具体实施方式

本发明人使用分离自乳腺癌患者的肿瘤组织的淋巴细胞，努力寻找能够有效选择表现出肿瘤特异性活性的淋巴细胞的基因标志物，由此发现了总共17种基因并验证了它们的效力。因此，完成了本发明。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明提供了用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的标志物组合物，所述标志物组合物包含ITGA6基因(Genbank登录号：NM_000210.4、NM_001079818.3、NM_001316306.2、NM_001365529.2和NM_001365530.2)的mRNA或蛋白。

所述标志物组合物还可以包含选自于由如下基因所组成的组中的一种或多种基因的mRNA或蛋白：ATP6V0A1(Genbank登录号：NM_001130020.3、NM_001130021.3、NM_001378522.1、NM_001378523.1和NM_001378530.1)；ARRDC3(Genbank登录号：NM_001329670.2、NM_001329671.2、NM_001329672.2和NM_020801.4)；CD23(Genbank登录号：NM_001207019.2、NM_001220500.2和NM_002002.4)；CD200(Genbank登录号：NM_001004196.3、NM_001318826.1、NM_001318828.1、NM_001318830.1和NM_001365851.2)；CD300C(Genbank登录号：NM_006678.5)；CYSLTR1(Genbank登录号：NM_001282186.1、NM_001282187.2、NM_001282188.2和NM_006639.4)；ITGB1(Genbank登录号：NM_002211.4、NM_033668.2和NM_133376.2)；MBOAT2(Genbank登录号：NM_001321265.2、NM_001321266.2、NM_001321267.2和NM_138799.4)；Met(Genbank登录号：NM_000245.4、NM_001127500.3、NM_001324401.2和NM_001324402.2)；MYO9A(Genbank登录号：NM_006901.4)；PTPN13(Genbank登录号：NM_006264.3、NM_080683.3、NM_080684.3和NM_080685.2)；S100P(Genbank登录号：NM_005980.3)；SECTM1(Genbank登录号：NM_003004.3)；TCN2(Genbank登录号：NM_000355.4和NM_001184726.1)；TSPAN2(Genbank登录号：NM_001308315.1、NM_001308316.1和NM_005725.6)；以及VSIG1(Genbank登录号：NM_001170553.1和NM_182607.5)。

本发明还提供了用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的组合物，所述组合物包含用于测量ITGA6基因的mRNA水平的试剂或用于测量其蛋白水平的试剂；以及提供了用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。

所述组合物还可以包含用于测量选自于由如下基因所组成的组中的一种或多种基因的mRNA水平的试剂或用于测量其蛋白水平的试剂：ATP6V0A1、ARRDC3、CD23、CD200、CD300C、CYSLTR1、ITGB1、MBOAT2、Met、MYO9A、PTPN13、S100P、SECTM1、TCN2、TSPAN2和VSIG1。

本发明还提供了一种提供信息以预测淋巴细胞的肿瘤反应性的方法，所述方法包括测量ITGA6基因的mRNA水平或蛋白水平。

所述预测方法还可以包括测量选自于由如下基因所组成的组中的一种或多种基因的mRNA水平或蛋白水平：ATP6V0A1、ARRDC3、CD23、CD200、CD300C、CYSLTR1、ITGB1、MBOAT2、Met、MYO9A、PTPN13、S100P、SECTM1、TCN2、TSPAN2和VSIG1。

为了寻找能够有效选择表现出肿瘤特异性活性的淋巴细胞的基因标志物，通过具体实例，本发明人利用从源自15名三阴性乳腺癌患者的肿瘤组织中分离的淋巴细胞，发现了总共17种基因标志物。更具体而言，在本发明的一个实施方式中，作为对源自15名三阴性乳腺癌患者的乳腺癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行共培养的结果，确认6名患者表现出反应性。作为对在表现出反应性的6名患者和未表现出反应性的9名患者中差异表达的基因进行分析的结果，确认共有709种基因表现为差异表达，并且在这些基因中选择了在细胞表面表达的17种基因(例如Met、CD200、ITGB1、PTPN13、CYSLTR1、VSIG1、MBOAT2、MYO9A、CD23、S100P、SECTM1、CD300C、TSPAN2、ARRDC3、ITGA6、TCN2和ATP6V0A1)(参见实施例2)。

此外，在本发明的另一实例中，作为对源自三阴性乳腺癌患者的TIL的肿瘤特异性反应性与17种基因的表达水平之间的相关性进行分析的结果，确认了这些基因中的ITGA6的表达水平在源自表现出对肿瘤细胞的反应性的患者的TIL(特别是总TIL、NKT细胞和T细胞)中显著较高(参见实施例3)。

这些结果证明，在乳腺癌患者中，ITGA6是用于预测源自患者的TIL的肿瘤反应性的更有效的标志物基因。

本文所用的术语“预测淋巴细胞的肿瘤反应性”是指预测淋巴细胞是否能诱导对肿瘤的抗癌作用，其通过将肿瘤组织(更优选为自体肿瘤组织)中的肿瘤细胞识别为抗原并对其作出应答而诱导免疫应答来实现。

在本发明中，淋巴细胞可以分离自含有肿瘤组织的体液、血液或组织，体液可为含有淋巴细胞的腹水、胸水和胆汁，但本发明不限于此。

肿瘤优选为乳腺癌，更优选为三阴性乳腺癌，但不限于此。

在另一个实例中，对于在实施例2中差异表达的17种基因，本发明人通过机器学习分析对各种组合模型对肿瘤反应性预测性能的有效性进行了分析。其结果是，确认了由三种基因构成的组合模型具有最高的预测准确度，具体而言，确认了组合变量(combinationvariables)中的ATP6V0A1*TSPAN2*MBOAT2和PTPN13*TCN2*TSPAN2组合显示出显著的肿瘤反应性预测性能(参见实施例4和实施例5)。

另一方面，本发明提供了用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的标志物组合物，所述标志物组合物包含选自于由如下基因所组成的组中的三种以上基因的mRNA或蛋白：ATP6V0A1(Genbank登录号：NM_001130020.3、NM_001130021.3、NM_001378522.1、NM_001378523.1和NM_001378530.1)；MBOAT2(Genbank登录号：NM_001321265.2、NM_001321266.2、NM_001321267.2和NM_138799.4)；PTPN13(Genbank登录号：NM_006264.3、NM_080683.3、NM_080684.3和NM_080685.2)；TCN2(Genbank登录号：NM_000355.4和NM_001184726.1)；以及TSPAN2(Genbank登录号：NM_001308315.1、NM_001308316.1和NM_005725.6)。

更优选地，所述标志物组合物包含ATP6V0A1、MBOAT2和TSPAN2基因的mRNA或蛋白；或者所述标志物组合物包含PTPN13、TCN2和TSPAN2基因的mRNA或蛋白，但不限于此。

所述标志物组合物还可以包含选自于由如下基因所组成的组中的一种或多种基因的mRNA或蛋白：ARRDC3(Genbank登录号：NM_001329670.2、NM_001329671.2、NM_001329672.2和NM_020801.4)；CD23(Genbank登录号：NM_001207019.2、NM_001220500.2和NM_002002.4)；CD200(Genbank登录号：NM_001004196.3、NM_001318826.1、NM_001318828.1、NM_001318830.1和NM_001365851.2)；CD300C(Genbank登录号：NM_006678.5)；CYSLTR1(Genbank登录号：NM_001282186.1、NM_001282187.2、NM_001282188.2和NM_006639.4)；ITGA6(Genbank登录号：NM_000210.4、NM_001079818.3、NM_001316306.2、NM_001365529.2和NM_001365530.2)；ITGB1(Genbank登录号：NM_002211.4、NM_033668.2和NM_133376.2)；Met(Genbank登录号：NM_000245.4、NM_001127500.3、NM_001324401.2和NM_001324402.2)；MYO9A(Genbank登录号：NM_006901.4)；S100P(Genbank登录号：NM_005980.3)；SECTM1(Genbank登录号：NM_003004.3)；以及VSIG1(Genbank登录号：NM_001170553.1和NM_182607.5)。

本发明还提供了用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的组合物，所述组合物包含能够测量选自于由如下基因所组成的组中的三种以上基因的mRNA水平的试剂或能够测量其蛋白水平的试剂：ATP6V0A1、MBOAT2、PTPN13、TCN2和TSPAN2；以及提供了用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。

更优选地，所述组合物包含能够测量ATP6V0A1、MBOAT2和TSPAN2基因的mRNA水平的试剂或能够测量其蛋白水平的试剂。此外，所述组合物包含能够测量PTPN13、TCN2和TSPAN2基因的mRNA水平的试剂或能够测量其蛋白水平的试剂，但不限于此。

所述组合物还可以包含能够测量选自于由如下基因所组成的组中的一种或多种基因的mRNA水平的试剂或能够测量其蛋白水平的试剂：ARRDC3、CD23、CD200、CD300C、CYSLTR1、ITGA6、ITGB1、Met、MYO9A、S100P、SECTM1和VSIG1。

本发明还提供了一种提供信息以预测淋巴细胞的肿瘤反应性的方法，所述方法包括测量选自于由如下基因所组成的组中的三种以上基因的mRNA水平或蛋白水平：ATP6V0A1、MBOAT2、PTPN13、TCN2和TSPAN2。

所述预测方法还可以包括测量选自于由如下基因所组成的组中的一种或多种基因的mRNA水平或蛋白水平：ARRDC3、CD23、CD200、CD300C、CYSLTR1、ITGA6、ITGB1、Met、MYO9A、S100P、SECTM1和VSIG1。

在本发明中，能够测量mRNA水平的试剂可以是与基因的mRNA互补结合的正义引物和反义引物，但不限于此。

本文所用的术语“引物”是指作为DNA合成起始位点的短基因序列、出于用于诊断和DNA测序等目的而合成的寡核苷酸。可以将引物合成为15-30bp的长度来常规使用，但可以根据使用目的而变化，并且可以根据常规方法通过甲基化或加帽等对引物进行修饰。

本文所用的术语“探针”是指通过酶促化学分离纯化或合成过程产生的能够特异性结合长度为数个至数百个碱基的mRNA的核酸。可以通过标记放射性同位素或酶来确认mRNA的有无，并且可以根据已知方法进行设计、修饰来使用探针。

在本发明中，能够测量蛋白水平的试剂可以是与由基因编码的蛋白特异性结合的抗体，但本发明不限于此。

本文所用的术语“抗体”包括在免疫学上与特定抗原具有反应性的免疫球蛋白分子，并且包括单克隆抗体和多克隆抗体两者。此外，抗体包括通过基因工程产生的所有类型，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源抗体(例如双特异性抗体)。

根据本发明的用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的试剂盒由适用于分析方法的包含一种组分或多种不同组分的组合物、溶液或装置组成。

在根据本发明的提供信息以预测淋巴细胞的肿瘤反应性的方法中，淋巴细胞可以分离自源自受试者的组织、血液或体液，但不限于此。

受试者优选为乳腺癌患者，更优选为三阴性乳腺癌患者，但不限于此。

本文所用的术语“提供信息以预测淋巴细胞的肿瘤反应性的方法”是作为使用淋巴细胞的免疫疗法的预备步骤、提供仅选择表现出对肿瘤细胞的特异性活性的淋巴细胞所必需的基本信息的方法。

在本发明中，可以通过本领域已知的常规方法测量mRNA水平，例如选自于由如下方法所组成的组中的一种或多种方法：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、RNase保护测定法(RPA)、微阵列和northern印迹，但本发明不限于此。

在本发明中，可以通过本领域已知的常规方法测量蛋白水平，例如选自于由如下方法所组成的组中的一种或多种方法：western印迹、放射免疫测定法(RIA)、放射免疫扩散、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光、Ouchterlony扩散、补体固定测定法和蛋白芯片，但本发明不限于此。

在下文中，为了帮助理解本发明，将提供示例性实施例。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，以下实施例并不用于限制本发明。

实施例

实施例1.实验准备及实验方法

1-1.肿瘤浸润淋巴细胞的培养

为了分离并培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，首先将手术后立即采集的乳腺癌组织带入实验室，然后在2小时内从肿瘤组织中分离出TIL，之后按照以下方法进行培养。此处，本文使用的所有乳腺癌组织仅来源于除源自乳腺癌已转移的淋巴结的乳房组织以外的乳房。更具体而言，用含有1×ZellShield抗生素(Minerva Biolabs，Berlin，Germany)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4，Biowest)洗涤肿瘤组织，并将其切成直径1mm的切片。然后，为了从组织中分离TIL，将两片置于24孔板的每个孔(其中每孔包含2mL RPMI 1640培养基(LifeTechnologies，NY，USA)，其含有10％胎牛血清(FBS，Corning，VA，USA)、1×ZellShield、50nM 2-巯基乙醇(Life Technologies，NY，USA)以及1,000IU/mL人重组IL-2(MiltenyiBiotec，Auburn，CA，USA))中，然后在37℃下在5％CO₂培养箱中孵育14天。培养期间每2天更换一半培养基，当培养基颜色由红色变为黄色时，将细胞分到两个孔中。14天后，为了去除肿瘤组织和残留物，用40μm孔径的尼龙网过滤器过滤培养的TIL，1,500rpm离心5分钟，确认细胞数量和存活率，然后冷冻保存至进行下一实验。

同时，为了额外的快速扩增(rapid expansion；REP)，将通过上述方法分离的TIL与从健康供体获得的经辐照(50Gy)的同种异体外周血单核细胞(PBMC)一起在含有10％FBS、1×ZellShield、1,000IU/mL人重组IL-2和30ng/mL人抗CD3抗体(OKT3，MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)的REP培养基(50％RPMI 1640和50％AIM-V培养基，Life Technologies)中培养。每两天或三天新加入REP培养基，14天后收集培养的TIL(REP后TIL)并冷冻保存。

1-2.原代癌细胞培养

为了分离并培养肿瘤组织中的原代癌细胞，将通过实施例1-1中描述的方法获得的乳腺癌组织切片在37℃下在5％CO₂培养箱中孵育1小时，以在消化缓冲液(即含有2％FBS、1×青霉素/链霉素(Invitrogen，CA，USA)、10μg/mL胰岛素(Life Technologies)、10ng/mL EGF(Invitrogen)以及1×胶原酶/透明质酸酶(Gendepot，Barker，TX，USA)的DMEM-F12培养基(Life Technologies))存在下进行消化。然后，将从经消化的组织中获得的沉淀物以80×g离心30秒，重悬于0.25％胰蛋白酶/EDTA中，并通过移液分离成单个细胞。通过100μm孔径过滤器对含有单细胞的悬浮液进行过滤，然后用含有2％FBS的冷Hank's平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞，并以300×g离心5分钟，从而获得单个癌细胞。使用含有2％FBS、5ng/mL人重组EGF、0.3μg/mL氢化可的松(Sigma-Aldrich，St.Louis)、0.5ng/mL霍乱毒素(Sigma-Aldrich)、5nM 3,3',5-三碘-L-甲状腺氨酸(Sigma-Aldrich)、0.5nMβ-雌二醇(Sigma-Aldrich)、5μM盐酸异丙肾上腺素(Sigma-Aldrich)、50nM乙醇胺(Sigma-Aldrich)、50nM O-磷酰乙醇胺(Sigma-Aldrich)、1×胰岛素/转铁蛋白/硒以及1％青霉素/链霉素的DMEM/F12(1:1)培养基(Life Technologies)，在100mm胶原I包被板(Corning)上，将通过上述方法获得的解离细胞在37℃下在CO₂培养箱中进行培养。之后，在将细胞传代培养至少两次后进行冷冻保存。

1-3.评估肿瘤浸润淋巴细胞的反应性

为了评估通过在实施例1-1中描述的方法大规模增殖的TIL的潜在功能，在96孔板中用32.4nM PMA和1μg/mL离子霉素刺激每孔1×10⁵个TIL，持续24小时。随后，将培养板以1,500rpm离心5分钟以收集上清液，随后通过ELISA分析测量IFN-γ蛋白水平。

此外，为了研究TIL对自体癌细胞的反应性，将4×10⁵个TIL与1×10⁵个自体乳腺癌细胞在96孔板上共培养24小时，收集上清液，然后通过ELISA分析测量由TIL分泌的IFN-γ蛋白水平。

1-4.ELISA分析

在本实施例中，ELISA使用ELISA试剂盒(K0331121，Koma Biotech，Seoul，Korea)根据制造商方案进行。简而言之，用洗涤液对各孔进行洗涤，将样品、标准物质和空白加入各自的孔中，在室温下孵育2小时，并且所有测试进行2次或3次。随后，除去液体后，用洗涤液洗涤板，并加入生物素化检测抗体，在室温下孵育2小时。然后再次洗涤板，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物，之后在37℃下孵育30分钟。洗涤后，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，在室温下孵育以进行适当显色。在各孔中加入终止溶液后，使用酶标仪(Spectramax 340PC，Molecular Devices)通过450nM处的吸光度来测量IFN-γ水平。

1-5.统计分析

为了寻找能够区分对自体肿瘤细胞具有特异性活性的淋巴细胞的基因标志物，通过以下方法进行统计分析：

1)通过将根据在实施例1-3中描述的方法与自体肿瘤细胞一起培养时由TIL分泌的IFN-γ水平除以TIL单独存在时分泌的IFN-γ水平而得到比值，当其值为2以上时，定义为具有反应性。

2)通过从由1)分析示出的对肿瘤具有反应性的组和非反应性组的培养TIL中提取RNA并进行转录组测序来分析差异表达基因，表达水平差异超过2倍的基因被定义为差异表达。

3)通过将由与肿瘤细胞共培养的TIL分泌的IFN-γ水平除以TIL单独存在时分泌的IFN-γ水平得到比值，通过双变量相关性分析(Spearman相关性)对该比值和各基因的表达水平进行研究，从而选择表现出显著相关性(p<0.05)的基因组。

实施例2.探索肿瘤特异性淋巴细胞的选择标志物

作为根据在实施例1-3中描述的方法将源自15名三阴性乳腺癌(TNBC)患者的TIL与源自各患者的乳腺癌细胞一起培养的结果，在6名患者中表现出反应性。随后，作为根据在实施例1-5中描述的第二种方法对表现出反应性的6名患者组和未表现出反应性的9名患者组中差异表达的基因进行分析的结果，确认在13,827种基因中，总共709种基因表现为差异表达；将这些基因中在细胞表面表达的17种基因示于下表1中。根据在细胞表面表达的基因，可以通过诸如FACS等方法选择活细胞。

此外，由图1的结果可以看出，通过在实施例1-5中描述的第三种方法所公开的相关性分析，与IFN-γ比值表现出显著相关性的基因总数为1,923个，并确认了在差异表达的709种基因中共有的基因总共为46个。在下表1中的17种基因中，确认包含在所述46种基因中的基因是存在于上部的8种基因。

[表1]

实施例3.验证用于预测肿瘤反应性的标志物基因的有效性

3-1.TNBC-REP TIL的肿瘤特异性反应性与17种基因的表达水平之间的相关性分析

本发明人进行了以下实验以验证在实施例2中获得的17种基因标志物作为能够选择肿瘤特异性淋巴细胞的标志物的有效性。

首先，使用FACS测量在实施例2中获得的17种基因在从14名三阴性乳腺癌患者中分离并快速扩增的TIL(TNBC-REP TIL)中的表达水平，结果如下表2所示。

[表2]

此外，为了研究在反应性TIL(反应性＝1)和非反应性TIL(反应性＝0)中表达的基因的表达水平之间是否存在显著差异，进行了SPSS统计分析。其结果是，如从下表3可以看出的，确认在17种基因中在ITGA6、CD200、S100P、ARRDC3、CYSLTR1和VSIG1中存在显著差异。

[表3]

具体而言，作为根据6种基因中的每一种的反应性对表达水平差异进行定量绘图的结果，如图2a所示，与非反应性组(00)相比，ITGA6和CD200在反应性组的TIL(1.00)中表达水平较高，而S100P、ARRDC3、CYSLTR1和VSIG1则是在反应性组的TIL中表达水平较低。因此，根据以上结果，选择表达水平增加的ITGA6和CD200作为用于选择反应性TIL的标志物并进行以下实验。

3-2.每种TIL类型中的ITGA6和CD200的表达水平分析

本发明人试图研究在实施例3-1中选择的ITGA6和CD200的表达在肿瘤浸润免疫细胞(TIL)中的哪些细胞中存在差异。为此，在通过用CD3、CD4、CD8、CD56抗体以及ITGA6或CD200对TIL进行染色而进行FACS分析后，分别分析了总TIL(CD45+)、NKT细胞(CD45+CD56+CD3+)、T细胞(CD45+CD56-CD3+)、CD4 T细胞(CD45+CD56-CD3+CD4+CD8-)和CD8 T细胞(CD45+CD56-CD3+CD4-CD8+)中的每一种中ITGA6和CD200的表达，结果分别示于下表4和表5。

[表4]

[表5]

此外，作为使用SPSS程序进行统计分析的结果，如下表6和图2b所示，确认了在总TIL(CD45+)、NKT细胞和T细胞中，与无反应性组相比，反应性组中ITGA6的表达显著更高。然而，CD200在NKT细胞和T细胞以及总TIL中均未表现出显著表达差异。基于该结果，将CD200确定为实验变量，将ITGA6选择为肿瘤特异性淋巴细胞的反应性预测标志物。

[表6]

实施例4.通过机器学习验证用于预测肿瘤反应性的标志物基因的有效性

本发明人利用肿瘤尺寸和新辅助化学疗法(NAC)的存在与否，通过机器学习由在实施例2中获得的17种标志物基因进行了用于获得能够预测对肿瘤的反应性和非反应性的生物标志物基因的分析。为此，分析是在各种机器学习方法中使用逻辑回归进行的。

首先，对源自15名三阴性乳腺癌患者的TIL进行主成分分析(PCA)。其结果是，如图3a所示，虽然并未根据反应性明确地分为两个簇(例如反应性组(Active)和非反应性组(Non-active))，但观察到了几个簇。

之后，使用热图分析了源自各患者的TIL中17种基因的表达水平，将表现出反应性的源自患者的样品的结果以绿色表示。作为分析的结果，如图3b所示，在17种基因中，PTPN13基因主要在反应性组中表现出高表达水平，而MET基因在进行NAC的样品中表现出低表达水平。

此外，作为通过在双标图中呈现图3a的PCA分析结果而将样品和基因一起显示来分析哪些基因影响每个组的结果，如图3c所示，确认了SECTM1、PTPN13、S100P、CD200、TCN2和FCER2(CD23)基因与除BC16110样品之外的反应性组相关。此外，作为使用热图对6种基因进行分析的结果，如图3d所示，确认了反应性样品中PTPN13基因的表达水平普遍较高，而除PTPN13外的其它基因表达水平无显著差异。

实施例5.用于预测肿瘤反应性的标志物基因组合的发现及其有效性的验证

5-1.10种基因构成的组合的发现与分析

本发明人对在实施例2中获得的17种基因进行了分析以发现用于选择具有肿瘤特异性反应性的淋巴细胞的有效标志物组合。

更具体而言，为了进行考虑17种差异表达的基因之间的相互作用的机器学习，首先使用Sklearn提供的PolynomialFeatures库获得基因之间的相互作用。其结果是，由于特征(Feature)数量过多，使用lasso来选择特征，结果如下表7所示。

[表7]

之后，使用SMOTE方法对每种相互作用进行过采样(oversampling)。然后进行逻辑回归，如下表8所示，除了准确度和AUC值为1的情况外，选择准确度和AUC值最高的10种基因，使用热图比较它们的表达水平。

[表8]

更具体而言，在图4a中示出了对应于13种特征的10基因组合以及源自患者的TIL样品中的每种基因组合的表达水平。作为分析的结果，在表现出反应性的源自患者的样品中，从左侧起的组合4、12、13、5和10的表达水平变得较低。此外，由于正系数值极大地影响作为反应性的预测，而负系数值极大地影响作为非反应性的预测，因此用正系数值和负系数值分别为最高特征的基因组合7(当系数值为正时，红色)和基因组合2(当系数值为负时，绿色)各自绘制热图并进行分析。

更具体而言，使用对应于系数值为负的组合2的10种基因进行热图分析的结果示于图4b中，组合的系数值为-9.30E-05。与系数值为最大正数的组合7的10种基因相比，用绿色圆圈标记不共有的4种基因。在这些基因中，在进行NAC时，MET和ATP6V0A1基因表现出低表达水平，而PTPN13基因主要在反应性组中表现出高表达水平。另外，使用对应于系数值为正的组合7的10种基因进行热图分析的结果示于图4c中，对应的10基因组合的系数值为8.92E-04。用绿色圆圈标记组合2的10种基因中未包含的其它4种基因，作为对热图结果进行分析的结果，4种基因中的TSPAN2和MYO9A基因在进行NAC的样品中显示出低表达水平；而CD300C基因则在进行NAC时显示出高表达水平。总的来说，基于上述结果，根据源自患者的样品的反应性，基因的表达水平之间没有差异。因此，本发明人分析了用在分别具有负系数值和正系数值的组合2和组合7中不共有的总共8种基因绘制的热图，并且再次确认了根据反应性的存在与否基因的表达水平没有差异。因此，本发明人获得了诸如MET、ATP6V0A1、S100P、PTPN13、CD23、TCN2、TSPAN2和MBOAT2等8种基因之间的相互作用，并通过机器学习对其进行了分析。

5-2.通过机器学习分析由8种基因构成的组合

本发明人使用源自实施例5-1中的8种基因进行了实验，来寻找能够预测肿瘤反应性的有效标志物组合。采用与实施例5-1中相同的方法，考虑8种基因之间的相互作用，使用PolynomialFeatures库获取基因之间的相互作用，使用lasso进行特征选择，结果如下表9所示。

[表9]

随后，在进行过采样以研究使用每种基因组合的模型的性能后，进行逻辑回归和随机森林分析。首先，作为逻辑回归的结果，如下表10以及图5a和图5b所示，当相互作用数为3或4时，除了测试准确度和AUC值为1的情况以外，测试准确度和AUC值是最高的。另外，作为随机森林分析的结果，如下表11所示，当相互作用数为3时，除了模型性能为1的情况以外，性能是最高的。

[表10]

[表11]

5-3.用于预测肿瘤反应性的标志物基因组合的最终选择

作为实施例5-2的分析结果，通过回归分析和随机森林分析二者均确认了在相互作用数为3的情况下(即由三种基因的组合构成的模型)，预测肿瘤反应性的性能最高，并且本发明人绘制了由三种基因构成的显示正系数值的10种特征中的每一种的ROC曲线。图6a和6b显示了10种基因组合的表格和所有10种特征的ROC曲线；并且图6c和6d示出了在具有正系数值的情况中仅使用AUC值为0.7以上的情况(组合2、5、6、8、9和10)绘制的ROC曲线。

进而，本发明人为AUC值为0.7以上的6种特征中的每一种绘制了混淆矩阵，以比较由每种组合构成的模型的性能。其结果是，如图6e所示，确认了特征8和特征10匹配所有三种反应性(标记为1)，并且特征8和特征10在非反应性(标记为0)中比其它特征具有更高的准确度。

因此，基于这些结果，最终选择组合8(ATP6V0A1*TSPAN2*MBOAT2)和组合10(PTPN13*TCN2*TSPAN2)作为用于预测淋巴细胞的肿瘤反应性的标志物基因的显著组合。

本领域普通技术人员应当理解，以上对本发明的描述是示例性的，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，本文公开的实施方式可以容易地修改为其它具体形式。因此，应当理解，上文描述的实施方式在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。

工业实用性

通过使用根据本发明的基因标志物，可以通过非侵入性方法而不是传统的侵入性方法更方便地从身体组织、血液或体液中分离淋巴细胞，并预测它们的肿瘤反应性以选择肿瘤特异性淋巴细胞。基于此，可以产生有效的免疫治疗剂，因此，具有肿瘤特异性反应性的淋巴细胞选择标志物有望在免疫疗法领域得到广泛应用。