具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，以微孔滤膜作为载体，并结合冻干的方式将菌株加载于微孔滤膜上，所制备得到的菌片能够用于评估消毒剂的效果，但是这种基于微孔滤膜的菌片，载菌量有限，只能进行有限数量的菌量计数比较，在实际使用过程中非常受限，无法对消毒剂实现有效地评估。

为了解决如上的技术问题，本发明第一方面提供一种评估消毒剂效果的菌片的制备方法，将菌液以冷冻干燥的方式加载于载体上，形成菌片；

所述载体为滤纸、金属、玻璃、棉布或塑料的一种。

具体解决的问题如下：

(1)菌体保护问题，本发明使用了真空冻干法，但是菌体在冷冻干燥的过程中，菌体内大量的水会冻结形成冰晶，冰晶能破坏细胞膜的完整性，从而影响菌体的功能。本发明选择了合适的冻干保护剂，可以最大程度减小细胞损伤，保持菌体的活力和性能。

(2)菌悬液制备过程耗时长的问题，细菌繁殖体悬液和真菌悬液由于环境条件限制，每次制作菌片前需要现用现制，程序复杂，耗时长，保存时间短，细菌芽孢悬液虽然保存时间相对较长，但是制作程序也复杂漫长。本发明将菌悬液制备程序移交给生产厂家，并制成一次性的冻干菌片，可长时间保存，节省实验时间，提高实验效率，供实验室长期使用。

(3)菌片保存时间问题，传统菌片的制作过程中菌体自然死亡率高，保存时间短，本发明在冻干保存液中添加了糖类、蛋白质等营养成分，能保证菌体长期存活并且具有很好的保存效果。

需要特别强调的是，本发明人之前公开的专利CN 112980729 A中记载的菌种源，主要应用于评估培养基，虽然该专利中记载了该菌种源也能够用于评估消毒剂的消毒效果，但在使用过程中非常受限，因为该菌种源中载菌体为微孔滤膜，仅能够承载低浓度的复苏菌株，正如该专利中所记载的：“复苏的菌株通过菌体冻干保存成分稀释后的浓度不高于10³CFU/ml”，而实际在消毒剂消毒效果的检测中，一般的消毒剂评估过程都是需要引入大量的菌株，一般要达到10⁸CFU/ml，因此，该专利中的菌种源并不能很好地适用于大部分消毒剂效果的检测过程。

正是基于上述专利中的菌种源用于评估消毒剂消毒效果时所存在的问题，提出本发明中的方案来特异性地针对消毒剂进行效果评估，本发明所提供的菌片，通过载体自身的结构特征，并结合冷冻干燥工艺，能够有效将高浓度的菌株加载于载体上，进而能够适用于大多数消毒剂评估体系，非常具有实际应用价值。

所述制备方法具体包括如下步骤：

(1)对载体进行灭菌处理；

(2)将保藏的菌株在培养基上传代复苏；

(3)将复苏后的菌株使用菌体冻干保存成分所配制的保存液进行稀释，得到菌悬液；

(4)将菌悬液加载到载体上，然后进行冷冻干燥，得到冻干菌片；

(5)将冻干的菌片冷冻保存。

进一步的，在评估气雾或超低容量喷雾等消毒剂时，不可使用布片和滤纸片等有吸附能力的载体，可选择金属片或玻璃片。

进一步的，所述载体除滤纸外，在染菌前均需进行脱脂处理。

所述脱脂方法如下：

(1)将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30min；

(2)用自来水洗净；

(3)用蒸馏水煮沸10min；

(4)用蒸馏水漂洗至PH呈中性；

(5)晾干、熨平备用。

进一步的，所述载体的灭菌条件为120-130℃下处理10-20min。

进一步的，所述载体为10mm×10mm的方形；

优选的，以金属片作为载体时，为直径12mm、厚度0.5mm的圆形。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的菌株为可溯源的菌种保藏机构来源的标准菌株传代而来的菌体，或者经过实验室验证的稳定具备其所属菌种代表性特征的菌株传代而来的菌体，传代为第3代-第8代，培养时间为18h-24h。

进一步的，所述菌株的培养基为固体培养基。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述保存液包括营养成分和冻干保护剂，冻干保护剂为甘油，营养成分为蛋白类、糖醇类、氨基酸中一种或多种物质的复配。

进一步的，所述蛋白类包括牛血清白蛋白、脑心浸液或酪蛋白的一种或多种；

进一步的，糖醇类包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖的一种或几种。

在本发明的一个或多个实施方式中，对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂，所述的保存液稀释后的菌悬液的含菌量为1×10⁹～5×10⁹CFU/mL，然后加入与菌悬液等量的3.0％的牛血清白蛋白，使菌悬液浓度为1×10⁸～5×10⁸CFU/mL，再进行加载；对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂，所述的保存液稀释后的菌悬液的含菌量为1×10⁹～5×10⁹CFU/mL，然后加入与菌悬液等量的0.3％的牛血清白蛋白，使菌悬液浓度为1×10⁸～5×10⁸CFU/mL，再进行加载；对用于经过严格清洗或极清洁的消毒对象的消毒剂，不使用牛血清白蛋白，所述的保存液稀释后的菌悬液浓度为1×10⁸～5×10⁸CFU/mL，再进行加载；

进一步的，当不加入与菌悬液等量的牛血清蛋白时，所述的保存液成分包括1％蔗糖、0.25％谷氨酸钠、20％甘油、3.7％脑心浸液培养基；当加入与菌悬液等量的牛血清蛋白时，所述的保存液成分包括2％蔗糖、0.5％谷氨酸钠、40％甘油、7.4％脑心浸液培养基。

进一步的，所述菌片用于低温现场消毒效果评价时，将牛血清白蛋白替换为胰蛋白，优选为胰蛋白胨大豆肉汤培养基。其中，牛血清白蛋白和胰蛋白均作为有机干扰物。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述菌悬液加载到载体上时，每100平方毫米的方形载体或每113.04平方毫米的圆形载体需滴染10μL菌悬液。

进一步的，所述的冷冻干燥条件为-30～-60℃下真空冷冻24h。

进一步的，冻干的菌片保存条件为-20℃～-40℃。

本发明第二方面提供一种上述制备方法得到的菌片，菌片回收菌数为5×10⁵cfu/片～5×10⁶cfu/片。该菌片能够用于常温状态下疫源地物体表面的消毒，或者低温状态下物体表面的预防性和疫源地消毒。

本发明第三方面提供一种评估消毒剂消毒效果方法，具体为：采用上述菌片进行消毒模拟试验，以评估消毒剂消毒效果。

所述的消毒模拟试验为载体浸泡杀菌试验；

具体为：采用不同浓度的消毒液、5.0mL/片分别注入不同的无菌平皿中，模拟不同的消毒条件；

将含有消毒剂的平皿置20℃±1℃水浴5-8min，将菌片放入消毒剂中并浸没。

用无菌镊子取出消毒后的菌片，放入5.0-8mL中和剂中，电动混匀20-30s或用手掌拍打80-90次，中和作用10-15min，混匀后接种平皿，测定存活菌数。

进一步的，所述的消毒模拟试验需以稀释液或标准硬水代替消毒剂做阳性对照试验。

进一步的，所述的消毒模拟试验计算活菌量(CFU/片)，并换算为对数值(N)、计算杀灭对数值的方法为：

KL＝N_d-N_s

式中：

KL——杀灭对数值；

N_d——对照组平均活菌量的对数值；

N_s——实验组活菌量的对数值。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例和对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一种菌片的制备方法：

对裁剪成10mm×10mm的滤纸片进行灭菌处理，湿热灭菌法121℃，15min；

将保藏的大肠杆菌8099在营养琼脂试管斜面上传代复苏传代至第5代，培养时间为18h；

配制冻干保护剂成分为2％蔗糖、0.5％谷氨酸钠、40％甘油、7.4％脑心浸液培养基，115℃，20min高压蒸汽灭菌；

用平衡值室温的冻干保护剂将斜面上的大肠杆菌8099洗脱，制成含菌量约为1×10⁹CFU/mL～5×10⁹CFU/mL的菌悬液，然后加入与菌悬液等量的3.0％的牛血清白蛋白，使菌悬液浓度为5×10⁸CFU/mL；

将无菌滤纸片摆入无菌平板中，每板10片，用滴染法将菌悬液加载到滤纸片上，每片滴加10μL菌悬液；

将盛有菌片的平板放入真空冷冻干燥机内，-30℃条件下冷冻干燥24h，得到冻干滤纸片，即为菌片；

将冻干的滤纸片放入-20℃冷冻保存，24h、一周、一月后分别检测滤纸片回收率，结果如图2所示；

实施例2

载体选择白平纹棉布，进行脱脂处理。脱脂方法如下：

(1)将棉布放在含洗涤剂的水中煮沸30min；

(2)用自来水洗净；

(3)用蒸馏水煮沸10min；

(4)用蒸馏水漂洗至PH呈中性；

(5)晾干、熨平备用。

在剪开前，将脱脂的布块按照10mm×10mm的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开，得到大小一致且无毛边的10mm×10mm的布片。

将布片进行灭菌处理，湿热灭菌法121℃，15min；

将保藏的枯草杆菌黑色变种ATCC9372在营养琼脂试管斜面上传代复苏传代至第8代，培养时间为24h；

配制冻干保护剂成分为1％蔗糖、0.25％谷氨酸钠、20％甘油、3.7％脑心浸液培养基，115℃，20min高压蒸汽灭菌；

用平衡值室温的冻干保护剂将斜面上的枯草杆菌黑色变种ATCC9372洗脱，使菌悬液浓度为5×10⁸CFU/mL。

将无菌布片摆入无菌平板中，每板10片，用滴染法将菌悬液加载到布片上，每片滴加10μL菌悬液；

将盛有菌片的平板放入真空冷冻干燥机内，-60℃条件下冷冻干燥24h，得到冻干布片，即为菌片；

对比例1

对裁剪成10mm×10mm的微孔滤膜进行灭菌处理，应用环氧乙烷或辐照方式灭菌；

将保藏的大肠杆菌8099在营养琼脂试管斜面上传代复苏传代至第5代，培养时间为18h；

配制冻干保护剂成分为2％蔗糖、0.5％谷氨酸钠、40％甘油、7.4％脑心浸液培养基，115℃，20min高压蒸汽灭菌；

用平衡值室温的冻干保护剂将斜面上的大肠杆菌8099洗脱，制成含菌量约为1×10⁹CFU/mL～5×10⁹CFU/mL的菌悬液，然后加入与菌悬液等量的3.0％的牛血清白蛋白，使菌悬液浓度约为5×10⁸CFU/mL；

菌体加载滤膜，将菌液通过过滤的方式加载到微孔滤膜上；所述的菌体加载滤膜步骤中过滤方式为将特定量的菌液通过环凯过滤器，负压抽滤的方式将液体过滤，从而使菌体均匀分布于滤膜上，且避免分布于滤膜边缘；过滤后滴加一定量的所述菌体冻干保存成份所配制的保存液。将无菌容器中载有菌液的滤膜，放入真空冷冻干燥机内，-30℃条件下冷冻干燥24h。

实施例3

一种评估消毒剂消毒效果方法：

采用实施例1中制备的菌片进行消毒模拟试验，以评估消毒剂消毒效果：

配制有效氯含量为50mg/L的84消毒剂60mL；

取4个无菌平皿，按每片5mL(共15mL)的量，将消毒剂溶液注入平皿中；

将盛有消毒剂的平皿置于20℃的水浴锅内5min后，用无菌镊子放入预先制备的菌片，并使之浸透于消毒液中；

4个平皿分别作用1min、3min、5min、8min后，将菌片取出放入10ml的D/E肉汤中和剂试管中，震荡20s，静置5min，充分混合后，按一定的比例进行稀释，吸取1mL，使用倾注法接种到营养琼脂平板中，测定活菌数；即，实验组活菌数。

另取一平皿，注入10mL标准硬水代替消毒剂，放入2片菌片，重复如上步骤，作为阳性对照组；

将计数平皿放入37℃培养箱中，培养48h，记录活菌数。

消毒模拟试验计算活菌量(CFU/片)，并换算为对数值(N)、计算杀灭对数值的方法为：

KL＝N_d-N_s

式中：

KL——杀灭对数值；

N_d——对照组平均活菌量的对数值；

N_s——实验组活菌量的对数值。

实施例4

一种评估消毒剂消毒效果方法：

采用对比例1中制备的菌片进行消毒模拟试验，以评估消毒剂消毒效果：

配制有效氯含量为50mg/L的84消毒剂60mL；

使用消毒剂处理微孔滤膜，作用时间分别为1min、3min、5min、8min；

将微孔滤膜放置于营养琼脂平板内，进行培养并计数；

消毒剂效果评价要求初始菌悬液浓度达到10⁸CFU/mL，相对于实施例3，此实施例使用微孔滤膜作为载体，当消毒剂浓度低，作用时间短时，由于载菌量过大，每个菌体无法在膜上均匀分布形成单个菌落，培养后菌体连成一片，无法实现计数功能。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。