一种肠道菌群调节剂及应用
阅读说明：本技术 一种肠道菌群调节剂及应用 (Intestinal flora regulator and application thereof ) 是由 张全斌 邓真真 王晶 吴宁 岳洋 耿丽华 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种褐藻褐藻来源的肠道菌群调节剂及应用,该调节剂主要为岩藻多糖,能够调节肠道菌群的结构组成,增加益生菌的相对丰度,维持肠道屏障的完整性并改善肠道细菌的代谢。该肠道菌群调节剂在动物实验水平上已经验证能显著的增加肠道中微疣菌门(Verrucomicrobia)的比例,增加肠道益生菌Akkermansiaceae和Akkermansia-muciniphila的相对丰度,维持肠粘膜的厚度,增加短链脂肪酸(SCFAs)的产生。该肠道菌群调节剂够降低高脂饮食诱导的代谢紊乱小鼠的高血糖、胰岛素抵抗、高脂血症状；保护肝肾功能,减少高尿酸症及非酒精性脂肪肝的发生；并降低机体炎症反应。该肠道菌群调节剂在制备治疗或预防代谢紊乱性疾病的药品、食品和/或保健品中有广泛的应用。(The invention discloses an intestinal flora regulator derived from brown algae and application thereof. The intestinal flora regulator has been verified on an animal experimental level to remarkably increase the proportion of Verrucomicrobia (Verrucomicrobia) in intestinal tracts, increase the relative abundance of intestinal probiotics Akkermansia and Akkermansia _ muciniphila, maintain the thickness of intestinal mucosa and increase the generation of short-chain fatty acids (SCFAs). The intestinal flora regulator can reduce hyperglycemia, insulin resistance and hyperlipidemia symptoms of mice with metabolic disorder induced by high fat diet; protecting liver and kidney function, and reducing hyperuricemia and non-alcoholic fatty liver; and reducing inflammatory response in the body. The intestinal flora regulator can be widely applied to preparation of medicines, foods and/or health products for treating or preventing metabolic disorder diseases.)
技术领域
本发明属于食品保健领域，具体涉及一种来源于褐藻的肠道菌群调节剂及应用。
背景技术
肠道菌群在维持健康方面的关键作用引起了人们的极大兴趣。人类微生物群主要由四个门类组成：放线菌门(Actinobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。据估计，肠道内有多达1000种不同的细菌，其中包括近200万个基因。事实上，胃肠道内的细菌数量大约是人体所有细胞数量的10倍，这使得细菌总基因组远远大于人类基因。因此，人类也被称为“超级有机体”。基于肠道细菌与人类的共生关系，肠道菌群与机体的生理状态产生密不可分的关系。其中，肠道菌群在代谢性疾病中起着至关重要的作用，可能成为预防和治疗此类疾病的潜在药物靶点。肠道菌群是调节体重和能量稳态的重要环境因子，在血糖稳态、空腹血糖受损、2型糖尿病、胰岛素抵抗等方面发挥重要作用。这个“外部”器官通过各种代谢功能和不同的控制方式来调节体内能量的摄入和储存。
海藻多糖已被推荐作为健康增强和疾病管理的补充剂。近年来，岩藻多糖因其广泛的抗氧化、免疫调节、抗炎和抗肥胖等活性而成为潜在的代谢综合征治疗佐剂。此外，作为一种海洋来源的膳食纤维，岩藻多糖对肠道菌群的调节作用也逐渐被人关注。已有研究表明岩藻多糖可以通过改变肠道微生物群来缓解代谢异常，包括降血糖、降血脂、抗肥胖等。考虑到岩藻多糖与肠道菌群的调节可能存在结构依赖关系。不同结构的岩藻多糖对肠道菌群的作用也不同。本发明公开了岩藻多糖作为一种特异增加益生菌Akkermansia_muciniphila的肠道调节剂在改善肠道菌群的结构，提高肠道益生菌的相对丰度，维持肠粘膜的厚度，增加肠道菌群次级代谢产物中的应用及在治疗和预防代谢紊乱相关症状/疾病的食品、药品、保健品中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于褐藻的的肠道调节剂及应用，该肠道菌群调节剂的主要成分为提取自褐藻的岩藻多糖。经动物实验表明此肠道菌群调节剂能够改善肠道菌群紊乱，并改善高脂饮食诱导的代谢失调。
进一步的该肠道菌群调节剂中岩藻多糖的含量为30％-40％，硫酸基的含量为25％-35％，分子量范围为3kDa-9kDa，其中最优为7kDa。该肠道调节剂来源于海洋褐藻包括海带、裙带菜、马尾藻、墨角藻、鹿角菜、泡叶藻、昆布、枝管藻、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、海黍子、海蒿子等褐藻中的一种或两种以上。
本发明的肠道菌群调节剂能够改善肠道菌群的结构，提高肠道益生菌的相对丰度，维持肠粘膜的厚度，增加肠道菌群次级代谢产物。
进一步的肠道菌群调节剂能够改善肠道菌群的结构，具体的是增加肠道中微疣菌门(Verrucomicrobia)的比例，提高拟杆菌门与厚壁菌门的比值。
进一步的肠道菌群调节剂能够提高肠道益生菌的相对丰度，具体的是提高益生菌Akkermansiaceae和/或A.muciniphila的相对丰度(特异增加益生菌Akkermansia_muciniphila)。
其中，Akkermansiaceae可以防止高脂饮食导致的体重增加，修复受损的肠道屏障完整性，降低血液中的内毒素水平，改善胰岛素抵抗。口服Akkermansia被证明可以逆转高脂肪饮食诱导的小鼠的代谢综合症，这表明了一种通过操纵肠道菌群中Akkermansia的丰度来治疗代谢综合症的潜在方法。A.muciniphila一种被广泛关注的肠道益生菌。其特异性的黏液蛋白降解使其成为维持肠道黏膜屏障功能的关键微生物。肠道中A.muciniphila可保护肠道屏障功能，降低血浆内毒素水平，改善机体低度炎症和代谢紊乱。
进一步的肠道菌群调节剂能够增加肠道菌群次级代谢产物，具体的是提高肠道中短链脂肪酸的产生。短链脂肪酸是由一些肠道细菌消化膳食纤维产生的含有少于6个碳原子的短链有机酸，特别是乙酸、丙酸和丁酸。有证据表明短链脂肪酸可降低食欲和/或改变能量代谢以促进机体健康。
本发明的肠道菌群调节剂能够降低高脂饮食诱导的代谢紊乱小鼠的高血糖、胰岛素抵抗、高脂血症状；保护肝肾功能，减少高尿酸症及非酒精性脂肪肝的发生，并降低机体炎症反应。
本发明的肠道菌群调节剂在治疗和预防代谢紊乱相关症状/疾病的食品、药品、保健品中具有广泛的应用。
附图说明
图1.不同分子量的岩藻多糖对HFD小鼠血糖(a)和肠道中A.muciniphila丰度的影响(b)。
图2.肠道菌群调节剂可改善HFD诱导的肠道微生物失调。物种分布图，不同颜色表示不同门分类等级。
图3.LEFse分析各组中具有显著差异的细菌类群。
图4.结肠内容物中短链脂肪酸的水平。数据为均数±标准差(n＝8)。显著性表示为*p<0.05,**p<0.01,vs阴性组；#p<0.05or##p<0.01,vs对照组。
图5.肠道菌群调节剂可改善HFD小鼠的胰岛素抵抗和增加胰岛素敏感性。(a)：肠道菌群调节剂降低HFD小鼠空腹血糖水平；(b)：肠道菌群调节剂降低HFD小鼠空腹胰岛素水平；(c)：血糖随时间的曲线；(d)：肠道菌群调节剂降低HFD小鼠的空腹糖耐量，增加胰岛素0高脂饮食；DFPS1.0-L:100mg/kg/d；DFPS1.0-H:200mg/kg/d；Met:二甲双胍的剂量为200mg/kg/d。数据为均数±标准差。显著性表示为*p<0.05,**p<0.01,vs阴性组；#p<0.05or##p<0.01,vs对照组
图6.肠道菌群调节剂对HFD小鼠肝肾生化指标的影响。(a)：肠道菌群调节剂降低HFD小鼠肝脏指数；(b)：肠道菌群调节剂对谷丙转氨酶(ALT)和谷丙转氨酶(AST)的影响；(c)：肠道菌群调节剂对白蛋白(ALB)和球蛋白(GLOB)的影响。肠道菌群调节剂可显著降低HFD小鼠的尿素氮(urea)(d)、尿酸(UA)(e)和肌酐(CRE)(f)水平。
图7.肠道菌群调节剂可减少肝细胞脂肪变性，脂质沉积，降低肝脏炎症反应和氧化应激。(a):采用苏木精和伊红染色(H&E染色)进行组织学分析。白色脂肪空泡(红色箭头)；细胞气球样改变(黑色箭头)；肝细胞胞浆染色不均匀(绿箭头)；(b):Western blot结果显示，肠道菌群调节剂降低TNFα、IL-6、MCP-1的表达，降低肝脏炎症反应。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明方案作进一步的具体说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
实施例1：不同分子量的岩藻多糖对高脂肪饮食(HFD)诱导的小鼠的血糖和肠道菌群的调节作用
选择海带来源的岩藻多糖FL(1030Da),FM(6000Da),FH(10kDa)四周龄C57BL/6J雄性小鼠，体重20±2g，分为4组，每组6只，饲喂60％脂肪供能的高脂饲料，造模7周后开始给药。FL(1.3Da),FM(7.2kDa),FH(10kDa)灌胃200mg/kg/天，空白组灌胃同等体积的生理盐水。灌胃期间持续饲喂高脂饲料并监测血糖变化。用药8周后，测定小鼠血糖并使用无菌代谢笼收集小鼠粪便用于肠道微生物的分析。
(1)肠道菌群调节剂改善肠道菌群的结构
采用引物341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')扩增肠道细菌16s rDNA的V3+V4区(341-806)。然后将扩增产物汇集、纯化并通过荧光定量仪Qubit 3.0(Thermo fisher technology Co.，New York,USA)进行定量。新一代测序由Illumina Hiseq 2500PE250(Illumina,Inc,California,USA)在广州的基迪奥生物技术有限公司进行。生物信息学分析使用实时交互数据分析在线平台Omicsmart(http://www.omicsmart.com)进行。
图1显示FM和FH在灌胃8周之后，可显著的降低HFD小鼠空腹血糖水平，其中FM显示比FH显示更好的降血糖活性。对肠道细菌进行鉴定，发现FM组小鼠肠道中益生菌A.muciniphila的相对丰度显著性的升高。
实施例2：肠道菌群调节剂改善高脂肪饮食(HFD)诱导的小鼠肠道菌群的紊乱
该实验使用肠道菌群调节剂提取自海带，其中，岩藻糖的含量为33.2％，硫酸基的含量为29.3％，重均分子量为7.2kDa.
选择四周龄C57BL/6J雄性小鼠，体重20±2g，分为5组(空白组-CK组、高脂饮食组-HFD组、岩藻多糖低剂量组-DFPS-L组、岩藻多糖高剂量组-DFPS-H组、二甲双胍组-Met组)，每组12只。空白组饲喂10％脂肪供能的普通饲料。其余4组饲喂60％脂肪供能的高脂饲料，造模7周后开始给药。高脂饮食组灌胃生理盐水，低剂量组灌胃100mg/kg/天，高剂量组灌胃200mg/kg/天，阳性药选择二甲双胍(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)，灌胃剂量为200mg/kg/天。灌胃期间持续饲喂高脂饲料并监测体重、饮食、血糖变化。用药8周后，无菌代谢笼收集小鼠粪便用于肠道微生物的分析。小鼠解剖取血清、肝脏、结肠、结肠内容物等液氮处理之后置于-80℃冰箱备用，用于生化测定及组织形态观察。
(1)肠道菌群调节剂改善肠道菌群的结构
采用引物341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')扩增肠道细菌16s rDNA的V3+V4区(341-806)。然后将扩增产物汇集、纯化并通过荧光定量仪Qubit 3.0(Thermo fisher technology Co.，New York,USA)进行定量。新一代测序由Illumina Hiseq 2500PE250(Illumina,Inc,California,USA)在广州的基迪奥生物技术有限公司进行。生物信息学分析使用实时交互数据分析在线平台Omicsmart(http://www.omicsmart.com)进行。
图1显示，HFD组Firmicutes与Bacteroidetes的比值颠倒(HFD:CK＝0.18/2.95)，Proteobacteria的相对丰度显著高于CK组(1.98％)，为13.62％。而变形菌门是肠道菌群失调的标志。DFPS显著降低了变形菌门的比例，尤其是高剂量组(2.95％)。与HFD小鼠(61.73％)相比，DFPS组的厚壁菌门呈剂量依赖性减少，从23.02％减少到16.97％。如上变化导致两个门(Firmicutes和Bacteroidetes)在整个肠道微生物群中所占的比例减少。HFD小鼠Verrucomicrobia的相对丰度(1.92％)显著低于CK组(15.28％)。而DFPS可使微疣菌门的比例由40.93％增加到67.65％，且呈剂量依赖性。这些变化类似于二甲双胍对肠道微生物群的影响。
(2)肠道菌群调节剂增加肠道益生菌的含量
LEFse分析各组中具有显著差异的细菌类群。与HFD小鼠肠道菌群相比，添加DFPS和添加二甲双胍在特定菌属上表现出相似的差异，其中，Verrucomicrobia特异性增加。在Verrucomicrobia中最具代表性的肠道微生物Akkermansiaceae，在补充DFPS和二甲双胍的小鼠肠道中明显升高。此外，高剂量组和二甲双胍组也出现Akkermansia_muciniphila爆发。DFPS会使肠道菌群结构倾向于二甲双胍对肠水平上还是在物种组成上。PICRUSt2功能预测显示，DFPS显著降低了三种营养物质(碳水化合物、脂肪和蛋白质)的代谢水平，降低了机体的能量代谢水平。
(3)肠道菌群调节剂增加短链脂肪酸的产生
结肠内容物(25mg)用1.5mL水悬浮，用1M HCl溶液调节pH为2-3。冰浴超声提取20分钟，12000rpm离心15分钟。上清加入1ml乙酸乙酯，12000rpm涡流离心15min，取乙酸乙酯层进行气相色谱分析(Agilent 7890a,Agilent Technologies,Ca,USA)。SCFAs标准购自西格玛(Shanghai Sigma Aldrich Trading Co.，Shanghai,China)。
短链脂肪酸是一种短链有机酸，含有少于六个碳原子，是由一些肠道细菌消化膳食纤维产生的。DFPS对肠道菌群的影响使我们关注其对短链脂肪酸的影响。图3显示DFPS在低剂量和高剂量组都能显著增加肠道短链脂肪酸的水平。
实施例3：肠道菌群调节剂改善高脂肪饮食(HFD)诱导的小鼠代谢紊乱
第8周末，小鼠禁食12h，并灌胃2g/kg的D-葡萄糖溶液。小鼠血糖测定采用罗氏金采(ACCU-CHEK Performa)血糖仪(Roche Diagnostics GmbH,Basel,Switzerland)在灌胃后0、30、90和120min测定血糖。绘制葡萄糖变化曲线，通过计算曲线下面积来评估口服葡萄糖耐量(OGTT)。采用稳态模型评价指数(HOMA-IR)评价小鼠的胰岛素抵抗，公式如下:
HOMA-IR指数＝[空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/mL)]/22.5。
第8周末,采集小鼠血清，采用中国青岛金域检测中心全自动生化分析仪(LABOSPECT 008AS，日立高科技有限公司，日本东京)测定血脂生化指标。
高脂饮食(HFD)可显著提高空腹血糖和空腹胰岛素水平(图4a，b)，增加糖耐量，降低胰岛素敏感性。DFPS的降血糖作用呈剂量依赖性。低剂量DFPS可显著降低空腹血糖和糖耐量，恢复胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗(图4e)。HOMA-IR模型也显示DFPS能有效改善HFD小鼠的胰岛素抵抗(图4f)。特别是，大剂量的DFPS具有与二甲双胍相同的降血糖作用。
血脂异常是代谢综合征的一个重要特征，包括TC、CHOL、HDL-C的升高和HDL-C的降低。表1显示HFD造成TG、CHOL和LDL-C显著升高及HDL-C异常升高。DFPS低剂量显著降低CHOL、LDL-C和HDL-C含量，高剂量显著降低TG含量。DFPS对游离脂肪酸(FFA)的降低作用不明显。其中，DFPS在降低CHOL、LDL-C和HDL-C方面优于二甲双胍，提示DFPS有助于恢复脂质稳态。
Table 1.血脂生化指标
Note:血脂生化指标。TG、CHOL、LDL-C、HDL-C、TG,CHOL,LDL-C,HDL-C、游离脂肪酸(FFA)和内脏脂肪指数(VFI)。数据表示为平均值±SD(n＝8).abc表示一行中不是相同字母的组别为显著差异组，通过one-way ANOVA test在p＜0.05的水平.
实施例4：肠道菌群调节剂改善高脂肪饮食(HFD)诱导的小鼠肝肾功能损伤
采用中国青岛金域检测中心全自动生化分析仪(LABOSPECT 008AS，日立高科技有限公司，日本东京)测定肝脏功能、肾脏功能生化指标。
肝脏是机体最大的器官，是调节脂质代谢的中枢器官。血脂异常和肝甘油三酯积累导致肝脏病变，从而影响肝脏的正常功能。血清肝脏生化指标可反映肝脏病变。DFPS降低肝脏脂质积累，表现为肝脏指数下降(图5a)。ALT和AST是肝细胞损伤的敏感指标。当细胞受损和细胞膜通透性增加时，血清中这两种酶的水平都升高。如图5b所示，HFD使ALT和AST水平翻倍，肝细胞明显损伤。DFPS显著降低AST水平，但低剂量对ALT水平无显著影响。大剂量时，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平均显著降低，提示DFPS可降低肝细胞损伤。此外，DFPS还能显著降低GLOB，提示DFPS可减轻肝脏炎症和感染(图5c)。综上所述，补充DFPS可以改善HFD所致的代谢功能障碍。进一步观察DFPS对HFD小鼠肾脏的保护作用。DFPS能显著降低UA、CRE和尿素，甚至达到正常水平(图5d,e,f)，表明DFPS能降低HFD小鼠肾功能不全和高尿症的发生率。
取新鲜肝脏组织进行组织学分析。组织在4％多聚甲醛中浸泡24h，脱水，石蜡包埋。固定组织切成5μm厚的切片，用苏木精和伊红(H&E)染色。切片由数字病理扫描仪(LeicaAperio CS2,Leica Biologic Systems Inc.，Nussloch,Germany)进行扫描，以生成具有代表性的图像。
通过组织学分析进一步分析DFPS对肝脏的影响。从图6a可以看出，HFD增加了肝脏脂肪沉积，改变了肝脏形态。HFD小鼠肝小叶边缘不清楚。肝内脂肪沉积形成白色的脂肪空泡(红色箭头)，肝细胞内脂肪将细胞核推向边缘，使肝细胞呈气球样改变(黑色箭头)。同时，肝细胞胞浆染色不均匀(绿箭头)可提示肝细胞变形或坏死。DFPS减少脂肪空泡数量，未见明显细胞变形或坏死。特别是，高剂量的DFPS甚至能使肝脏的形态恢复到正常水平。组织学观察表明，DFPS能有效减少肝脂肪沉积，减少HFD引起的肝细胞病变。
提取肝蛋白进行western blot。肝组织(20mg)用冷PBS冲洗两次，裂解缓冲液(含0.1mM PMSF和蛋白酶抑制剂)溶解。蛋白浓度采用BCA试剂盒(Solaibao Technology Co.，Beijing,China)测定。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转移到PVDF膜上，用每个抗体进行印迹，用ECL试剂检测。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞化学引诱物蛋白1(MCP-1)和白细胞介素-6(IL-6)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)被测定。
众所周知，慢性炎症在T2DM和MetS[21]的发生发展中起着重要作用。肝脏脂肪的堆积导致炎症细胞因子和氧化应激的增加。Western blot检测肝组织中炎性细胞因子(TNFα、IL-6、MCP-1)的表达。如图6b所示，DFPS有效降低了炎症因子水平，减弱了HFD诱导的炎症反应。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案精神和范围。