判定培养基中含有微生物。
所述培养瓶包括通过螺纹连接的瓶盖和透明瓶体，所述透明瓶体的底部设置有硅胶膜圈， 所述硅胶膜圈的横截面为半封闭形，所述硅胶膜圈与所述透明瓶体的瓶底形成封闭的环形区 域，在所述环形区域内设置有pH指示剂，所述硅胶膜圈为允许CO2透过的高分子半透膜， 培养基中微生物生长产生的代谢产物CO2可渗透培养瓶底部的硅胶膜，CO2溶解电离产生H+， H+能够使硅胶膜圈封闭空间内的pH指示剂产生颜色变化。
本发明实施例提供的一个或多个技术方案，至少具有以下技术效果：
(1)本发明操作方法简单，无需过滤操作，不需使用集菌仪及薄膜过滤器，降低了试验 操作成本，并减少了引入外源菌的可能性，降低了假阳性的概率；
(2)本发明的培养基冲洗法与薄膜过滤法相比，无需使用无营养成分的冲洗液冲洗，直 接采用有营养成分的培养基冲洗，检出率更高。
(3)本发明的培养基灌装法直接将培养基灌装入容器内腔进行培养，无需对产品进行洗 脱，大大减少了假阴性的可能，提高了检出率。
(4)本发明培养基冲洗法的菌落检查方法为通过检测微生物生长产生的代谢产物来监测 微生物的生长状况，即利用微生物产生的CO2能使培养瓶中的pH指示剂发生颜色变化的原 理判断培养基中有无微生物，减少了传统目视检查的主观性，缩短了检验周期。
附图说明
图1为输液器产品在不同无菌试验方法下的试验菌检出率比较图(TSB培养基)(输液 器不同梯度不同无菌试验方法的检出率比较(TSB培养基))。
图2为输液器不同梯度不同无菌试验方法的检出率比较(FTM培养基)。
图3为血袋不同梯度不同无菌试验方法的检出率比较(TSB培养基)。
图4为血袋产品在不同无菌试验方法下的试验菌检出率比较图(FTM培养基)(血袋不 同梯度不同无菌试验方法的检出率比较(FTM培养基))。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
应当说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、 材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
管路类医疗器械无菌检测方法，采用培养基冲洗法对输液器进行无菌检测，包括以下步 骤：
(1)将输液器(型号规格：A 0.55×19RW LB)的穿刺针部位刺入含有胰酪大豆胨液体 培养基或硫乙醇酸盐流体培养基瓶的瓶口内，使培养基流过管内腔，流量约为10mL/min，收 集100mL冲洗液于无菌培养瓶中。
为了便于计算检出率，本步骤中的输液器预先经过人工污染处理，具体操作为：
a、试验菌悬液的制备
用移液枪取0.1mL浓度为1.9×108/0.1mL的ATCC9372菌悬液加入到9.9mL 40％酒精溶 液中，制成1.9×106/0.1mL的菌悬液，并依次梯度稀释至1.9×104/0.1mL、1.9×102/0.1mL， 将浓度为1.9×102/0.1mL的菌悬液记为A，取5mL菌悬液A加入到5mL40％酒精溶液中得到 菌悬液1/2A(梯度1)，并依次梯度稀释得到菌悬液1/4A(梯度2)、菌悬液1/8A(梯度3)， 菌悬液1/16A(梯度4)。
分别取梯度1至梯度4的菌悬液100μL进行菌落计数，每个梯度选取两个平板进行计数， 结果见表1。
b、人工污染试样的制备
将步骤a制备的梯度1至梯度4的ATCC9372菌悬液0.1mL接种至无菌输液器内部，晃动输液器使菌悬液尽可能均匀的分布在输液器的管路中，然后置于干燥箱中在55℃下烘干4 小时，每个接种梯度制备30个染菌输液器。
(2)将盛有冲洗液的无菌培养瓶在培养仪中培养2天，TSB培养基的培养温度为22.5℃， FTM培养基的培养条件为32.5℃。培养瓶包括通过螺纹连接的瓶盖和透明瓶体，其透明瓶体 的底部设置有硅胶膜圈，硅胶膜圈的横截面呈倒“L”形，与透明瓶体的瓶底和瓶壁形成封闭 的环形区域，在环形区域内设置有pH指示剂，硅胶膜圈为允许CO2透过的高分子半透膜， 培养基中微生物生长产生的代谢产物CO2可渗透培养瓶底部的硅胶膜，CO2溶解电离产生H+， H+能够使硅胶膜圈封闭空间内的pH指示剂产生颜色变化，若pH指示剂颜色变化，则培养仪 报阳。
(3)观察培养仪报阳情况，结果见表2、表3。
阳性对照：
各取4个无菌输液器，不进行人工污染，步骤(1)中，向TSB培养基或FTM培养基中加入ATCC 9372，使其梯度浓度同梯度1至梯度4，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同， 结果见表2、表3。
阴性对照：
各取4个无菌输液器，不进行人工污染，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，结果见表2、表3。
实施例2
容器类医疗器械无菌检测方法，采用培养基冲洗法对血袋进行无菌检测，包括以下步骤：
(1)使用一次性无菌注射器向一次性塑料血袋中加入TSB培养基或FTM培养基100mL， 然后手动振荡2min；
为了便于计算检出率，本步骤中的血袋预先经过人工污染处理，具体操作为：
a、试验菌悬液的制备
用移液枪取0.1mL浓度为1.9×108/0.1mL的ATCC9372菌悬液加入到9.9mL 40％酒精溶 液中，制成1.9×106/0.1mL的菌悬液，并依次梯度稀释至1.9×104/0.1mL、1.9×102/0.1mL， 将浓度为1.9×102/0.1mL的菌悬液记为A(梯度1＇)，取5mL菌悬液A加入到5mL40％酒精 溶液中得到菌悬液1/2A(梯度2＇)，并依次梯度稀释得到菌悬液1/4A(梯度3＇)、菌悬液1/8A (梯度4＇)、菌悬液1/16A。
分别取梯度1＇至梯度4＇的菌悬液100μL进行菌落计数，每个梯度选取两个平板进行计 数，结果见表4。
b、人工污染试样的制备
将步骤a制备的梯度1＇至梯度4＇的ATCC9372菌悬液0.1mL接种至无菌血袋内部，晃动血袋使菌悬液尽可能均匀的分布在血袋中，然后置于干燥箱中在55℃下烘干4小时，每个接种梯度制备30个染菌血袋。
(2)将盛有冲洗液的无菌培养瓶在培养仪中培养2天，TSB培养基的培养温度为22.5℃， FTM培养基的培养温度为32.5℃，无菌培养瓶同实施例1中的培养瓶。
(3)观察培养仪报阳情况，结果见表5、6。
阳性对照：
各取4个无菌血袋，不进行人工污染，步骤(1)中，向TSB培养基或FTM培养基中加入ATCC 9372，使其梯度浓度同梯度1＇至梯度4＇，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同， 结果见表5、6。
阴性对照：
各取4个无菌血袋，不进行人工污染，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，结果见表5、6。
实施例3
管路类医疗器械无菌检测方法，采用培养基灌装法对输液器进行无菌检测，包括以下步 骤：
(1)将型号与实施例1相同的输液器的穿刺针部位刺入瓶装TSB培养基或FTM培养基 瓶口内，使冲洗液流入并充满输液管内腔，穿刺针端盖上护帽，另一端使用夹片夹住避免培 养基流出。
为了便于计算检出率，本步骤中的输液器预先经过人工污染处理，具体操作同实施例1。
(2)将含有培养基的输液器置于培养箱中培养14天，TSB培养基的培养温度为22.5℃， FTM培养基的培养温度为32.5℃。
(3)目视观察步骤(2)中培养基的浑浊度，若显澄清，则无菌生长；若显浑浊，则有菌生长，结果见表2、3。
阳性对照
各取4个无菌输液器，不进行人工污染，步骤(1)中，向TSB培养基或FTM培养基中加入ATCC 9372，使其梯度浓度同梯度1至梯度4，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同， 观察菌落生长情况并记录，结果见表2、3。
阴性对照
各取4个无菌输液器，不进行人工污染，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，结果见表2、3。
实施例4
容器类医疗器械无菌检测方法，采用培养基灌装法对血袋进行无菌检测，包括以下步骤：
(1)使用一次性无菌注射器向一次性无菌塑料血袋中加入TSB培养基或FTM培养基100mL；
为了便于计算检出率，本步骤中的血袋预先经过人工污染处理，具体操作同实施例2。
(2)将含有培养基的血袋置于培养箱中培养14天，TSB培养基的培养温度为22.5℃，FTM培养基的培养温度为32.5℃。
(3)目视观察步骤(2)中培养基的浑浊度，若显澄清，判无菌生长；若显浑浊，判有菌生长，结果见表5、6。
阳性对照
各取4个无菌血袋，不进行人工污染，步骤(1)中，向TSB培养基或FTM培养基中加入ATCC 9372，使其梯度浓度同梯度1＇至梯度4＇，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同， 观察菌落生长情况并记录，结果见表5、6。
阴性对照：
各取4个无菌血袋，不进行人工污染，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，结果见表5、6。
对比例1
使用薄膜过滤法对输液器进行无菌检测的方法，包括以下步骤：
(1)按照药典方法和GB/T14233.2-2005方法的要求，将输液器的穿刺针部位刺入0.9％ 氯化钠注射液瓶口，使冲洗液流过管内腔，流量约为10mL/min，收集100mL冲洗液于无菌 取样杯中，本步骤中的输液器按照实施例1中的人工污染试样来制备；
(2)使用集菌仪将冲洗液经薄膜过滤器过滤，过滤完成后向滤器中加入100mL TSB培 养基并在22.5℃下培养14天，或者加入100mL FTM培养基并在32.5℃培养14天；
(3)目视观察步骤(2)中培养基的浑浊度，若显澄清，则无菌生长；若显浑浊，则有菌生长，结果见表2、3。
阳性对照：
取4个无菌输液器，不进行人工污染，步骤(1)中，向0.9％氯化钠注射液中加入ATCC 9372，使其梯度浓度同梯度1至梯度4，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，观察菌落生长情况并记录，结果见表2、3。
阴性对照：
取4个无菌输液器，不进行人工污染，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，结果见表2、3。
对比例2
使用薄膜过滤法对血袋进行无菌检测的方法，包括以下步骤：
(1)按照药典方法和GB/T14233.2-2005方法的要求，使用一次性注射器向血袋中注入 100mL 0.9％的无菌氯化钠溶液，手动振摇2min，本步骤中的血袋参照实施例4中的人工污 染试样来制备；
(2)使用集菌仪将冲洗液经薄膜过滤器过滤，过滤完成后向滤器中加入100mLTSB培养 基并在22.5℃下培养14天，或者加入100mL FTM培养基并在32.5℃下培养14天；
(3)目视观察步骤(2)中培养基的浑浊度，若显澄清，则无菌生长；若显浑浊，则有菌生长，结果见表5、6。
阳性对照：
各取4个无菌血袋，不进行人工污染，步骤(1)中，向0.9％氯化钠注射液中加入ATCC 9372，使其梯度浓度同梯度1＇至梯度4＇，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，观察菌落生长情况并记录，结果见表5、6。
阴性对照：
各取4个无菌血袋，不进行人工污染，其他步骤与步骤(1)至步骤(3)相同，结果见表5、6。
通过使用三种不同试验方法对染菌血袋试样、染菌输液器试样进行无菌试验操作，然后 将表2、表3和表5、表6的检出率结果绘制成图，结果如图1～4所示，同时，对输液器和血 袋在不同培养基、不同人工污染菌落梯度、不同检测方法的条件下进行卡方检验，结果如表 7所示。
表1.用于人工污染输液器产品的不同梯度菌悬液平板计数结果
表2.输液器产品在不同梯度不同无菌检测方法时的微生物检出率(TSB培养基)
注：“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
表3.输液器产品在不同梯度不同无菌检测方法时的微生物检出率(FTM培养基)
注：“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
表4.用于人工污染血袋产品的不同梯度菌悬液平板计数结果
表5.血袋产品在不同梯度不同无菌检测方法时的微生物检出率(TSB培养基)
注：“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
表6.血袋产品在不同梯度不同无菌检测方法时的微生物检出率(FTM培养基)
注：“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
表7.输液器、血袋在不同培养基中对于三种检测方法的卡方检验结果
从表7中可知，输液器产品(梯度3、梯度4)的两个较高稀释度的培养基冲洗法与薄膜 过滤法间存在显著差异，且随着稀释梯度的增加，方法之间的差异越显著；血袋产品(梯度 3′、梯度4′)的两个较高稀释度的培养基冲洗法与薄膜过滤法间存在显著差异，且随着稀 释梯度的增加，方法之间的差异越显著；输液器的培养基灌装法与薄膜过滤法间存在显著差 异(p＜0.05)；血袋的培养基灌装法与薄膜过滤法间存在显著差异(p＜0.05)。
由以上检测及检验结果可知，薄膜过滤法需要对产品上的微生物进行洗脱并收集洗脱液 进行过滤，由于步骤较多，操作繁琐，容易引入污染造成假阳性；更为重要的是，此技术可 能无法对产品上的所有微生物进行洗脱，导致洗脱液不能完全代表产品的微生物水平，从而 提高了假阴性的可能，大大降低了检出率。
培养基灌装法直接将培养基灌装入内腔进行培养，无需对产品进行洗脱，是对产品上的 所有微生物进行检查，相比另外两种方法，大大减少了假阴性的可能，提高了检出率。培养 基灌装法优势明显，但因产品材料透明度的限制，可能会影响培养基浑浊度的观察，故培养 基灌装法可能不适用于所有容腔类医疗器械；输液器培养基灌装法的操作过程中亦存在诸多 问题，具体如下：一，培养基在流过输液器管内腔的过程中因管腔狭窄、细长极易造成气泡 存在使培养基无法完全充满管内腔。二，使培养基恰好充满管内腔的时间节点不好把控，很 容易因流量调节器关闭不及时使培养基流出，流出的培养基中可能会携带菌。两种情况均增 加了假阴性的概率。因此培养基灌装法不适用对其进行无菌检查，而培养基灌装法更适合具 有透明腔体的容器类医疗器械的无菌检测。
培养基冲洗法采用培养基代替无营养成分的冲洗液对容器内腔进行冲洗，然后对培养基 进行直接培养。减少了薄膜过滤的操作步骤，操作较为简单，不易引入污染造成假阳性。且 使用有营养成分的冲洗液，因菌具有趋向性，具有丰富营养物质的培养基在相同的洗脱方式 下更利于菌的富集，洗脱效果明显优于其他洗脱液。综上分析，培养基冲洗法更适合管路类 医疗器械的无菌检验。
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