具体实施方式

发明人经过广泛而深入地研究。意外地发现了式I化合物(以麦帕克林为例)能够诱导不同的细胞表达或产生I型干扰素(如IFNβ)。此外，麦帕克林还经实验证明麦帕克林对RNA病毒(如VSV)和DNA病毒(如HSV)感染具有广谱的抑制作用(剂量相关)。从而提供了一种具有诱导细胞产生IFNβ，且在临床治疗中具有潜在的广谱抗病毒作用的新药物。基于此，发明人完成了本发明。

固有免疫

宿主的固有免疫是免疫系统抵抗病原微生物的第一道防线。自然界中病毒是一种能够引起多种疾病的病原体，而抗病毒的固有免疫反应能够诱导宿主细胞产生干扰素来抑制病毒的繁殖和扩增。抗病毒固有免疫反应由信号转导通路来介导，前期有关研究揭示了固有免疫系统如何识别病毒入侵进而迅速地触发免疫防御功能，从而有效地清除病毒感染。这是生命科学与医学领域中的重要研究，在分子水平上研究这类课题会为相关药物的设计提供理论依据，为病毒感染的防治带来新的希望。宿主细胞识别病原微生物后通过固有免疫信号通路转导产生干扰素、促炎因子以及细胞趋化因子，这些效应因子一方面可以抑制病原体复制，从而起到快速控制病原体增殖的作用；另一方面这些细胞因子可以动员宿主的其他免疫细胞包括适应性免疫系统中的抗原呈递细胞及T、B淋巴细胞，激活适应性免疫。除此之外，固有免疫反应的诱导激活还具有抗肿瘤的作用，它能够强化放疗和化疗的效果。

固有免疫信号通路起始于宿主细胞的模式识别受体对病原微生物的相关分子模式的识别。目前已经发现的与病毒感染相关的固有免疫信号通路主要包括细胞质中识别RNA病毒的RLRs-MAVS信号通路和识别DNA病毒的cGAS-STING信号通路，以及TLRs信号通路。RLRs和cGAS这两条信号通路激活后都通过下游的转导蛋白招募并激活TBK1，激活的TBK1使转录因子IRF3发生磷酸化入核诱导I型干扰素的产生，最终达到抑制病毒的效果。在长期进化过程中，有些病毒也获得了一些逃逸固有免疫反应的机制。

由于固有免疫在机体生命活动的各个环节都扮演着重要的角色，固有免疫对于疫苗的研制和药物的开发都具有重要的指导意义。

术语

如本文所用，“C_1-6烷基”，本身或作为其他基团的一部分(如-O-C_1-6烷基中的C_1-6烷基)，是指包括1-6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基(如正丙基、异丙基)、丁基(如正丁基、异丁基、叔丁基)、或类似基团。应当理解，除非特别说明，烷基应包括其所有可能存在的所有异构形式，如“丙基”包括正丙基和异丙基。类似地，“C_1-4烷基”是指包括1-4个碳原子的直链或支链的烷基。

如本文所用，术语“环烷基”是指具有指定环原子数(例如，C_3-10环烷基)并且完全饱和的或在环顶之间具有不超过一个双键的烃环。“环烷基”也指双环和多环烃环。术语“杂环烷基”是指具有指定环原子数(例如，5至10元杂环烷)，且含有1至5个(如1、2或3个，较佳地，1或2个)选自N、O和S的杂原子作为环原子的环烷基，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选被季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环体系。杂环烷基可以经环碳或杂原子连接于分子的其余部分。优选地，环烷基或杂环烷基是饱和的。

除非另有表述，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”等术语表示包括单卤代烷基或多卤代烷基。例如，术语“C_1-4卤代烷基”表示包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有表述，术语“芳基”或“芳环”是指多不饱和的(通常芳香性)的烃基或烃环，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多二环)。术语"杂芳基"是指含有1至5个(较佳地，1、2或3个)选自N、O和S的杂原子作为环原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基，而杂芳基的非限制性例子包括吡啶基等。

对于本文提供的化合物，从取代基(通常为R基团)到环(例如环苯，苯基等)的中心的键将被理解为是指在环上的任何可用顶点提供连接的键。

在本文中，除非特别说明，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、未取代或卤代的C_1-6烷基。

如本文所用，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，术语“选择指数”可以用于判断药物效果的安全范围，选择指数大于1.00以上为有效，指数越大安全范围越大。

活性成分

如本文所用，术语“本发明化合物”指式I所示的化合物。该术语还包括式I化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、异构体、水合物、溶剂合物或前药。

其中，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有机酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐，例如碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如镁盐或钙盐)、铵盐(如低级的烷醇铵盐以及其它药学上可接受的胺盐)，例如甲胺盐、乙胺盐、丙胺盐、二甲基胺盐、三甲基胺盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、叔丁基胺盐、乙二胺盐、羟乙胺盐、二羟乙胺盐、三羟乙胺盐，以及分别由吗啉、哌嗪、赖氨酸形成的胺盐。

如本文所用，术语“溶剂合物”指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。“水合物”是指本发明化合物与水进行配位形成的配合物。

如本文所用，术语“前药”包括其本身可以是具有生物学活性的或非活性的前药，当用适当的方法服用后，其在人体内进行代谢或化学反应而转变成式I的一类化合物，或式I的一个化合物所组成的盐或溶液。所述的前药包括(但不局限于)所述化合物的羧酸酯、碳酸酯、磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、砜酯、亚砜酯、氨基化合物、氨基甲酸盐、偶氮化合物、磷酰胺、葡萄糖苷、醚、乙缩醛等形式。

在一个具体实施例中，本发明的化合物为麦帕克林(Mepacrine)。

在本文中，麦帕克林(Mepacrine)又称quinacrine或者阿的平，是一种广泛应用于疟疾防治，对条虫病、阿米巴痢疾、梨形(虫便)虫病、阴道滴虫病，以及红斑狼疮和类风湿性关节炎等方面有应用疗效的药物，其结构如式IV-a所示(盐酸盐形式)：

药物组合物和施用方法

由于本发明化合物具有优异的诱导I型干扰素产生和/或抗病毒(抑制病毒感染)的能力，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解与I型干扰素相关的疾病(尤其是那些能够通过调节体内干扰素水平如使干扰素水平增加从而被改善、治疗或预防的疾病)和/或病毒感染相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：病毒感染、多发性硬化症、系统性红斑狼疮和慢性粒细胞白血病等。典型地，这些病毒可以是RNA病毒和/或DNA病毒；示例性的DNA病毒包括(但不限于)：HSV(单纯疱疹病毒)、HBV(乙肝病毒)、HAV(甲肝病毒)、HPV(人乳头瘤病毒)和/或EBV(EB病毒)；在本文中，RNA病毒可以是：ss(+)RNA病毒、ss(-)RNA病毒(如VSV、甲型流感病毒等等)、RNA病毒(如轮状病毒)等，示例性的RNA病毒包括(但不限于)：VSV(水疱性口炎病毒)、HCV(丙肝病毒)、EMCV(脑心肌炎病毒)、Ebola(埃博拉病毒)、HIV(艾滋病毒)、禽流感病毒、流感病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒和/或丙型流感病毒)、副流感病毒、冠状病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒和/或寨卡病毒(Zika virus)。

如本文所用，术语“诱导产生干扰素”、“诱导产生I型干扰素”、“诱导I型干扰素的产生”或“诱导干扰素的产生”可以互换使用，意在包括：提升I型干扰素或与I型干扰素相关的蛋白、细胞因子等的表达、转录或蛋白含量水平等。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

单纯疱疹病毒

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是疱疹病毒的典型代表，由于感染急性期发生水疱性皮炎即单纯疱疹而得名。能引起人类多种疾病，如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。

水疱性口炎病毒

VSV为弹状病毒科(Rhabdoviridae)、水疱病毒属(Vesiculovirus)的成员，病毒粒子为子弹状或圆柱状，长度约为直径的3倍，大小为150～180nm×50～70nm。病毒有囊膜，囊膜上均匀密布有长约10nm的纤突。病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳。

冠状病毒

冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒。

流感病毒

流行性感冒病毒简称流感病毒,常见的流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。

流感病毒引起的临床症状包括急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的化合物(如麦帕克林(Mepacrine))表现出优异的诱导干扰素(如IFNβ)表达的能力。

(b)本发明的化合物(如麦帕克林)具有优异的抑制病毒感染能力以及抗病毒活性。

(c)本发明的化合物(如麦帕克林)具有极低的细胞毒性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

1.材料和试剂

DMEM及RPMI 1640培养基购于Hyclone公司，胎牛血清(FBS)购于ExCell公司，qPCR试剂盒购于Tiangen公司，Cell-Titer-Glo试剂盒购于Promega公司。麦帕克林从中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学平台申领。

2.细胞培养

所用HEK293购于ATCC。所用HEK293T细胞系，THP-1细胞系，A549细胞系以及Vero细胞系购于上海生科院细胞库。单细胞层在37℃和5％CO2培养箱中培养，细胞生长在含10％FBS及100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中。THP-1细胞生长在含10％FBS及100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基中。

实施例1本发明化合物诱导细胞产生IFN

1.1)将处于对数生长期的HEK293、HEK293T、THP-1及A549等多种细胞分别传入12孔细胞培养板，每孔的细胞量为5×10⁵，待细胞贴壁6小时后，将细胞培养上清分别换置成含有终浓度为1μM，3μM和10μM麦帕克林的培养基，并继续培养12小时，最终收集细胞，提取细胞总RNA。

接着利用qPCR检测HEK293、HEK293T、THP-1及A549等多种细胞在药物处理下诱导IFNβmRNA的表达情况，结果如图1，图2，图3，和图4所示.

可见麦帕克林可以诱导细胞的IFNβ转录水平升高。而在HEK293和HEK293T细胞中IL-6和TNFα的转录水平没有十分明显的升高。

1.2)将处于对数生长期的HEK293、HEK293T、THP-1及A549等多种细胞分别传入12孔细胞培养板，每孔的细胞量为5×10⁵，待细胞贴壁6小时后，将细胞培养上清分别换置成含有终浓度为1μM，3μM和10μM麦帕克林的培养基，并继续培养12小时，最终收集细胞培养上清。

利用ELISA检测细胞培养上清中的IFNβ，TNFα以及IL-6的含量，结果如图5所示，由图中可以看出麦帕克林可以诱导A549细胞分泌IFNβ。

实施例2本发明化合物对RNA病毒VSV感染的作用

(2.1)本实施例中选用水泡性口炎病毒VSV作为RNA病毒的代表；具体使用VSV-GFP病毒株(受赠于美国西南医学中心)，即VSV自身能够表达绿色荧光蛋白GFP，有利于指示病毒的增殖和载量。

将处于对数生长期的Vero细胞分别传入12孔细胞培养板，每孔的细胞量为5×10⁵，待细胞贴壁6小时后，将细胞培养上清分别换置成含有不同终浓度的麦帕克林(或DMSO)和滴度为0.5的VSV-GFP的培养基，并继续培养16小时。此时，弃去细胞培养上清，并将细胞固定后，利用Hoechst(一种染细胞核的荧光染料)染细胞核，置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况和细胞核染色情况。结果如图6所示。

由图6可以看出，发现药物处理组与对照组即DMSO处理组相比，VSV病毒表达的GFP的信号明显减弱，表明VSV-GFP感染受到抑制。并且，这种抑制作用随着药物浓度升高而增强。

(2.2)在VSV-GFP感染Vero细胞条件下，用不同浓度麦帕克林处理后，根据病毒受到抑制的程度计算出了麦帕克林对VSV-GFP感染抑制作用的EC50(半数有效浓度)为1.504μM，SI(选择指数)为100.8(图7)。可见，麦帕克林具有优异的抗病毒活性以及安全性。

实施例3本发明化合物对DNA病毒HSV感染的作用

(2.1)类似实施例2，本实施例选用单纯疱疹病毒HSV作为DNA病毒的代表；具体使用HSV-1-GFP病毒株(受赠于中国科学院上海巴斯德研究所)，即HSV自身能够表达绿色荧光蛋白GFP，可指示病毒的增殖和载量。

将处于对数生长期的Vero细胞分别传入12孔细胞培养板，每孔的细胞量为5×10⁵，待细胞贴壁6小时后，将细胞培养上清分别换置成含有不同终浓度的麦帕克林(或DMSO)和滴度为0.5的HSV-GFP的培养基，并继续培养16小时。此时，弃去细胞培养上清，并将细胞固定后，利用Hoechst染细胞核，置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况和细胞核染色情况。结果如图8所示。

由图8可以看出，麦帕克林对于HSV病毒感染具有明显抑制作用。

(2.2)在HSV-GFP感染Vero细胞条件下，用不同浓度麦帕克林处理后，根据病毒受到抑制的程度计算出了麦帕克林对HSV-GFP感染抑制作用的EC50(半数有效浓度)为1.629μM，SI(选择指数)为93.1(如图9所示)。可见，麦帕克林具有优异的抗病毒活性以及安全性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。