阅读说明：本技术 注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法 (Sterility detection method for crosslinked sodium hyaluronate gel for injection ) 是由 王师亮 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法,包括以下步骤：A1：制备菌悬液或孢子悬液；A2：供试品溶液的制备：先取含300IU/ml的玻璃酸酶溶液90ml,取10ml注射用交联透明质酸钠凝胶置玻璃酸酶溶液中,常温水解,水解过程中不断振摇,待凝胶完全水解后摇匀,即得。采用本发明提供的注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法,采用玻璃酸酶对供试品(样品)进行溶解,避免假阴性的问题,直接接种,由于凝胶不能溶解,可导致微生物不能很好的被检出,本无菌检测方法的准确率高,容易实现,适用于大规律推广。(The invention provides a method for aseptically detecting cross-linked sodium hyaluronate gel for injection, which comprises the following steps: a1: preparing a bacterial suspension or a spore suspension; a2: preparation of a test solution: taking 90ml of hyaluronidase solution containing 300IU/ml, taking 10ml of crosslinked sodium hyaluronate gel for injection, putting the crosslinked sodium hyaluronate gel into the hyaluronidase solution, hydrolyzing at normal temperature, continuously shaking in the hydrolysis process, and shaking up after the gel is completely hydrolyzed to obtain the hyaluronic acid gel. By adopting the sterile detection method of the cross-linked sodium hyaluronate gel for injection, provided by the invention, hyaluronidase is adopted to dissolve a sample to be tested, so that the problem of false negative is avoided, direct inoculation is carried out, and microorganisms cannot be well detected due to the fact that the gel cannot be dissolved.)

注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法。

背景技术

在现有技术中的注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法中，都是将样品直接接种，其凝胶由于凝胶不能溶解，可导致微生物不能很好的被检出，容易导致假阴性的结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种准确率高，容易实现，的注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法。

本发明提供一种注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法，包括以下步骤：

A1：制备菌悬液或孢子悬液；

A2：供试品溶液的制备：先取含300IU/ml的玻璃酸酶溶液90ml，取10ml注射用交联透明质酸钠凝胶置玻璃酸酶溶液中，常温水解，水解过程中不断振摇，待凝胶完全水解后摇匀，即得；

A3：检测方法的步骤如下：

a1：供试品组的准备：取200ml供试品溶液采用二联的一次性全封闭集菌培养器过滤，完成后往集菌培养器的其中一个集菌杯加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基，往另外一个集菌杯加入100ml胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基；

a2：供试品试验组的准备：与供试品组同法操作，硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)每种培养基各制备3个集菌杯，共6个集菌杯，完成后转移至阳性对照检测室，分别加入小于l00cfu的试验菌；其中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌悬液或孢子悬液加至硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基中，白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌的菌悬液或孢子悬液加至胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基中；

a3：阳性对照组的准备：另取装有100ml硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)和100ml胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基的一次性无菌集菌杯各3杯，至阳性对照检测室，分别加入与供试品试验组所加入菌量一致的试验菌；其中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌悬液或孢子悬液加至硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基中，白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌的菌悬液或孢子悬液加至胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基中；

a4：阴性对照组的准备：取200ml含300IU/ml的玻璃酸酶溶液采用二联的一次性全封闭集菌培养器过滤，完成后往集菌培养器的其中一个集菌杯加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基，往另外一个集菌杯加入100ml胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基；

a5：菌落数确认组：取与加入供试品试验组所加入菌量一致的试验菌，至相应的培养基中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌使用胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)进行菌落数确认，白色念珠菌、黑曲霉使用沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)进行菌落数确认，生孢梭菌使用硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)进行菌落数确认。

a6：培养。

进一步地，步骤A1中，将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉制成小于100cfu/ml的菌悬液或孢子悬液。

进一步地，玻璃酸酶溶液的制备方法为：称取适量的玻璃酸酶，溶于100ml 0.9％无菌氯化钠溶液中，摇匀使之溶解，溶解后用0.22μm的无菌滤膜于无菌隔离器内进行过滤。、

进一步地，步骤A2中，注射用交联透明质酸钠凝胶从针管中挤出。

采用本发明提供的注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法，采用玻璃酸酶对供试品(样品)进行溶解，避免假阴性的问题，直接接种，由于凝胶不能溶解，可导致微生物不能很好的被检出，本无菌检测方法的准确率高，容易实现，适用于大规律推广。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下实施例的用到的菌株如下：

序号	名称	菌株编号	代数	制备及使用
					1	金黄色葡萄球菌	CMCC(B)-26003	不超过第5代	当天制备，2小时内使用
2	大肠埃希菌	CMCC(B)44102	不超过第5代	当天制备，2小时内使用
					3	生孢梭菌	CMCC(B)64941	不超过第5代	当天制备，2小时内使用
4	枯草芽孢杆菌	CMCC(B)-63501	不超过第5代	当天制备，2小时内使用
					5	白色念珠菌	CMCC(F)-98001	不超过第5代	当天制备，2小时内使用
6	黑曲霉	CMCC(F)98003	不超过第5代	当天制备，2小时内使用

用于接种的菌种形态特征应良好、传代次数不得超过5代。

本实施例提供一种注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法，包括以下步骤：

A1：制备菌悬液或孢子悬液；

A2：供试品溶液的制备：先取含300IU/ml的玻璃酸酶溶液90ml，取10ml注射用交联透明质酸钠凝胶置玻璃酸酶溶液中，常温水解，水解过程中不断振摇，待凝胶完全水解后摇匀，即得；

A3：检测方法的步骤如下：

a1：供试品组的准备：取200ml供试品溶液采用二联的一次性全封闭集菌培养器过滤，完成后往集菌培养器的其中一个集菌杯加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基，往另外一个集菌杯加入100ml胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基；

a2：供试品试验组的准备：与供试品组同法操作，硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)每种培养基各制备3个集菌杯，共6个集菌杯，完成后转移至阳性对照检测室，分别加入小于100cfu的试验菌；其中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌悬液或孢子悬液加至硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基中，白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌的菌悬液或孢子悬液加至胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基中；

a3：阳性对照组的准备：另取装有100ml硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)和100ml胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基的一次性无菌集菌杯各3杯，至阳性对照检测室，分别加入与供试品试验组所加入菌量一致的试验菌；其中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌悬液或孢子悬液加至硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基中，白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌的菌悬液或孢子悬液加至胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基中；

a4：阴性对照组的准备：取200ml含300IU/ml的玻璃酸酶溶液采用二联的一次性全封闭集菌培养器过滤，完成后往集菌培养器的其中一个集菌杯加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)培养基，往另外一个集菌杯加入100ml胰酪大豆胨液体培养基(TSB)培养基；

a5：菌落数确认组：取与加入供试品试验组所加入菌量一致的试验菌，至相应的培养基中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌使用胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)进行菌落数确认，白色念珠菌、黑曲霉使用沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)进行菌落数确认，生孢梭菌使用硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)进行菌落数确认。

a6：培养：：将供试品试验组、阳性对照组的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)及菌落数确认组的沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)置20-25℃培养5天，供试品试验组、阳性对照组的硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)及菌落数确认组胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)置30-35℃培养5天，供试品组、阴性对照组的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)置20-25℃培养14天，供试品组、阴性对照组的硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)置30-35℃培养14天。

本实施例中，将供试品试验组、阳性对照组的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)及菌落数确认组的沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)置22℃培养5天，供试品试验组、阳性对照组的硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)及菌落数确认组胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)置33℃培养5天，供试品组、阴性对照组的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)置22℃培养14天，供试品组、阴性对照组的硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)置33℃培养14天。

其中，步骤A1中，将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉制成小于100cfu/ml的菌悬液或孢子悬液。

其中，玻璃酸酶溶液的制备方法为：称取适量的玻璃酸酶，溶于100ml 0.9％无菌氯化钠溶液中，摇匀使之溶解，溶解后用0.22μm的无菌滤膜于无菌隔离器内进行过滤。

其中，步骤A2中，注射用交联透明质酸钠凝胶从针管中挤出。

结果：阴性对照组和供试品组无菌生长，阳性对照组生长良好，与对照组比较，供试品试验组的试验菌均生长良好，说明供试品的检验量在检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，菌落数确认组的菌落数均符合要求，不大于100cfu/ml，可按照此检査方法和检查条件进行供试品的无菌检查。

采用本发明实施例提供的注射用交联透明质酸钠凝胶无菌检测方法，采用玻璃酸酶对供试品(样品)进行溶解，避免假阴性的问题，直接接种，由于凝胶不能溶解，可导致微生物不能很好的被检出，本无菌检测方法的准确率高，容易实现，适用于大规律推广。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。