具体实施方式

一些核酸测序技术利用与核苷酸中糖分子的氧原子连接的3'OH封端基团。3'OH封端基团可用作仅允许在每个测序循环中发生单碱基掺入的可逆终止剂。更具体地，在一些情况下，将移除3'OH封端基团以开始下一个测序循环。核苷酸掺入的暂时终止允许有时间洗去未掺入的核苷酸，激发附接到掺入的核苷酸上的可检测标记(例如，荧光染料)，对激发的可检测标记进行成像(举几个例子)。

本文公开了一种催化性聚合物水凝胶。该催化性聚合物水凝胶的催化剂是反应性分子或其部分，其加速3'OH封端基团从掺入的核苷酸裂解。可将催化剂选择成使得其在掺入事件期间不具有活性。可将催化剂选择用于在解封期间(在掺入和成像之后)发生的反应，因此可加速任何3'OH封端基团的裂解。在某些实施方案中，催化剂可用于在水性溶液中更稳定但往往表现出较慢解封动力学的3'OH封端基团。在这些情况下，催化剂可有助于减少每个测序循环的时间，有助于减少总的测序周转时间，并且有助于减少当解封缓慢时可能发生的定相问题(仅举几个好处)。

在3'OH封端基团的裂解期间，可发生一系列反应。图1描绘了3'OH封端的核苷酸10的示例的该系列反应的一个示例。3'OH封端的核苷酸10包含杂环碱基B、糖(在图1中示出为脱氧核糖)、一个或多个磷酸基团P以及附接到糖的3'OH封端基团12。在该示例中，3'OH封端基团12是叠氮甲基。在图1的步骤1中，添加膦(PR₃，其中R为H或(CH₂)_nOH(n＝1-3))以与叠氮化物反应。该反应导致氮损失并形成亚氨基正膦。在步骤2处，将亚氨基正膦水解以形成半胺缩醛醚，并且在步骤3处，将半胺缩醛醚水解以显露3'OH。对于图1所示的解封，可将加速图1的2和/或3处的水解步骤的任何催化剂掺入聚合物水凝胶中或聚合物水凝胶上，或者可将加速图1的步骤1中的反应的任何催化剂掺入聚合物水凝胶中或聚合物水凝胶上。当具体选择催化剂来催化图1的步骤1时，催化剂加速3'OH封端基团12的外部保护基团(例如，图1所示的叠氮基团)的移除，并且裂解混合物中的试剂可用于移除3'OH封端基团12的内部保护基团(例如，图1所示的–CH₂–)。

虽然图1示出了解封的一个示例，但应当理解，所用的催化剂可取决于3'OH封端基团以及用于裂解该3'OH封端基团的反应。

定义

应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。

除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。

术语“包含”、“包括”、“含有”和这些术语的各种形式彼此同义，意在是同样广泛的。

术语“顶部”、“底部”、“下部”、“上部”、“上”等在本文中用来描述流通池和/或流通池的各种部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。

“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包括具有该结构的丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰氨基戊基丙烯酰胺：和N-异丙基丙烯酰胺：可使用其他丙烯酰胺单体，本文阐述了其中的一些示例。

如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不含有双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。示例性烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-C6烷基”指示烷基链中存在一至六个碳原子，即烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。

如本文所用，“烯基”是指含有一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。

如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指含有一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。

如本文所用，“芳烷基”和“芳基(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基基团连接的芳基基团。芳烷基的低级亚烷基和芳基基团可以是取代的或未取代的。示例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。

如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基(azulenyl)和蒽基。

“胺”或“氨基”官能团是指-NR_aR_b基团，其中R_a和R_b各自独立地选自氢(例如)、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所定义。

如本文所用，术语“附接”是指两个事物彼此直接或间接接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到聚合物水凝胶。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。

“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N₃。

术语“嵌段共聚物”和“在嵌段中”形成的单体单元是指当两个或更多个单体聚集在一起并形成重复单元的嵌段时形成的共聚物。每个嵌段应具有不存在于相邻嵌段中的至少一个特征和/或至少一个嵌段特异性官能团(例如，叠氮化物，用于附接引物、催化剂等)。

如本文所用，术语“催化性聚合物水凝胶”是指具有整合到单体单元中的一个单体单元的催化剂的共聚物，或者是指具有附接到其上的催化剂的初始聚合物水凝胶。如本文所用，术语“初始聚合物水凝胶”是指在引入催化剂的任何反应/相互作用之前的聚合水凝胶。

如本文所用，“碳环基”意味着在环系骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可具有3至20个碳原子。碳环基环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、二环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。

如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。

如本文所用，“环烷基”是指完全饱和(无双键或三键)的单环或多环烃环系。当由两个或更多个环构成时，环可以稠合方式接合在一起。环烷基基团可在环中含有3至10个原子。在一些实施方案中，环烷基基团可在环中含有3至8个原子。环烷基基团可以是未取代的或取代的。示例性环烷基基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。

如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中环系中没有环是芳族的。一个示例是环辛炔。另一个示例是二环壬炔。

如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可以是手动的或自动的，并且在一些情况下，引起表面特性改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂布技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、泡涂或浸涂、刮涂刀涂布、搅打分配、流经涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。

如本文所用，术语“凹陷”是指基底或图案化树脂中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有至少部分地被基底或图案化树脂的间隙区域包围的表面开口。凹陷可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与表面正交截取的凹陷横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线形的、圆锥形的、角形的等。例如，凹陷可以是阱或两个互连的阱。凹陷还可具有更复杂的架构，诸如脊、台阶特征部等。

在用于指代项目集合时，术语“每个”旨在标识集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每一个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。

如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的室(例如，流动通道)、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，室使得能够检测在室中发生的反应。例如，室可包括允许对阵列、光学标记的分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。

如本文所用，“流动通道”或“通道”可以是限定在两个粘结的或以其他方式附接的部件之间的区域，所述部件可选择性地接收液体样品。在一些示例中，流动通道可限定在图案化或非图案化基底与盖之间，因此可与限定在图案化树脂中的一个或多个凹陷流体连通。流动通道也可限定在粘结在一起的两个图案化或非图案化基底表面之间。

如本文所用，“杂环胺”是指在环主链中含有胺氮作为一个或唯一杂原子的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。

如本文所用，“杂芳基”是指在环主链中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员(即，构成环主链的原子数)。

如本文所用，“杂环基”是指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。

如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH₂基团。

如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指基团，其中R_a和R_b各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所定义。

如本文所用，“羟基”是指–OH基团。

如本文所用，术语“间隙区域”是指例如基底、图案化树脂或其他支撑件的分离凹陷的区域。例如，间隙区域可将阵列的一个凹陷与阵列的另一个凹陷分开。彼此分开的两个凹陷可以是离散的，即没有彼此的物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而凹陷是离散的，例如，限定在以其他方式连续的表面中的多个凹陷就是这种情况。在其他示例中，间隙区域和特征部是离散的，例如，被相应间隙区域分开的多个沟槽就是这种情况。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与限定在表面中的凹陷的表面材料不同的表面材料。例如，凹陷中可具有聚合物和引物组，并且间隙区域上可既不具有聚合物也不具有引物组。

如本文所用，“腈氧化物”是指“R_aC≡N⁺O^-”基团，其中R_a在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(Cl)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。

如本文所用，“硝酮”是指基团，其中R₁、R₂和R₃可以是本文定义的R_a基团和R_b基团中的任一者。

如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的修饰衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)。

“图案化树脂”是指可具有限定在其中的凹陷的任何聚合物。树脂以及用于使树脂图案化的技术的具体示例将在下文中进一步描述。

如本文所用，术语“膦酸”是指R-PO₃H₂。

如本文所用，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)。本文称为扩增引物的一些引物用作模板扩增和簇生成的起始点。本文称为测序引物的其他引物用作DNA或RNA合成的起始点。引物的5'末端可被修饰以允许与聚合物的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数量的碱基长度并且可包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物是短链，在10至60个碱基或20至40个碱基范围内。

如本文所用，“间隔层”是指将两个部件粘结在一起的材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料，或者可与有助于粘结的辐射吸收材料接触。

术语“基底”是指其上可添加流通池的各种部件(例如，催化性聚合物水凝胶、引物等)的结构。基底可以是晶片、面板、矩形片材、管芯或任何其他合适的构型。基底通常为刚性的并且不溶于水性液体。基底对用于对凹陷进行改性或存在于凹陷中的化学过程可能是惰性的。例如，基底对用于形成催化性聚合物水凝胶、附接引物的化学过程等可能是惰性的。基底可以是单层结构或多层结构(例如，包括支撑件和支撑件上的图案化树脂)。合适的基底的示例将在下文中进一步描述。

如本文所用，术语“磺酸”是指-S(＝O)₂-OH。

“硫醇”官能团是指-SH。

如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。

如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。

催化性聚合物水凝胶

催化性聚合物水凝胶的任何示例中的聚合物主链可以是液体和气体可渗透的半刚性聚合物材料。在一些示例中，催化性聚合物水凝胶包括其上附接有催化剂的初始聚合物水凝胶。在这些示例中，使用后聚合处理将催化剂添加到初始聚合物水凝胶。在其他示例中，催化性聚合物水凝胶可以是在其单体组分中的一种中包含催化剂的共聚物。

初始聚合物水凝胶的示例包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)PAZAM。PAZAM和一些其他形式的丙烯酰胺共聚物由以下结构(I)表示：

其中：

R^A选自由叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的炔烃、卤素、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇组成的组；

R^B为H或任选取代的烷基；

R^C、R^D和R^E各自独立地选自由H和任选取代的烷基组成的组；

-(CH₂)_p-中的每一者可为任选取代的；

p为1至50范围内的整数；

n为1至50,000范围内的整数；并且

m为1至100,000范围内的整数。

本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中重复出现的“n”和“m”特征的排列是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。

PAZAM和其他形式的丙烯酰胺共聚物的分子量可在约5kDa至约1500kDa或约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kDa。

在一些示例中，PAZAM和其他形式的丙烯酰胺共聚物是线型聚合物。在一些其他示例中，PAZAM和其他形式的丙烯酰胺共聚物是轻度交联的聚合物。

在其他示例中，初始聚合物水凝胶可以是结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可被替换，其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基(而不是丙烯酰胺情况中的H)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了重复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。

作为初始聚合物水凝胶的另一个示例，结构(I)中重复出现的“n”特征可被具有结构(II)的包含杂环叠氮基基团的单体替换：

其中R¹为H或C1-C6烷基；R₂为H或C1-C6烷基；L为包括直链的接头，其具有2至20个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上10个任选的取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为N取代的酰胺，其具有附接到N的H或C1-C4烷基；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。

作为又一个示例，初始聚合物水凝胶可包含结构(III)和(IV)中的每一者的重复单元：

其中R^1a、R^2a、R^1b和R^2b中的每一者独立地选自氢、任选取代的烷基或任选取代的苯基；其中R^3a和R^3b中的每一者独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的苯基或任选取代的C7-C14芳烷基；并且L¹和L²中的每一者独立地选自任选取代的亚烷基接头或任选取代的杂亚烷基接头。

应当理解，其他分子可用于形成初始聚合物水凝胶，只要它们被官能化为将寡核苷酸引物接枝到其上。合适的聚合物层的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或聚合物网状结构，诸如明胶；或交联聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化型式。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或包含乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的初始聚合物水凝胶的其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。包含丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星形聚合物、星形形状或星形嵌段聚合物、树枝状体等。例如，可将单体(例如，丙烯酰胺、包含催化剂的丙烯酰胺等)无规或以嵌段掺入星形形状聚合物的支链(臂)中。

初始聚合物水凝胶可使用任何合适的共聚过程形成。然后可将催化剂附接到初始聚合物水凝胶以形成催化性聚合物水凝胶。多种不同的后聚合技术可用于将催化剂附接到初始聚合物水凝胶。

在一个示例中，可将催化剂接枝到初始聚合物水凝胶。在该示例性方法中，形成催化性聚合物水凝胶涉及合成初始聚合物水凝胶(其不包含催化剂)；以及将催化剂接枝到初始聚合物水凝胶。在一个示例中，接枝涉及点击化学反应，例如铜催化的点击化学，或使用应变促进的无催化剂点击化学，诸如利用二环[6.1.0]壬-4-炔(BCN)。在一种情况下，点击化学反应使得催化剂共价附接到初始聚合物水凝胶。应当理解，发生的反应将取决于初始聚合物水凝胶和催化剂的化学性质。

可将增加从掺入的核苷酸裂解3'OH封端基团的化学反应速率的任何反应性分子、官能团等用作催化剂。应当理解，可将任何酸催化剂、碱催化剂、有机催化剂、酶催化剂、肽催化剂或DNA酶催化剂接枝到初始聚合物水凝胶。列出的催化剂中的一些可属于列出的催化剂类别中的两种。在一些具体示例中，解封催化剂选自由以下项组成的组：膦酸；杂环胺；酶；肽；DNA酶；金属-配体络合物的金属；有机催化剂，该有机催化剂选自由脲、硫脲、咪唑、胍、1,8-二氮杂二环(5.4.0)十一碳-7-烯以及它们的组合组成的组；以及光酸发生剂。

在一些示例中，催化剂是选自由羧酸、膦酸、磺酸以及它们的组合组成的组的酸催化剂。酸催化剂可催化解封期间发生的水解反应。

在其他示例中，催化剂是选自由胺、杂环胺以及它们的组合组成的组的碱催化剂。路易斯碱(诸如硫醚、三唑、咪唑等)可特别适用于催化叠氮膦反应(图1中的步骤1)。碱催化剂可催化解封期间发生的水解反应。

有机催化剂由存在于有机化合物中的碳、氢、硫和/或其他非金属元素组成，并且增加去保护化学反应的速率。示例性有机催化剂可选自由脲、硫脲、咪唑、胍、1,8-二氮杂二环(5.4.0)十一碳-7-烯以及它们的组合组成的组。

酶催化剂可以是水解酶。合适的水解酶的示例包括磷酸酶、酯酶(例如，乙酰胆碱酯酶、脂肪酶等)、序列特异性蛋白酶(例如，TEV蛋白酶或凝血酶)和糖苷酶(其不降解核糖，诸如纤维素或淀粉酶)。另一种合适的水解酶是碳酸酐酶。另一种酶催化剂是丝氨酸蛋白酶，其裂解蛋白质中的肽键并且可催化酰胺和酯的水解。

其他催化剂包括DNA酶，其也被称为脱氧核糖酶。示例性DNA酶包括靶向酯基团水解的那些，诸如酶的DNA模拟物，诸如酯酶。在这些示例中，去保护化学反应由DNA酶催化。

虽然已经提供了若干示例，但据信可使用任何可用的酶或工程改造的酶，只要该酶能够催化3'OH封端基团的脱保护。

肽催化剂的示例包括具有疏水外部和富含组氨酸的孔内部的超分子β-桶酯酶、自组装肽催化剂以及其他催化肽组装物。在这些示例中，去保护化学反应由肽催化。

作为另一个示例，催化剂可经由非共价附接掺入初始聚合物水凝胶的表面。非共价附接可包括例如与初始聚合物水凝胶表面接枝的寡核苷酸、氢键合阵列、生物素-链霉亲和素或其他类似键、金属-配体络合等杂交。

图2示意性地示出了催化剂的非共价附接的一个示例。具体地，图2示出了附接到初始聚合物水凝胶16的寡核苷酸14，并且催化剂18附接到与寡核苷酸14杂交的互补寡核苷酸系链20。附接到初始聚合物水凝胶16的寡核苷酸14可如本文参考图3A至图3C针对扩增引物(例如，通过末端叠氮化物处的点击化学)所述那样接枝。寡核苷酸14可具有5至20个核苷酸(如图2中的N所示)，并且该序列可与扩增引物的序列(下文讨论)相同或不同。催化剂18附接到系链20，该系链具有与寡核苷酸14互补的序列。可根据图2所示的示例附接的催化剂18包括酸催化剂、碱催化剂、有机催化剂(例如，咪唑、胍等)、铜催化剂、酶催化剂、肽催化剂或DNA酶催化剂中的任一种。

合适的铜催化剂可包括铜(I)催化剂，诸如乙酸铜(I)、溴化铜(I)、氯化铜(I)、碘化铜(I)、双(1,3-双(2,6-二异丙基苯基)咪唑-2-亚基)四氟硼酸铜(I)、双[(四丁基碘化铵)碘化铜(I)]、[双(三甲基甲硅烷基)乙炔](六氟乙酰丙酮基)铜(I)、溴三(三苯基膦)铜(I)、氯(1,5-环辛二烯)铜(I)二聚体、3-甲基水杨酸铜(I)等。

用于形成图2所示的催化性聚合物水凝胶16'的方法的一个示例涉及合成初始聚合物水凝胶16(其不包含催化剂18)；将寡核苷酸14接枝到初始聚合物水凝胶16；以及使互补寡核苷酸系链20与寡核苷酸14杂交，其中催化剂18附接到互补寡核苷酸系链20。

催化剂18非共价附接到初始聚合物水凝胶16的另一个示例涉及氢键合阵列。在该示例中，催化剂18与聚合物水凝胶16氢键合。可使用任何氢键合对，其中该对的一种组分共价附接到初始聚合物水凝胶，并且该对的另一种组分附接到催化剂18。氢键合对的示例包括O…H、NH…N和CH…N(仅举几例)。

催化剂18非共价附接到初始聚合物水凝胶16的又一个示例涉及金属-配体络合。在一个示例中，催化剂18是附接到初始聚合物水凝胶16的金属-配体络合物的金属。催化剂18可以是任何合适的催化金属，诸如铜、钯、钌等。催化金属与配体络合，该配体附接到初始聚合物水凝胶16。金属-配体络合物的示例包括铜(II)与配体诸如双(2-吡啶基甲基)-胺或吡啶官能化的环糊精的络合物。

用于形成催化性聚合物水凝胶16'的该示例的方法的一个示例涉及合成初始聚合物水凝胶16；以及将金属-配体络合物附接到初始聚合物水凝胶16，其中金属-配体络合物的金属是催化剂18。

可附接到初始聚合物水凝胶16的其他催化剂18包括光酸发生剂。当将光酸发生剂用作催化剂18时，催化活性可在暴露于外部刺激(诸如波长与特定光酸发生剂相匹配的光子)时被引发或增强。

光酸发生剂催化剂可通过客体-主体化学过程附接到聚合物水凝胶16'，在该化学过程中，催化剂18是客体，并且主体能够i)附接到聚合水凝胶16'，并且ii)保持客体直至受外部刺激。示例性主体化合物包括葫芦脲和环糊精。客体类型的光酸发生剂催化剂的一个示例是基于蓝光/可见光的光酸发生剂。也可将光引发的催化剂(例如，光酸发生剂)用作客体-主体示例中的客体。

可使用本文所公开的后聚合技术(例如，接枝、非共价附接)中的任一种将客体-主体分子附接到初始聚合物水凝胶16。

虽然已经提供了若干示例，但应当理解，附接到初始聚合物水凝胶16的催化剂18可部分地取决于初始聚合物水凝胶16的化学性质以及待引入催化性聚合物水凝胶16'的核苷酸10上所包含的封端基团12的化学性质。

在本文所公开的其他示例中，不使用初始聚合物水凝胶16。相反，共聚产物是催化性聚合物水凝胶16'。在这些示例中，将催化剂18整合到在共聚期间使用的单体单元中。

在这些示例中，催化剂18可以是本文针对初始聚合物水凝胶16所述的任何丙烯酰胺单体单元的一部分。例如，结构(I)中的R^A可为羧基基团，其是酸催化剂的一个示例。又如，结构(II)中的R₂可为C1-C6烷基，并且催化剂18可作为C1-C6烷基链的端基掺入。可使包含催化剂的单体单元与本文所述的任何丙烯酰胺单体单元共聚(无规或以嵌段)，只要这些单元中的一种包含引物接枝官能团。可使用的包含催化剂的丙烯酰胺单体单元的一个示例在结构(V)中示出：

其中R⁴为H或CH₃，并且X为用作催化剂的官能团。在一些示例中，该催化剂(X)可以是本文所公开的酸催化剂、碱催化剂或有机催化剂的任何示例。在一些示例中，连接基团(诸如烷基基团、短聚(乙二醇)链等)可位于NH与催化剂(X)之间。

可使用的包含催化剂的单体单元的其他示例包括其上附接有催化剂(X)的(甲基)丙烯酸类单体(例如，丙烯酸、甲基丙烯酸)。

在一个示例性方法中，形成催化性聚合水凝胶16'涉及使包含引物接枝官能团的第一单体(例如，叠氮化物)与包含催化剂18的第二单体共聚。在一些示例中，第三丙烯酰胺单体单元也可用于共聚过程中。通过该方法形成的共聚物的一个示例在结构(VI)中示出：

其中R^A、R^B、R^C、R^D、R^E和p如针对结构(I)所述，X如针对结构(V)所述，并且n和r独立地在5摩尔％至30摩尔％范围内，并且m为剩余的摩尔％。

在一个示例中，催化剂18的表面浓度可在聚合物水凝胶16'的重复单元的约0.01％至约50％范围内。这些浓度可超过实际催化剂溶液浓度，这有助于实现本文所公开的示例的高效率。

在其他示例中，亲核试剂响应性官能团可用作催化剂18的锚定剂或原位生成催化剂的锚定剂。在一些示例中，亲核试剂响应性官能团是环状磺酸酯(诸如磺内酯环)，其在暴露于亲核试剂时、在一些情况下在碱性(高pH)条件(诸如pH 9或更高)下可发生开环反应。磺内酯的开环反应的一个示例是：

在一个示例中，该开环反应可在解封期间进行，使得原位生成催化剂18，诸如酸或碱。可将亲核试剂响应性官能团视为附接到催化性聚合水凝胶16'的催化剂前体。

在另一个示例中，“Nu”是催化剂18，并且开环反应与之前的磺内酯形成共价键。该反应可在测序之前形成，使得当进行解封时存在催化剂18。

亲核试剂响应性官能团的其他示例具有以下结构：

其中(a)Y为SO₂，并且Y'为CH₂；或者(b)Y和Y'均为C(O)。在其他方面，亲核试剂响应性官能团为：合适的亲核试剂包括伯烷基胺和烷基醇。

在一些方面，包含亲核试剂响应性官能团的单体为：

在具体示例中，该单体为：

流通池

聚合物水凝胶16和掺入的催化剂18可用于流通池22中，该流通池的示例在图3A中示出。流通池22包括基底24以及基底24上的催化性聚合物水凝胶16'。

基底24可以是单层/材料。合适的单层基底的示例包括：环氧硅氧烷、玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si₃N₄)、氧化硅(SiO₂)、五氧化二钽(Ta₂O₅)或其他氧化钽(TaO_x)、氧化铪(HfO₂)、碳、金属、无机玻璃等。基底24也可以是多层结构。多层结构的一些示例包括玻璃或硅，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。多层结构的其他示例包括其上具有图案化树脂的底层支撑件(例如，玻璃或硅)。多层基底的其他示例可包括绝缘体上硅(SOI)基底。

在一个示例中，基底24可具有约2mm至约300mm范围内的直径，或其最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在一个示例中，基底24是直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底24是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底24。又如，可使用为矩形支撑件的面板，该矩形支撑件具有比300mm圆形晶片更大的表面积。

在图3A所示的示例中，流通池22包括流动通道26。虽然示出了若干流动通道26，但应当理解，流通池22中可包括任何数量的通道26(例如，单个通道26、四个通道26等)。每个流动通道26是限定在两个附接的部件(例如，基底24与盖或两个基底24)之间的区域，这两个附接的部件可将流体(例如，本文所述的那些)引入其中并从其移除。每个流动通道26可与其他流动通道26彼此隔离，使得引入任何特定流动通道26中的流体不会流入任何相邻的流动通道26中。引入流动通道26中的流体的一些示例可引入反应组分(例如，聚合酶、测序引物、核苷酸等)、洗涤溶液、解封剂等。

可使用部分地取决于基底24的材料的任何合适的技术将流动通道26限定在基底24中。在一个示例中，将流动通道26蚀刻到玻璃基底24中。在另一个示例中，可使用光刻术、纳米压印光刻术等将流动通道26图案化到多层基底24的树脂中。在又一个示例中，可将单独的材料(未示出)施加到基底24上，使得单独的材料限定流动通道26的壁，并且基底24限定流动通道26的底部。

在一个示例中，流动通道26具有矩形构型。流动通道26的长度和宽度可分别小于基底24的长度和宽度，使得基底表面的包围流动通道26的部分可用于附接到盖(未示出)或另一个基底24。在一些情况下，每个流动通道26的宽度可为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个通道20的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个流动通道26的宽度和/或长度可大于、小于上文指定的值或介于它们之间。在另一个示例中，流动通道26是正方形的(例如，10mm×10mm)。

当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道壁的单独材料时，每个流动通道26的深度可小到单层厚。对于其他示例，每个流动通道26的深度可为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个流动通道26的深度可大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

流通池22的流动通道26内的架构的不同示例在图3B和图3C中示出。

在图3B所示的示例中，流通池22包括单层基底24A以及限定在单层基底24A中的流动通道26。在该示例中，催化性聚合水凝胶16'位于流动通道26内。

为了将催化性聚合水凝胶16'引入流动通道26中，可生成催化性聚合水凝胶16'的混合物，然后将其施加到基底24(具有限定在其中的流动通道26)上。在一个示例中，催化性聚合水凝胶16'可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下的材料流或者另一种合适的技术将混合物施加到基底表面(包括，在流动通道26中)。这些类型的技术将催化性聚合物水凝胶16'覆盖地沉积在基底24上(例如，流动通道26中和间隙区域28上)。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将催化性聚合物水凝胶16'特异性地沉积在流动通道26中而不是间隙区域28上。

在一些示例中，可活化基底表面(包括暴露在流动通道26中的部分)，然后可将混合物(包括催化性聚合物水凝胶16')施加到其上。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在基底表面上。在另一个示例中，可将基底表面暴露于等离子体灰化，以生成可附着到催化性聚合物水凝胶16'的表面活化剂(例如，-OH基团)。

根据催化性聚合物水凝胶16'的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。

然后可进行抛光，以便从流动通道26周边处的间隙区域28移除催化性聚合物水凝胶16'，同时使表面上的催化性聚合物水凝胶16'在流动通道26中是至少基本上完整的。

在一些示例中，刚沉积的催化性聚合物水凝胶16'已经具有附接到其上的催化剂18，因此不执行另外的处理来将催化剂18引入流动通道26中。其一个示例是当催化剂18是聚合物水凝胶主链的单体单元的一部分时。其另一个示例是当催化剂18已在聚合后附接时。因此，本文所公开的一个示例性方法包括形成包含催化剂18的催化性聚合物水凝胶16'；以及将催化性聚合物水凝胶16'施加到基底24的表面上。

在其他示例中，刚沉积的聚合物水凝胶是不具有与其附接的催化剂18的初始聚合物水凝胶16。因为初始聚合物水凝胶16不包含催化剂18，所以进行另外的处理以将催化剂18引入初始聚合物水凝胶16中，从而在流动通道26中形成催化性聚合物水凝胶16'。在这些示例中，将初始聚合物水凝胶16沉积到流动通道26中并对其进行抛光，然后可使用本文所述的任何后聚合附接技术将催化剂18引入初始聚合物水凝胶16中。因为初始聚合物水凝胶16存在于流动通道26中而不是间隙区域28上，所以催化剂18将优先附接到流动通道26中的初始聚合物水凝胶16。

流通池22还包括附接到催化性聚合物水凝胶16'的扩增引物30。引物附接的以下讨论涉及催化性聚合物水凝胶16'。应当理解，当将初始聚合物水凝胶16引入流动通道26中时，可在扩增引物30之前或之后引入催化剂18。因此，引物附接的讨论也适用于初始聚合物水凝胶16。

可进行接枝过程，以将扩增引物30接枝到流动通道26中的催化性聚合物水凝胶16'。在一个示例中，可通过在扩增引物30的5'端处或附近进行单点共价附接将引物30固定到催化性聚合物水凝胶16'。该附接使i)引物30的衔接子特异性部分自由地退火至其同源即用测序核酸片段，并且ii)3'羟基基团自由地用于引物延伸。任何合适的共价附接均可用于此目的。可使用的终止引物的示例包括炔烃终止引物(例如，其可附接到催化性聚合物水凝胶16'的叠氮化物表面部分)、硫代磷酸酯终止引物(例如，其可附接到催化性聚合物水凝胶16'的溴表面部分)或叠氮化物终止引物(例如，其可附接到催化性聚合物水凝胶16'的炔烃表面部分)。

合适的引物30的具体示例包括P5和P7引物，其用于Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上，以用于在HISEQ^TM、HISEQX^TM、MISEQ^TM、MISEQDX^TM、MINISEQ^TM、NEXTSEQ^TM、NEXTSEQDX^TM、NOVASEQ^TM、GENOME ANALYZER^TM、ISEQ^TM和其他仪器平台上进行测序。

在一个示例中，接枝可涉及流经沉积(例如，使用暂时性结合或永久性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或通过将引物30附接到流动通道26中的催化性聚合物水凝胶16'的另一种合适方法。这些示例性技术中的每一种可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包含引物30、水、缓冲液和催化剂。利用接枝方法中的任一种，引物30与流动通道26中的催化性聚合物水凝胶16'的反应性基团反应，并且对周围基底24不具有亲和力。因此，引物30选择性地接枝到流动通道26中的催化性聚合物水凝胶16'。

在图3C所示的示例中，流通池22包括多层基底24B，该多层基底包括支撑件32以及位于支撑件32上的图案化材料34。图案化材料34限定由间隙区域28隔开的凹陷36。凹陷36位于流动通道26中的每一个内。

在图3C所示的示例中，图案化材料34位于在支撑件32上。应当理解，可被选择性地沉积、或者沉积和图案化以形成凹陷36和间隙区域28的任何材料都可用于图案化材料34。

作为图案化材料34的一个示例，可通过气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加到支撑件32上。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta₂O₅)、氧化铝(例如Al₂O₃)、氧化硅(例如SiO₂)、氧化铪(例如HfO₂)等。

作为图案化材料34的另一个示例，可将树脂施加到支撑件32，然后进行图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻术、纳米压印光刻术(NIL)、冲压技术、压印技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面低聚倍半硅氧烷树脂(POSS)的树脂、非POSS环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧树脂)、丙烯酸类树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的)以及它们的组合。

如本文所用，术语“多面低聚倍半硅氧烷”(POSS)是指为二氧化硅(SiO₂)与有机硅(R₂SiO)之间的杂合中间体(例如RSiO_1.5)的化学组合物。POSS的示例可以是Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的POSS，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，该组合物是具有化学式[RSiO_3/2]_n的有机硅化合物，其中R基团可相同或不同。POSS的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外包括例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包含一种或多种不同的笼或芯结构作为单体单元。多面结构可以是T₈结构，诸如：并且由下式表示：该单体单元通常具有八个官能团臂R₁至R₈。

单体单元可具有带有10个硅原子和10个R基团的笼结构，称为T₁₀，诸如：或者可具有带有12个硅原子和12个R基团的笼结构，称为T₁₂，诸如：基于POSS的材料另选地可包括T₆、T₁₄或T₁₆笼结构。可在合成期间调节平均笼含量，和/或通过纯化方法对其进行控制，并且单体单元的笼尺寸分布可用于本文所公开的示例中。

在本文所公开的一些POSS示例中，R₁至R₈或R₁₀或R₁₂中的至少一者包含环氧基。R₁至R₈或R₁₀或R₁₂可相同或可不相同，并且在一些示例中，R₁至R₈或R₁₀或R₁₂中的至少一者包含环氧基，而R₁至R₈或R₁₀或R₁₂中的至少另一者是非环氧基官能团。非环氧基官能团可以是(a)与环氧基基团正交反应(即，在与环氧基基团不同的条件下反应)的反应性基团，其用作将树脂偶联到扩增引物、聚合物或聚合剂的柄部；或(b)调节树脂的机械或功能特性(例如，调节表面能)的基团。在一些示例中，非环氧基官能团选自由叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、氨基、羟基、炔基、酮、醛、酯基、烷基、芳基、烷氧基和卤代烷基组成的组。

如图3C所示，图案化材料34包括限定在其中的凹陷36以及分隔相邻凹陷36的间隙区域28。可设想凹陷36的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹陷36设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以是呈行和列的凹陷36的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以是凹陷36和/或间隙区域28的重复排列。在其他示例中，布局或图案可以是凹陷36和/或间隙区域28的随机排列。图案可包括点、垫、阱、柱、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。

凹陷36的布局或图案可相对于凹陷36在限定区域中的密度(凹陷36的数量)来表征。例如，凹陷36可以大约200万个/mm²的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm²、约1,000个/mm²、约10万个/mm²、约100万个/mm²、约200万个/mm²、约500万个/mm²、约1000万个/mm²、约5000万个/mm²或者更高或更低的密度。还应当理解，图案化材料34中凹陷36的密度可介于选自上述范围的下限值中的一个与上限值中的一个之间。例如，可将高密度阵列表征为具有间隔小于约100nm的凹陷36，可将中密度阵列表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹陷36，并且可将低密度阵列表征为具有间隔大于约1μm的凹陷36。虽然已经提供了示例性密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹陷36的密度可部分地取决于凹陷36的深度。在一些情况下，可能期望凹陷36之间的间距甚至大于本文所列的示例。

凹陷36的布局或图案也可或另选地在平均节距或从凹陷36的中心到相邻凹陷36的中心的间距(中心到中心的间距)或从一个凹陷36的边缘到相邻凹陷36的边缘(边缘到边缘的间距)方面进行表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或者更大或更小。凹陷36的特定图案的平均节距可介于选自上述范围的下限值中的一个与上限值中的一个之间。在一个示例中，凹陷36具有约1.5μm的节距(中心到中心的间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。

每个凹陷36的尺寸可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。

每个凹陷部36可具有能够限制流体的任何体积。可选择最小或最大体积，例如以适应流通池22的下游使用所预期的通量(例如，多重性)、分辨率、核苷酸10或分析物反应性。例如，体积可为至少约1×10^-3μm³、至少约1×10^-2μm³、至少约0.1μm³、至少约1μm³、至少约10μm³、至少约100μm³或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1×10⁴μm³、至多约1×10³μm³、至多约100μm³、至多约10μm³、至多约1μm³、至多约0.1μm³或更小。

每个凹陷开口所占据的面积可基于与上面针对体积阐述的那些标准类似的标准来选择。例如，每个凹陷开口的面积可以为至少约1×10^-3μm²、至少约1×10^-2μm²、至少约0.1μm²、至少约1μm²、至少约10μm²、至少约100μm²或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1×10³μm²、至多约100μm²、至多约10μm²、至多约1μm²、至多约0.1μm²、至多约1×10^-2μm²或更小。每个凹陷开口所占据的面积可大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

每个凹陷36的深度可足够大以容纳一些催化性聚合物水凝胶16'。在一个示例中，深度可为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可为至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹陷36的深度可大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

在一些情况下，每个凹陷36的直径或长度和宽度可为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可为至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径或长度和宽度为约0.4μm。每个凹陷36的直径或长度和宽度可大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

在图3C所示的示例中，催化性聚合物水凝胶16'设置在每个凹陷36内。可如参考图3B所述那样施加催化性聚合物水凝胶16'，使得催化性聚合物水凝胶16'存在于凹陷36中而不存在于周围间隙区域28上。

在图3C所示的示例中，可将引物30接枝到每个凹陷36内的催化性聚合物水凝胶16'。可如参考图3B所述那样施加引物30，因此该引物将接枝到催化性聚合物水凝胶16'而不接枝到周围间隙区域28。

虽然在图3A、图3B或图3C中未示出，但应当理解，流通池22还可包括附接到基底24的盖。在一个示例中，例如，在一些间隙区域28处，盖可粘结到基底24的至少一部分。在盖与基板24之间形成的粘结可以是化学粘结或机械粘结(例如，使用紧固件等)。

盖可以是对导向基底24的激发光透明的任何材料。例如，盖可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料等。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购获得的示例为购自Schott North America,Inc.的D合适的塑料材料(即环烯烃聚合物)的可商购获得的示例为购自Zeon Chemicals L.P.的产品。

可使用任何合适的技术(诸如激光粘结、扩散粘结、阳极粘结、共熔粘结、等离子体活化粘结、玻璃熔块粘结或本领域已知的其他方法)将盖粘结到基底24。在一个示例中，间隔层可用于将盖粘结到基底24。间隔层可以是将至少一些基底24和盖密封在一起的任何材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结基底24和盖的辐射吸收材料。

在其他示例中，流通池22还可包括附接到基底24的附加图案化或非图案化基底24。

核苷酸

与流通池22的示例一起使用的核苷酸是3'OH封端的核苷酸10(参见图1)。如本文所述，3'OH封端的核苷酸10包括核苷酸以及附接到核苷酸的糖的3'OH封端基团12。核苷酸可以是本文所述的任何示例。

3'OH封端基团12可连接到核苷酸中糖分子的氧原子。3'OH封端基团12可以是仅允许在每个测序循环中发生单碱基掺入的可逆终止剂。可逆终止剂会阻止附加的碱基掺入与模板多核苷酸链互补的新生链中。这使得能够检测和识别单个掺入的碱基。随后可移除3'OH封端基团12，使得能够在每个模板多核苷酸链处发生另外的测序循环。用于移除3'OH封端基团12的裂解反应由催化剂18催化。

不同的3'OH封端基团12的示例包括3'-ONH₂可逆终止剂、3'-O-烯丙基可逆终止剂(—CH＝CHCH₂)和3'-O-叠氮甲基可逆终止剂(—CH₂N₃)。其他合适的可逆终止剂包括邻硝基苄基醚、烷基邻硝基苄基碳酸酯、酯部分、其他烯丙基部分、缩醛(例如，叔丁氧基-乙氧基)、MOM(—CH₂OCH₃)部分、2,4-二硝基苯亚磺酰基、四氢呋喃醚、3'磷酸、醚、-F、-H₂、-OCH₃、-N₃、-HCOCH₃和2-硝基苯碳酸酯。对于烯丙基可逆终止剂，聚合物水凝胶16'的表面上的配体可结合钯(Pd(0))催化剂、钌催化剂。对于酯和缩醛，可使用本文所述的酸和/或碱催化剂中的任一种。

3'OH封端的核苷酸10是完全功能性核苷酸，其还可包含连接到核苷酸的碱基B的可检测标记。可检测标记可以是任何光学可检测部分，包括发光部分、化学发光部分、荧光部分、荧光底物部分、发色部分和/或发色底物部分。合适的光学可检测部分的一些示例包括荧光素标记、罗丹明标记、花菁标记(例如，Cy3、Cy5等)和Alexa家族的荧光染料以及其他荧光和荧光底物染料)。

可使用任何合适的连接分子来将可检测标记连接到核苷酸的碱基B。连接分子是可裂解的，并且可发生用于移除解封基团12的一系列类似反应。在一个示例中，连接分子是式—((CH₂)₂O)_n—的间隔基团，其中n为介于2与50之间的整数。

在一些应用中，可能期望针对包括不同碱基(例如A、T、G、C(以及U或I))的每个核苷酸10利用不同类型的可检测标记。例如，可选择荧光或荧光底物标记使得每个标记吸收激发辐射和/或以与其他标记组可区别的波长发射荧光。此类可区别的类似物提供了同时监测不同标记在同一反应混合物中存在的能力。在一些示例中，序列的四个核苷酸中的一个可不包含标记，而其他三个核苷酸包含不同的标记。

测序方法

流通池22的示例可用于总体测序技术，诸如合成测序(SBS)。在总体测序中，可使用扩增引物30在流通池22上形成待测序的模板多核苷酸链(未示出)。在模板多核苷酸链形成开始时，可由任何核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备文库模板。可将核酸样品片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的DNA或RNA片段。在制备期间，可将衔接子添加到这些片段的末端。通过减少循环扩增，可在衔接子中引入不同的基序，诸如测序结合位点、索引以及与凹陷36中的引物30互补的区域。最终的文库模板包括DNA或RNA片段和两端的衔接子。在一些示例中，来自单个核酸样品的片段上添加有相同的衔接子。

可将多个文库模板引入流通池22中。使多个文库模板与例如固定在流动通道26中或流动通道26中的凹陷36中的两种类型的引物30中的一种杂交。

然后可进行簇生成。在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物复制文库模板。使初始文库模板变性，留下固定在流动通道26或凹陷36中的拷贝。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物30杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物30杂交，并再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板多核苷酸链。成簇导致在流动通道26中或在每个凹陷36中形成若干模板多核苷酸链。成簇的该示例是桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排他性扩增(Examp)工作流程(Illumina Inc.)。

可引入与模板多核苷酸链上的互补序列杂交的测序引物。该测序引物使得模板多核苷酸链准备好进行测序。

为了引发测序，可将掺入混合物添加到流通池22中。在一个示例中，掺入混合物包含液体载体、聚合酶和3'OH封端的核苷酸10。应当理解，在一些示例中，选择掺入混合物使得其不活化催化剂18，因为不期望在掺入和成像之前引发封端基团12的裂解。对于客体-主体示例，掺入混合物可包含未活化状态的客体催化剂(例如，金属)。客体催化剂可结合到初始聚合物水凝胶16'(例如经由配体)，并且随后可在解封期间通过正交方式(例如暴露于特定波长)被刺激以将客体催化剂转化为活化形式。

当将掺入混合物引入流通池22中时，流体进入流动通道26和/或凹陷36(其中存在模板多核苷酸链)。

以依赖于模板的方式将3'OH封端的核苷酸10添加到测序引物中(从而延伸测序引物)，使得可使用对添加到测序引物中的核苷酸的顺序和类型的检测来确定模板的序列。更具体地，通过相应的聚合酶将核苷酸中的一个核苷酸掺入延伸测序引物并与模板多核苷酸链互补的新生链中。换句话讲，在穿过流通池22的至少一些模板多核苷酸链中，相应的聚合酶使杂交的测序引物延伸掺入混合物中的核苷酸中的一个核苷酸。

在该示例性方法中，在将核苷酸碱基掺入新生链中之后，可从流通池22移除掺入混合物，其包括任何未掺入的3'OH封端的核苷酸10。这可使用洗涤溶液(例如缓冲液)来实现。

如本文所提及的，3'OH封端的核苷酸10包括可逆终止特性(例如，3'OH封端基团12)，一旦将核苷酸添加到测序引物，该可逆终止特性就终止进一步的引物延伸。在不进行进一步掺入的情况下，可通过成像事件检测最近掺入的核苷酸10。在成像事件期间，照明系统(未示出)可向流动通道26和/或凹陷36提供激发光。

然后可将裂解混合物引入流通池22中。在本文所公开的示例中，裂解混合物能够i)从掺入的核苷酸移除3'OH封端基团12，并且ii)从掺入的核苷酸裂解任何可检测标记。存在于聚合物水凝胶16'上的催化剂可加速在移除3'OH封端基团期间发生的反应。移除3'OH封端基团12使得能够进行后续的测序循环，并且加速与催化剂18的该反应可使得整个测序过程更有效。

催化剂的一些示例在解封反应期间加速中间步骤。因此，在掺入裂解混合物并引发解封反应时，催化剂执行其功能。当将光酸发生剂用作催化剂18时，可使用另外的光暴露以引发催化活性。

裂解混合物中3'OH封端基团和合适的解封剂/组分的示例可包括：可通过碱水解移除的酯部分；可用Nal、三甲基氯硅烷和Na₂S₂O₃或用Hg(II)的丙酮/水溶液移除的烯丙基部分；可用膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))裂解的叠氮甲基；可用酸性条件裂解的缩醛，诸如叔丁氧基-乙氧基；可用LiBF₄和CH₃CN/H₂O裂解的MOM(—CH₂OCH₃)部分；可用亲核试剂诸如苯硫酚和硫代硫酸盐裂解的2,4-二硝基苯亚磺酰基；可用Ag(I)或Hg(II)裂解的四氢呋喃基醚；以及可被磷酸酶(例如多核苷酸激酶)裂解的3'磷酸。

洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可将SBS循环重复n次以使测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。在一些示例中，可使用配对末端测序，其中对正向链进行测序并将其移除，然后构建反向链并对其进行测序。

虽然已经详细描述了SBS，但应当理解，本文所述的流通池22可与其他测序方案一起用于基因分型，或用于其他化学和/或生物应用中。在一些情况下，可选择流通池的引物以使得能够同时进行配对末端测序，其中正向链和反向链均存在于催化性聚合物水凝胶16'上，从而允许同时对每个读段进行碱基检出。顺序和同时进行配对末端测序有助于检测基因组重排和重复序列元件以及基因融合和新转录本。在另一个示例中，本文所公开的流通池10可用于在流通池上生成文库。

试剂盒

本文所述的流通池22的任何示例可以是试剂盒的一部分。因此，本文所公开的聚合物水凝胶16'的任何示例可以是试剂盒的一部分。试剂盒的一些示例包括流通池22，该流通池包括基底24；基底24上的催化性聚合物水凝胶16'，该催化性聚合物水凝胶16'包含催化剂18；以及附接到催化性聚合物水凝胶16'的扩增引物30；其中催化剂18用于加速引入流通池22中并掺入附接到扩增引物30的模板链中的3'OH封端的核苷酸10的封端基团12的裂解；以及包含用于引发封端基团12裂解的组分的裂解混合物。

附加说明

应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等意指结合该示例描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或可不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。

应当理解，本文提供的范围包括所述范围以及所述范围内的任何值或子范围，如同这些值或子范围被明确列举一样。例如，约2mm至约300mm的范围应被解释为不仅包括明确列举的约2mm至约300mm的限值，而且还包括单个值(诸如约40mm、约250.5mm等)和子范围(诸如约25mm至约175mm等)。此外，当利用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与所述值的微小变化(最多至+/-10％)。

虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。