一种量子点改性蛋白疫苗及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种量子点改性蛋白疫苗及其制备方法和应用 (Quantum dot modified protein vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 曲松楠 汤子康 梁桃 邓初夏 雷海鹏 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种量子点改性蛋白疫苗及其制备方法和应用,涉及纳米材料和生物医学领域。该量子点改性蛋白疫苗,其原料包括量子点粒子和抗原蛋白,量子点粒子的表面包含有生物相容性官能团,抗原蛋白与官能团作用使蛋白通过非共价键作用缠绕至量子点粒子的表面。本申请中通过量子点对抗原蛋白进行改性,可改变其空间构象,这些构象修饰导致正常蛋白质的免疫原性显着增强,同时使癌细胞上的免疫抑制蛋白质功能失调。有利于增强其被特异性识别的几率。这种量子点改性蛋白疫苗可以大幅度提高蛋白的免疫原性,进而具有更佳的免疫激活特性,其制备方法简单,操作条件温和。获得的量子点改性蛋白疫苗能够应用到癌症的个性化免疫治疗中。(The invention discloses a quantum dot modified protein vaccine and a preparation method and application thereof, and relates to the field of nano materials and biomedicine. The raw materials of the quantum dot modified protein vaccine comprise quantum dot particles and antigen protein, wherein the surfaces of the quantum dot particles comprise biocompatible functional groups, and the antigen protein and the functional groups act to enable the protein to be wound on the surfaces of the quantum dot particles through non-covalent bond action. In the application, the spatial conformation of the antigen protein can be changed by modifying the antigen protein through quantum dots, and the conformational modifications lead to the remarkable enhancement of the immunogenicity of normal protein and simultaneously cause the dysfunction of immunosuppressive protein on cancer cells. The probability of specific recognition of the protein is enhanced. The quantum dot modified protein vaccine can greatly improve the immunogenicity of protein, and further has better immune activation characteristic, and the preparation method is simple and the operation condition is mild. The obtained quantum dot modified protein vaccine can be applied to personalized immunotherapy of cancers.)
技术领域
本发明涉及纳米材料和生物医学领域，具体而言，涉及一种量子点改性蛋白疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是全世界死亡的主要原因之一。癌细胞表现出高度不同的突变组成且在不同患者之间的重叠有限。个性化癌症疫苗是癌症免疫疗法中大力开发的疫苗策略，旨在调节先天性和适应性免疫系统，以广泛激活具有个别癌症新抗原的抗癌免疫力。目前，鉴定和重组产生特异性新抗原的过程非常昂贵且费时，在此期间新抗原的变化将导致无效的抗癌反应。此外，针对多种新抗原的抗癌疫苗被认为仅针对单一癌症新抗原的抗炎疫苗更有效。然而，设计和生产个性化的多靶点癌症疫苗是极具挑战性的。
在最近的进展中，提出了许多通过与佐剂偶联或阻断癌细胞上免疫抑制蛋白的方法来增强癌细胞的免疫原性的策略。然而，这些方法不能在很大程度上固有地改变或增强癌细胞的免疫原性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种量子点改性蛋白疫苗，其免疫原性大幅度提高，具有更佳的免疫激活特性。
本发明的目的在于提供一种量子点改性蛋白疫苗的制备方法，该制备方法简单，操作条件温和。
本发明的目的在于提供一种量子点改性蛋白疫苗在制备肿瘤特异性免疫药物中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种量子点改性蛋白疫苗，其原料包括量子点粒子和抗原蛋白，所述量子点粒子的表面包含有生物相容性官能团，所述抗原蛋白与所述官能团作用使蛋白通过非共价键作用缠绕至所述量子点粒子的表面。
在可选的实施方式中，所述生物相容性官能团包括羟基、羧基、巯基和氨基中的一种或多种。
在可选的实施方式中，所述抗原蛋白为具有免疫原性的全靶点蛋白疫苗；
优选地，所述全靶点蛋白疫苗的抗原类型选自肿瘤组织消化的全部蛋白或肿瘤细胞膜消化的全部蛋白；
优选地，所述全靶点蛋白疫苗的抗原类型选自肿瘤组织消化蛋白、增殖蛋白以及肿瘤细胞系分化蛋白中的一种或多种。
在可选的实施方式中，所述抗原蛋白是患肿瘤个体的肿瘤细胞上提取的全蛋白疫苗；
优选地，所述患肿瘤个体为哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物为人；
优选地，所述哺乳动物为非人哺乳动物；
优选地，所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、兔、牛、马、羊、猴以及猿中的任一种。
第二方面，本发明提供一种量子点改性蛋白疫苗的制备方法，其包括用含有生物相容性官能团的量子点对抗原蛋白进行改性使蛋白通过非共价键作用缠绕至所述量子点粒子的表面。
在可选的实施方式中，所述改性包括将所述量子点粒子的溶液和所述抗原蛋白混合后于25-100℃条件下反应1-30min；
优选地，在改性反应的过程中同时以40-250rpm转速搅拌。
在可选的实施方式中，所述量子点粒子和所述抗原蛋白的质量比为1：0.10-10000；
优选地，所述量子点粒子的溶液的浓度为0.1-1.5mg/mL。
在可选的实施方式中，所述量子点粒子的制备方法包括：
将前驱体碳源和功能化原料混合溶解于溶剂中，于110-220℃条件下，加热反应2-10h，清洗并固液分离，将分离后的固体产物干燥；
优选地，所述前驱体碳源包括柠檬酸、葡萄糖和聚乙二醇中的至少一种；
所述功能化原料包括尿素、缩二脲和缩三脲中的至少一种；
优选地，采用醇溶液对反应体系进行清洗，对分离后的固体产物进行水洗并离心；
优选地，所述醇溶液包括甲醇或者乙醇；
优选地，离心转速为6000-10000rpm。
第三方面，本发明提供前述实施方式所述的量子点改性蛋白疫苗在制备肿瘤特异性免疫药物中的应用。
第四方面，本发明提供一种量子点在制备用于肿瘤特异性免疫药物的改性蛋白疫苗中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本申请提供的量子点改性蛋白疫苗通过量子点表面的活性官能团与抗原蛋白发生作用，超小型量子点可以重新修饰蛋白质的构象结构，从而使蛋白在外加能量产生的热的作用下通过非共价键作用缠绕到量子点表面，形成量子点与肿瘤蛋白结合的蛋白疫苗。通过量子点对抗原蛋白进行改性，可改变其空间构象，这些构象修饰导致正常蛋白质的免疫原性显着增强，同时使癌细胞上的免疫抑制蛋白质功能失调。有利于增强其被特异性识别的几率。这种量子点改性蛋白疫苗可以大幅度提高蛋白的免疫原性，进而具有更佳的免疫激活特性，其制备方法简单，操作条件温和。获得的量子点改性蛋白疫苗能够应用到癌症的个性化免疫治疗中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例量子点与肿瘤全蛋白相互作用的结构示意图；
图2为本发明实验例1提供的碳量子点粒子(QDs)、牛血清白蛋白(BSA)、碳量子点粒子改性的牛血清白蛋白(QDs-BSA)灭活疫苗、碳量子点粒子和牛血清白蛋白的混合物(QDs+BSA)在56℃反应条件下荧光场和考马斯亮蓝的电泳跑胶图；
图3为本发明实验例2提供的量子点与乳腺癌4T1肿瘤全蛋白疫苗的荧光发射光谱图；
图4为本发明实验例2提供的碳量子点粒子(QDs)、4T1乳腺癌肿瘤消化蛋白(W4T1)、量子点改性全靶点蛋白(QDs-W4T1)疫苗、碳量子点粒子和4T1乳腺癌肿瘤消化蛋白的混合物(QDs+W4T1)在荧光场和考马斯亮蓝反应条件下的电泳跑胶图；
图5为本发明实验例3提供的小鼠腹股沟淋巴的对比图；
图6为本发明实验例3提供的注射肿瘤免疫激活剂治疗的小鼠以及对照组小鼠的肿瘤生长曲线；
图7为本发明实验例3提供的注射肿瘤免疫激活剂治疗的小鼠以及对照组小鼠的肿瘤生存曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种量子点改性蛋白疫苗，其原料包括量子点粒子和抗原蛋白，量子点粒子的表面包含有生物相容性官能团，抗原蛋白与官能团作用使蛋白通过非共价键作用缠绕至量子点粒子的表面。
其中，生物相容性官能团包括羟基、羧基、巯基和氨基中的一种或多种。本申请中通过具有生物相容性官能团的量子点对抗原蛋白进行改性，抗原蛋白与官能团相互作用通过非共价键作用使抗原蛋白缠绕至量子点粒子的表面，从而改变蛋白的空间构象，增强其被特异性识别的几率。这种量子点改性抗原蛋白大幅度提高蛋白的免疫原性，进而具有更佳的免疫激活特性，以及能够应用到癌症的个性化免疫治疗中。
本申请中，抗原蛋白为具有免疫原性的全靶点蛋白疫苗；术语“全靶点蛋白疫苗”是指以肿瘤上所有特异性抗原为靶点的肿瘤蛋白疫苗。
具体来说，全靶点蛋白疫苗的抗原类型选自肿瘤组织消化的全部蛋白或肿瘤细胞膜消化的全部蛋白；优选地，全靶点蛋白疫苗的抗原类型选自肿瘤组织消化蛋白、增殖蛋白以及肿瘤细胞系分化蛋白中的一种或多种。
具体到本申请中，抗原蛋白是患肿瘤个体的肿瘤细胞上提取的全蛋白疫苗；优选地，患肿瘤个体为哺乳动物；优选地，哺乳动物为人；优选地，哺乳动物为非人哺乳动物；优选地，非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、兔、牛、马、羊、猴以及猿中的任一种。
在非限制性的示意例中，抗原蛋白包括但不限于：牛血清白蛋白疫苗或乳腺癌4T1肿瘤全蛋白疫苗。
此外，本申请还提供了上述量子点改性蛋白疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
S1、量子点的制备。
量子点粒子的制备方法包括：
将前驱体碳源和功能化原料混合溶解于溶剂中，于110-220℃条件下，加热反应2-10h，清洗并固液分离，将分离后的固体产物干燥；
优选地，前驱体碳源包括柠檬酸、葡萄糖和聚乙二醇中的至少一种；功能化原料包括尿素、缩二脲和缩三脲中的至少一种。本申请中通过将前驱体碳源和功能化原料进行混合经热处理合成量子点粒子。由于前驱体碳源的分子或离子状态等尺寸很小，其通过与功能化原料混合可以使量子点的表面包含生物相容性官能团。
优选地，本申请中，采用醇溶液对反应体系进行清洗，对分离后的固体产物进行水洗并以6000-10000rpm的转速离心分离；其中，醇溶液包括甲醇或者乙醇。
应理解，本申请并不仅仅限于采用将上述溶剂加热于110-220℃条件下反应以制备量子点粒子，还可以将上述原料采用其他方式，包括但不限于化学氧化法、燃烧法、微波合成法或模板法等等，并根据特定的方法所需的工艺参数进行制备。
S2、改性。
请参阅图1，用含有生物相容性官能团的量子点对抗原蛋白进行改性使蛋白通过非共价键作用缠绕至量子点粒子的表面。
具体来说，改性包括将量子点粒子溶解于去离子水中配制成浓度为0.1-1.5mg/mL的溶液，将量子点粒子的溶液与抗原蛋白混合后于25-100℃条件下反应1-30min；在改性反应的过程中同时以40-250rpm转速搅拌，反应结束后纯化即得。
其中，量子点粒子和抗原蛋白的质量比为1：0.10-10000。
本申请通过上述方法制备量子点改性蛋白疫苗，其制备方法简单，操作条件温和，通过热复合使量子点表面的活性官能团与抗原蛋白发生作用，超小型量子点可以重新修饰蛋白质的构象结构，从而使蛋白在外加能量产生的热的作用下缠绕到量子点表面，形成量子点与肿瘤蛋白结合的蛋白疫苗。通过量子点对抗原蛋白进行改性，可改变其空间构象，这些构象修饰导致正常蛋白质的免疫原性显着增强，同时使癌细胞上的免疫抑制蛋白质功能失调。有利于增强其被特异性识别的几率。这种量子点改性蛋白疫苗可以大幅度提高蛋白的免疫原性，进而具有更佳的免疫激活特性，以及能够应用到癌症的个性化免疫治疗中。本申请也充分体现了量子点可以广泛应用于制备用于肿瘤特异性免疫药物的改性蛋白疫苗中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种量子点改性的牛血清白蛋白(CQDs-BSA)疫苗，其制备方法包括：
将2g柠檬酸和8g尿素按质量比溶解于30mL DMSO溶剂中，得到透明溶液置于50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，160℃下反应4h，反应后的溶液加入大量乙醇洗涤，得到黑色固体，将固体水洗，离心(8000rpm，5min)，干燥后得到深蓝色粉末。测定获得的量子点的直径为3-10nm。量子点的C、N、O、S元素质量比分别为50.1％，29.3％，19.1％和1.5％。
将得到的量子点溶于去离子水中，配置浓度为0.1mg/mL溶液，将量子点和牛血清白蛋白的质量比是1:10混合，采用烘箱加热方式升温至56℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得到量子点改性的牛血清白蛋白(CQDs-BSA)疫苗。
实施例2
本实施例提供了一种量子点改性的乳腺癌细胞全靶点蛋白疫苗(CQDs-W4T1)，其制备方法包括：
将柠檬酸和缩二脲按质量比1:3溶解于水(或超纯水、PBS缓冲液等)中，得到透明溶液置于50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，200℃下反应3h。反应后的溶液加入大量乙醇，得到黑色固体，固体水洗，离心(8000rpm，5min)，干燥后得到深蓝色粉末。
将上述量子点溶于去离子水中，配置浓度为0.1mg/mL，在上述溶液中每毫升中加入1×107个4T1乳腺癌肿瘤消化蛋白(W4T1)。采用水浴加热等加热方式升温至56℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得量子点改性的乳腺癌细胞全靶点蛋白疫苗(CQDs-W4T1)。
实施例3
本实施例提供了一种量子点改性的肿瘤细胞(QDs-cell)灭活疫苗，其制备方法包括：
将2g柠檬酸和6g缩二脲按质量比溶解于30ml水(或超纯水、PBS缓冲液等)中，得到透明溶液置于50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，200℃下反应3h。反应后的溶液加入大量乙醇，得到黑色固体，固体水洗，离心(8000rpm，5min)，干燥后得到深蓝色粉末。
将上述量子点溶于去离子水中，配置浓度为0.1mg/mL，在上述溶液中每毫升中加入1×107个4T1乳腺癌肿瘤细胞。采用电热摇床升温至56℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得量子点改性的肿瘤细胞(QDs-cell)灭活疫苗。
实验例1
将实施例1获得的碳量子点粒子(QDs)、牛血清白蛋白(BSA)、碳量子点粒子改性的牛血清白蛋白(QDs-BSA)灭活疫苗、碳量子点粒子和牛血清白蛋白的混合物(QDs+BSA)进行电泳跑胶，结果如图2所示。
从图2可以看出，在图2的A中显示经过复合后得到的QDs-BSA，在蛋白质对应一条电泳带，显示出荧光，表明碳点和蛋白的有效键合。在图2的B中显示，BSA、QDs-BSA和QDs+BSA中的蛋白质均被染色。
实验例2
将实施例2获得的碳量子点粒子(QDs)和量子点改性全靶点蛋白(QDs-W4T1)疫苗进行的紫外吸收光谱及荧光图，结果如图3所示。
从图3可以看出，经过复合后得到的QDs-W4T1，在665nm激发下，在719nm处有吸收光谱。
将实施例2获得的碳量子点粒子(QDs)、4T1乳腺癌肿瘤消化蛋白(W4T1)、量子点改性全靶点蛋白(QDs-W4T1)疫苗、碳量子点粒子和4T1乳腺癌肿瘤消化蛋白的混合物(QDs+W4T1)进行电泳跑胶，结果如图4所示。
从图4可以看出，在图4的A中显示经过复合后得到的QDs-W4T1，在蛋白质对应一条电泳带，显示出荧光，表明碳点和蛋白的有效键合。在图4的B中显示，W4T1、QDs-W4T1和QDs+W4T1中的蛋白质均被染色。
实验例3
将实施例3中0.1mL得到的碳量子点增强型细胞灭活疫苗(碳量子点浓度为0.2mg/mL，4T1细胞数为1×107个)皮下注射进balb/c小鼠。0h、4h、24h和48h分别取出其四对乳腺，进行成像，观察小鼠在注射前的淋巴情况以及注射后4h、24h和48h的淋巴的荧光情况，结果如图5所示。
从图5可以看出，经过碳量子点粒子改性的肿瘤细胞(QDs-cell)灭活疫苗可以增加抗原的淋巴呈递。
实验例4
碳量子点粒子的制备同实施例1。
将两种乳腺癌细小鼠(4T1型和EMT6型)的肿瘤摘除，进行消化，增殖，得到4T1全蛋白和EMT6全蛋白。
将得到的碳量子点粒子溶于去离子水中，配置浓度为0.1mg/mL溶液，将碳量子点粒子和消化的癌细胞全蛋白(4T1和EMT6)以质量比是1.0:10进行混合，采用热板加热方式升温至56℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得到量子点改性的全靶点蛋白疫苗QDs-4T1和QDs-EMT6。
将一定计量的QDs-4T1量子点改性全靶点蛋白疫苗，QDs-EMT6，PBS和纯4T1肿瘤灭活全蛋白注射到4T1型肿瘤小鼠体内。优选注射计量为200ul，注入方法为静脉注入、皮下注入和腹水注入的一种，优选皮下注入。
当小鼠的肿瘤体积大于1200mm3时，基于动物伦理对小鼠进行安乐，观察小鼠的肿瘤增长曲线和生存曲线。
测量小鼠的肿瘤生长曲线，结果如图6所示。图6发现，实验组QDs-4T1肿瘤生长显著受到抑制进而治愈，而对照组QDs-EMT6、PBS和4T1灭活蛋白肿瘤逐渐增大。说明量子点改性全靶点蛋白疫苗QDs-4T1特异性地激活了小鼠的肿瘤免疫功能，抑制并灭杀了小鼠体内的肿瘤。
测量小鼠的生存曲线，结果如图7所示。图7发现，实验组QDs-4T1在60天后还能全部存活，而对照组QDs-EMT6、PBS、和4T1灭活蛋白在36天左右全部死亡。说明量子点改性全靶点蛋白疫苗QDs-4T1特异性地治愈了小鼠体内的肿瘤。
综上所述，本申请提供的量子点改性蛋白疫苗通过量子点表面的活性官能团与蛋白疫苗发生作用，超小型量子点可以重新修饰蛋白质的构象结构，从而使蛋白在外加能量产生的热的作用下缠绕到量子点表面，形成量子点与肿瘤蛋白结合的蛋白疫苗。通过量子点对蛋白进行改性，可改变其空间构象，这些构象修饰导致正常蛋白质的免疫原性显着增强，同时使癌细胞上的免疫抑制蛋白质功能失调。有利于增强其被特异性识别的几率。这种量子点改性蛋白疫苗可以大幅度提高蛋白的免疫原性，进而具有更佳的免疫激活特性，其制备方法简单，操作条件温和。获得的量子点改性蛋白疫苗能够应用到癌症的个性化免疫治疗中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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