一种具有调节结肠内菌群功效的荔枝多糖-多酚加合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种具有调节结肠内菌群功效的荔枝多糖-多酚加合物及其制备方法与应用 (Litchi polysaccharide-polyphenol adduct with effect of regulating colonic flora and preparation method and application thereof ) 是由 苏东晓 罗楠 舒彬 杨新泉 曾庆祝 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有调节结肠内菌群功效的荔枝多糖-多酚加合物及其制备方法与应用。本发明方案中,荔枝多糖-多酚加合物可以通过促进结肠内菌群增殖,降低pH以维持结肠微环境健康,还有利于促进肠道系统中对人体有益的乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的产生；本发明方案制备的荔枝多糖-多酚加合物能显著改善肠道微环境健康,可用于添加在食品或药品中,具有广阔的应用前景。(The invention discloses a litchi polysaccharide-polyphenol adduct with an effect of regulating colonic flora and a preparation method and application thereof. In the scheme of the invention, the litchi polysaccharide-polyphenol adduct can maintain the health of a colon microenvironment by promoting the proliferation of flora in the colon and reducing the pH, and is also beneficial to promoting the generation of short-chain fatty acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid and the like which are beneficial to a human body in an intestinal tract system; the litchi polysaccharide-polyphenol adduct prepared by the scheme of the invention can obviously improve the intestinal microenvironment health, can be used for being added into food or medicines, and has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有调节结肠内菌群功效的荔枝多糖-多酚加合物及其制备方法与应用。
背景技术
随着社会发展，人们生活水平的不断增高。人们对健康的需求也越来越高。人体结肠内存在着数以万计的微生物，这些微生物菌群对人体免疫调节和营养代谢有着不可或缺的作用。
荔枝是无患子科荔枝属植物，成熟的荔枝果肉果皮鲜红，果肉洁白晶莹，香甜爽口。荔枝具有很高营养的价值，果肉含有大量的糖分，微生物C，氨基酸，矿物质等。还含有丰富的多糖和多酚等活性物质。相关技术表明多糖具有调节肠道菌群的功能，但是纯植物多糖调节肠道菌群效率低，也无法对具有特定多酚代谢功能的有益菌群进行调节。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出荔枝多糖-多酚加合物在制备具有调节结肠内菌群功效的食品或药品中的应用。
本发明还提出一种具有上述荔枝多糖-多酚加合物的制备方法。
本发明还提出一种上述方法制备得到的荔枝多糖-多酚加合物。
根据本发明的一个方面，提出了荔枝多糖-多酚加合物在制备调节肠道菌群紊乱的药物和/或食品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所调节结肠内菌群功效包括：在肠道系统中促进结肠内菌群增殖，降低pH和/或增加短链脂肪酸。
在本发明的一些实施方式中，所述荔枝多糖-多酚加合物的中的单糖包括甘露糖和半乳糖。
在本发明的一些实施方式中，所述荔枝多糖-多酚加合物的中的多酚包括没食子酸、没食子儿茶素、咖啡酸和香草醛。
在本发明的一些实施方式中，所述荔枝多糖-多酚加合物为多糖与多酚的复合物。
在本发明的一些实施方式中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸。
根据本发明的第二方面，提出了一种荔枝多糖-多酚加合物的提取方法，所述方法包括以下步骤：
S1、在果浆中加入乙醇，进行醇沉，固液分离，收集固相A；
S2、将步骤S1所得的固相A溶解后，进行水提，收集液相A和固相B；
S3、将步骤S2所得的液相A脱除蛋白后，加入乙醇，醇沉后，所得的沉淀即为水溶性多酚加合物；
S4、将步骤S2所得的固相B中加入碳酸钠溶液，固液分离，收集固相C和液相B，所述液相B为碱溶性多酚加合物提取液；所述固相C为不溶性多酚加合物。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，果浆与乙醇的质量体积比为1：1～10。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述乙醇的质量分数为95％～100％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述醇沉的温度为1～4℃，时间为8～12h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，固液分离方式采用过滤。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述水提的方式采用水浴加热，加热温度为85～95℃，加热时间为4～6h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述固液分离方式采用离心，离心速率为4000～6000rpm，时间为10～15min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述脱除蛋白的方式采用蛋白质沉淀剂；优选地，所述蛋白质沉淀试剂为Sevag试剂。
在本发明的一些实施方式中，Sevag试剂的组成包括三氯甲烷与正丁醇；三氯甲烷与正丁醇的体积比为4：1。
在本发明的一些实施方式中，液相A与Sevag试剂的比例为1：2～6，时间为10～20min，提取次数为9～15次。提取温度为55～65℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，加入Sevag试剂后还包括搅拌步骤，搅拌速率为100～500rpm，时间为1～5min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，加入Sevag试剂后还包括采用旋转蒸发仪60～70℃脱除有机溶剂的步骤。
在本发明的一些实施方式中，脱除蛋白沉淀的方式采用离心，离心速率为4000～6000rpm，时间为10～15min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述乙醇的质量分数为95％～100％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述水溶性多酚加合物还包括干燥步骤，50～75℃真空干燥至恒重。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述醇沉的温度为1～4℃，时间为8～12h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述固相B与添加的碳酸钠溶液的质量体积比为1：4～8。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述碳酸钠溶液的浓度为0.05～0.10mol/L。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述碳酸钠溶液中还包含20～40mmol/L的硼氢化钠。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述固液分离方式采用离心，离心速率为4000～6000rpm，时间为10～15min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，加入碳酸钠溶液后还包括搅拌步骤，搅拌速率为100～500rpm，时间为1～5min。
根据本发明的第三方面，提出了一种荔枝多糖-多酚加合物，所述荔枝多糖-多酚加合物由上述方法制备得到。
一种调节结肠健康的食品，包括上述的荔枝多糖-多酚加合物。
一种调节结肠内环境稳态的药品，包括上述的荔枝多糖-多酚加合物。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明的荔枝多糖-多酚加合物在制备具有调节结肠内菌群功效的食品或药品中的应用中，荔枝多糖-多酚加合物可以促进结肠内菌群增殖，降低pH以维持结肠微环境健康，还有利于促进肠道系统中对人体有益的乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的产生；本发明方案制备的荔枝多糖-多酚加合物能显著改善肠道微环境健康，相较于单一的荔枝多糖或多酚的效果更好，可有效用于添加在食品或药品中，具有广阔的应用前景，且通过本发明的方法，可以从荔枝中连续提取高纯度的水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物，方法简单高效，基本没有多糖和多酚的损失，工艺可操作性强，成本低，易实现工业化生产。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明测试例中的三种荔枝多糖-多酚加合物的高效液相色谱图；
图2为本发明测试例中的发酵实验中不同消化液中的结合酚含量图；
图3为本发明测试例中的发酵实验中pH随时间变化检测结果图；
图4为本发明测试例中的发酵实验中产生的乙酸、丙酸和丁酸的检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例提供了一种荔枝多糖-多酚加合物的提取方法，具体过程为：
(1)将200g荔枝果肉浸泡在无水乙醇中，在4℃下过夜，去除脂肪、色素等小分子物质；
(2)以4500r/min离心10min收集沉淀；
(3)将步骤(2)所得的沉淀加入1000mL蒸馏水中，在90℃水浴中提取4h。再次提取滤渣并合并滤液；
(4)步骤(3)所得的滤液在60℃真空浓缩后，用Sevag法脱蛋白8次，然后加入4倍体积的无水乙醇，在4℃下过夜；过滤收集沉淀干燥即得水溶性多酚加合物。
(5)将步骤(3)所得的滤渣中加入500mL 0.05mol/L Na2CO3溶液(含20mmol/L硼氢化钠)震荡提取4h后，4000rpm离心10min，得到上清液和沉淀；将上清液冻干后，得碱溶性多酚加合物；将沉淀通过冷冻干燥后获得不溶性多酚加合物。
试验例
1、三种多酚加合物的检测
采用了高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)对3种多酚加合物中结合酚的含量分别进行鉴定；采用TOF 5600+液相色谱高分辨串联质谱仪对三种多酚加合物的酚类组成进行鉴定；采用反相高效液相色谱法对三种多酚加合物中的酚类化合物的进行鉴定。方法如下：
使用YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×4.6mml.D，5μm粒径)对实施例1制备的3种多酚加合物进行色谱分离。流动相由0.4％的乙酸水溶液(溶液A)和乙腈(溶剂B)组成。梯度曲线如下：0-40min，5-25％B；40-45min，25-35％B；总运行时间为50min，平衡5min，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，柱温箱30℃。在分析之前，所有样品均通过0.45μm过滤器过滤。(如图1所示)。
将实施例1制备的三种多酚加合物中的酚类化合物按1:1:1的比例进行混合后，采用质谱仪进行鉴定，用TOF 5600+液相色谱高分辨串联质谱仪，配备涡轮离子喷雾电离源，使用EclipsePlus C18柱(2.1×100mm，1.8μm，安捷伦，德国)在负离子ESI模式下运行。毛细管电压设为4500v(负)，流动相为0.4％甲酸水溶(A)和乙腈(B)。以洗脱梯度进行分析：0-16min，5-25％B；16-18min，25-35％B；18-20min，35-50％B。流速为0.4mL/min，柱温为35℃，离子源温度为500℃，进样量为4μL。分析前，所有样品均通过0.22μm过滤器过滤。通过10次多通道采集，在100～1000m/z范围内扫描。(如表1-3所示)。
表1水溶性多酚加合物
表2碱溶性多酚加合物
表3不溶性多酚加合物
采用反相高效液相色谱法对三种多酚加合物中的结合酚含量进行鉴定。高效液相色谱采用YMC-Pack ODS-A柱(250×4.6mml.D.，5μm粒径)；柱温箱30℃；进样量20μL；检测器：DAD；流动相流速1.0mL/min下在安捷伦1260液相色谱仪上进行高效液相色谱分析。流动相为溶剂A(水/乙酸，996：4)和溶剂B(乙腈)。以下为洗脱梯度：0～40min溶剂B：5％～25％；40～45min溶剂B：25％～35％；45～50min溶剂B：35％～55％；总运行50min，平衡5min。在280nm紫外检测器下收集色谱数据，根据对比标准品(食子酸，儿茶素，丁香醛，原儿茶素，原儿茶醛，芦丁，(+)-没食子儿茶素，咖啡酸，原花青素B2，高原儿茶酸，槲皮素，丁香酸)的保留时间进行分析样品中酚类化合物的含量，数据为从三个样品获得的三个重复的平均值。
表4
高效液相色谱的数据结果如图1所示，从图中可以看出，本发明方案成功制备了3种多酚-多糖加合物，质谱数据如表1-3所示，3种多酚加合物中结合酚的含量如表4所示，从表中可以看出，本发明方案成功制备了3种多酚加合物，本发明方案制备的多酚-多糖加合物鉴定出含有没食子酸，儿茶素，丁香醛，原儿茶素，原儿茶醛，芦丁，(+)-没食子儿茶素，咖啡酸，原花青素B2，高原儿茶酸多种多酚，多酚的含量高。
2、荔枝多糖-多酚加合物在改善结肠菌群中的应用
实验方法：将实施例1制备的水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物以1：1：10的质量比取250.00mg置于100mL离心管中，加入0.1mL0.3 mol/L CaCl2溶液，14mL SSF电解质储备液，2mL的α-淀粉酶溶液(使用SSF电解质储备液配置的1500U/mL)，加入蒸馏水3.9mL使总体积为20mL。使用1mol/L NaOH调节pH为中性后，将离心管置于37℃震荡水浴锅中水浴震荡30min，进行模拟口腔消化；然后加入0.01mL0.3mol/L CaCl2溶液，15mL SGF电解质储备液，3.2mL胃蛋白酶溶液(25000U/mL，用胃液消化电解质储备液配制酶溶液)，加入蒸馏水至总体积为20mL。使用6mol/L HCl调节Ph至3.0后，将离心管置于37℃震荡水浴锅中水浴震荡120min，以模拟胃液消化；然后加入0.04mL 0.3mol/L CaCl2，11mLSIF电解质储备液，5mL胰酶液(800U/mL，用肠液消化电解质储备液配制酶溶液)，加入蒸馏水至总体积为20mL。使用1mol/L NaOH调节pH为中性后，将离心管置于37℃震荡水浴锅中水浴震荡120min，以模拟肠液消化。模拟口胃肠消化中电解质储备液的配制表2所示。
表2模拟口胃肠消化中电解质储备液的配制
SSF：模拟唾液；SGF：模拟胃液；SIF：模拟肠液
上述经进行模拟结肠发酵实验测试的方法是：
配置生长培养基：1L生长培养基中含有：蛋白胨2.00g，酵母提取物2.00g，氯化钠0.10g，K2HPO4 0.04g，KH2PO4 0.04g，MgSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·6H2O 0.01g(CaCl25.1mg)，NaHCO3 2.00g，血红素0.02g，盐酸半胱氨酸0.50g，胆汁盐0.50g，刃天青1mg，吐温80 2mL，维生素K1 10μL。一部分先根据样品数量需求，分装在样品管内，剩下的直接121℃灭菌15min。
分别称取经口腔-胃液-肠液消化后的100mg的荔枝多糖-多酚加合物于15mL离心管中，加入9mL生长培养基，121℃灭菌15min后。加入1mL的结肠微生物提取物，于厌氧培养箱(10％CO2，10％H2和80％N2)中，37℃发酵培养。对于空白对照组(Control)，仅添加生长培养基和结肠微生物提取物。在发酵的0.25h、6h、12h、24h和48h不同时间点取出离心管进行分析。每个发酵时间点进行3次重复分析。
发酵结束后，将离心管在4℃条件下，10000rpm离心10min，将上清液保存至-20℃保存备用，沉淀保存至-80℃备用。
(1)结合酚含量的测定
结合酚的提取：将模拟口腔消化、胃液消化、肠液消化和经口腔-胃液-肠液消化后采用结肠发酵所得的上清液分别加入到在2M氢氧化钠溶液中，并在氮气气氛下用磁力搅拌器在室温搅拌18h。然后将混合物用6M盐酸中和后，用乙酸乙酯萃取6次。合并有机相，并在35℃下真空蒸发至干，用85％甲醇复溶，然后定容至10mL，即得结合酚，并在-20℃下保存在冰箱中。
检测：分别取稀释20倍的上述结合酚样品125μL中加入125μL福林酚试剂和蒸馏水(0.50mL)。涡旋震荡均匀后避光反应6min后，依次加入1.25mL Na2CO3溶液(7％，m/v)和1mL蒸馏水。涡旋震荡均匀后，避光反应90min。用Shimadzu UV-1800分光光度计在760nm处测定吸光度。以没食子酸为标准，总酚含量表示为每100克荔枝果肉干重(DW)的没食子酸当量(GAE)含量。
实验结果如图2所示，从图中可以看出，多糖-多酚加合物在模拟体外消化和结肠发酵的过程中总酚含量在不断增加，原因可能是多糖-多酚加合物被各种消化酶水解，但是在结肠发酵后多酚含量达到最高，可能是经过肠道有益菌群的发酵，使更多的多酚释放出来，也表明以结合态形式存在的多酚可以被膳食多糖保护，运送到结肠，发挥更佳益生素效果，调节肠道菌群。
(2)结肠发酵过程中pH的变化
将离心后的发酵管置于冰盒上，使用pH计测量空白对照和采用消化后的荔枝多糖-多酚加合物的发酵过程中不同时间点的pH值的变化。
实验结果如图3所示，从图中可以看出，本发明方案制备的荔枝多糖-多酚加合物通过降低pH，调节肠道菌群，促进肠道菌群增殖，维持结肠微环境健康。
(3)结肠发酵过程中短链脂肪酸的变化
分别取1mL离心后的空白对照组发酵48h和采用消化后的荔枝多糖-多酚加合物发酵48h后的发酵上清液通过0.22μm的水相膜过滤，使用GC-2010plus气相色谱仪测定发酵过程中乙酸、丙酸和丁酸的含量变化情况。气相色谱条件如下：使用DB-FEAP色谱柱，检测器FID，检测温度和进样口温度均为240℃，升温程序70℃—240℃。载气为氮气，流速为30mL/min，分流比为1：9，空气流速为400mL/min，氢气流速为30mL/min。样品进样量为1μL，测定时间为42.47min。
实验结果如图4所示，从图中可以看出，本发明制备的荔枝多糖-多酚加合物可以调控肠道系统中有益的短链脂肪酸甲酸、乙酸、丙酸的产生，调节肠道菌群，促进肠道菌群增殖，来改善结肠微环境健康。
综上所述，通过本发明方案制备的荔枝多糖-多酚加合物可以有效的改善结肠微环境，且相较于干荔枝、荔枝多糖或者是荔枝多酚具有更好的效果。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
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