芜菁中性多糖在制备肺癌a549细胞调控的药物中的应用
阅读说明：本技术 芜菁中性多糖在制备肺癌a549细胞调控的药物中的应用 (Application of turnip neutral polysaccharide in preparation of lung cancer A549 cell regulation and control medicine ) 是由 海力茜·陶尔大洪 马晓丽 周凯 陈春丽 丁海燕 杨飞 乔丽洁 李欢欢 李亚童 米合 于 2021-02-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及芜菁中性多糖应用技术领域,具体公开了芜菁中性多糖在制备肺癌A549细胞调控的药物中的应用,所述芜菁中性多糖作用于肺癌A549细胞时,能够有效抑制人肺腺癌A549细胞增殖,促进人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达量增加。本发明中的芜菁中性多糖能够促进肺癌A549细胞凋亡,从而为治疗肺癌提供理论基础。(The invention relates to the technical field of turnip neutral polysaccharide application, and particularly discloses application of turnip neutral polysaccharide in preparation of a medicament for regulating and controlling lung cancer A549 cells, wherein when the turnip neutral polysaccharide acts on the lung cancer A549 cells, the turnip neutral polysaccharide can effectively inhibit the proliferation of the lung adenocarcinoma A549 cells and promote the increase of Caspase-3 protein expression in the lung adenocarcinoma A549 cells. The turnip neutral polysaccharide can promote apoptosis of lung cancer A549 cells, thereby providing a theoretical basis for treating lung cancer.)
技术领域
本发明涉及芜菁中性多糖应用技术领域，具体涉及芜菁中性多糖在制备肺癌A549细胞调控的药物中的应用。
背景技术
芜菁，属十字花科芸蔓属芸蔓种芜菁，常以块根和种子入药，是一种药食同源的植物。李时珍在《本草纲目》中对于其功效有更加详细的描述，“辛、苦、平、无毒，可升可降，能汗能吐能下，能利小便，又能明目解毒，其功甚伟”、唐代《新修本草》将其命名为“芜菁”。芜菁广泛分布在中国新疆、西藏等高海拔地区。新疆人将其称为长寿圣果，素有“新疆人参”之称。常常用于润肺、止咳平喘。主要含有以下化学成分：黄酮类、多糖类、生物碱类等。目前对芜菁块根的分离鉴定表明，芜菁具有抗衰老、抗辐射、止咳平喘、保肝护肝等作用。
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内肺癌的发病率居高不下，是肿瘤中发病率和死亡率最高的疾病。肺癌的发病率逐年升高已成为非常严峻的社会问题。对于不同的恶性肿瘤都有不同的内在机制控制，需要从机理层面促进肿瘤细胞的凋亡，因此，寻找一种能够有效促进癌细胞凋亡的物质成为难题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了芜菁中性多糖在制备肺癌A549细胞调控的药物中的应用。
进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备促进肺癌A549细胞凋亡的药物。
进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备调控人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达的药物。
进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达促进剂。
进一步地，所述芜菁中性多糖的给药剂量为每mL肺癌A549细胞液给药200-600μg，所述肺癌A549细胞液的细胞密度为106个·mL-1(该106数量级的细胞密度均可)。
进一步地，所述芜菁中性多糖的给药剂量为每mL肺癌A549细胞液给药400-600μg。
进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备抑制人肺腺癌A549细胞增殖的药物。
进一步地，所述芜菁中性多糖的给药剂量为每mL肺癌A549细胞液给药100-600μg·mL-1，所述肺癌A549细胞液的细胞密度为106个·mL-1(该106数量级的细胞密度均可)。
进一步地，所述芜菁中性多糖的给药剂量为每mL肺癌A549细胞液给药400-600μg。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了芜菁中性多糖在制备促进肺癌A549细胞凋亡的药物中的应用；
2、本发明中所述的芜菁中性多糖能够促进人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达量增加；
3、本发明中所述的芜菁中性多糖能够促进人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达水平升高，促进了细胞凋亡；
4、本发明中所述的芜菁中性多糖能够抑制人肺腺癌A549细胞增殖，从而对于肺癌起到抑制作用；
5、本发明中所述的芜菁中性多糖能够作为用于制备治疗肺癌的药物中的潜在物质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中A549细胞生长曲线图；
图2为本发明实施例1中不同处理下的细胞形态图；
其中，图2A表示无药物干预下的细胞形态图；
图2B表示10μg/mL顺铂药物干预下的细胞形态图；
图2C表示400μg/mL芜菁中性多糖药物干预下的细胞形态图；
图2D表示100μg/mL芜菁中性多糖药物干预下的细胞形态图；
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：
实施例1提供了芜菁中性多糖在制备肺癌A549细胞调控的药物中的应用，具体过程如下：
一、材料与仪器
(1)细胞株
从武汉普诺赛生命科技有限公司购入A549肺癌细胞株1支。
(2)药物
顺铂(北京索莱宝科技有限公司)
芜菁中性多糖BRNP(实验室自制)，具体制备方法见专利CN107011453A，需要说明的是芜菁的别名为维药恰麻古；
(3)主要试剂
F-12k培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，PM150910-500)
0.25％胰蛋白酶(Gibco公司)
胎牛血清(Gibco公司)
双抗(Gibco公司)
T25细胞培养瓶(corning公司)
15、50mL离心管(NEST公司)
60mm细胞培养皿(NEST公司)
1000μL移液枪(德国eppendorf公司)
75％乙醇消毒液(河北康济药械有限公司)
0.22μm除菌头(millipore公司)
人Caspase-3Elisa试剂盒96T(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)
CCK-8试剂盒100T(Biosharp公司)
(4)仪器与设备
HERA cell 150型细胞恒温培养箱(美国Thermo公司)
冰箱(Haier海尔公司)
生物安全操作台(美国Thermo公司)
倒置显微镜(Motic AE31公司)
离心机(sartoriμs公司)
NDO-601SD型干燥箱(日本EYELA公司)
二、具体实验方法
(1)细胞培养
从-80℃冰箱中取出一瓶冻存管，快速在37℃水浴锅中解冻使溶解，在冻存管表面喷洒75％酒精拿至操作台，将解冻的细胞悬液用1000μL移液枪移入15mL离心管中，再向该离心管中加完全培养液3mL，再离心(1000r·min-1，5min)，弃上清，向离心管中加入2mL完全培养液，进行吹打均匀，将细胞悬液移至T25细胞培养瓶中，再加入3mL完全培养液，用八字混匀法使细胞分布均匀，再标记好细胞品种和日期，之后显微镜下可观察细胞形态特征，培养瓶表面喷洒75％酒精，再放置培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养。
(2)细胞生长曲线的测定
将人肺癌A549细胞用1mL0.25％胰酶消化下来，进行计数，将细胞密度调整为5×104个/mL，每孔100μL铺于96孔板中，第一列与最后一列、第一行与最后一行分别用100μLPBS填充，其余每列代表一天，铺板结束后，将96孔板置于恒温培养箱进行培养24h，取出将加入细胞的每孔加10μL CCK-8，恒温培养箱孵育1h在450nm处测OD值，重复此操作，连续七天测OD值，每天设六个复孔，绘制细胞生长曲线。数据用平均数±标准差表示，所有实验结果均重复3次。
(3)CCK-8法检测中性多糖对人肺癌A549细胞增殖活性的影响
Cell Coμnting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的进行细胞增殖和毒性分析。该试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖分析。
按照上述(1中)的方法制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个·mL-1，细胞接种于96孔板中，每孔100μL，接种3块培养板，进行细胞培养；24h后吸弃培养液，开始加药，每孔加100μL。
实验分组如下：1、空白组(不加细胞，加培养液)；2、阴性对照组(不加药，只加细胞与培养液)；3、芜菁中性多糖组(100、200、400、600μg·mL-1芜菁中性多糖)；4、顺铂组(5、10、20μg·mL-1)每个浓度6个复孔，其余孔用PBS填充，加药完成后放置培养箱继续培养，分别于24h取出培养板，加入10μL CCK-8溶液，再培养1h，在450nm处测OD值，计算抑制率。数据用平均数±标准差表示，所有实验结果均重复3次。
抑制率％＝1-(实验组-空白组)/(对照组-空白组)×100％
(4)细胞形态学观察
取对数生长期的人肺腺癌A549细胞，接种于96孔板，进行细胞培养；24h后吸弃培养液，加入不同浓度的芜菁中性多糖分别孵育24h，在显微镜下观察细胞形态变化，再进行拍照，记录结果。
(5)酶联免疫法检测人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达
(5.1)细胞培养：按照(1)中步骤进行细胞培养。
(5.2)细胞给药
将人肺腺癌A549细胞用1mL0.25％胰酶消化下来，进行计数，将细胞密度调整为1×106个·mL-1，每孔1mL铺于6孔板中，将6孔板置于恒温培养箱进行培养24h，之后进行分组给药：
分组如下：1、阴性对照组(不加药，只加细胞与培养液)；2、阳性对照组(顺铂10μg·mL-1)3、芜菁中性多糖组(包括低剂量组200μg·mL-1、中剂量组400μg·mL-1、高剂量组600μg·mL-1芜菁中性多糖)。给药24h再进行后续处理。
(5.3)标本准备
将给药24h的细胞从培养箱取出，用预冷的PBS清洗3次，然后用胰酶消化，离心(1000r·min-1，5min)，弃上清，将收集的细胞用预冷的PBS洗涤3次，向细胞中加入200μLPBS重悬，并反复冻融细胞3次，将提取液进行离心(1500r·min-1，10min)，取上清进行检测。
(5.4)操作步骤
采用ELISA法按照试剂盒提供具体步骤测定Caspase-3蛋白表达。用酶标仪测定吸光度值，通过标准曲线计算Caspase-3蛋白表达。具体操作如下：
分别设定标准孔、空白孔和样本孔，标准孔加入100μL倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL标准品&样本稀释液，其余孔加入100μL待测样本，每组设立3个复孔，给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；甩尽孔内液体，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；再甩尽孔内液体，每孔加洗涤液200μL，浸泡1.5分钟，吸去酶标板内的液体，重复此洗板步骤3次，洗板完成后立即进行下步操作，不要让微孔板干燥；每孔加酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右；每孔加终止液50μL，终止反应；(终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同)用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度。
测得光密度OD值后，计算每组复孔的OD值，每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在对对数坐标纸上绘出四参数逻辑的标准曲线，作图时去掉空白组的值。根据绘制的标准曲线以及测定的样本OD值，可得样本的浓度。
三、统计学分析
采用SPSS25、Origin2015等软件进行数据分析与绘图，多组间采用单因素方差分析，当P<0.05时表示数据有差异，当P<0.01时表示数据有显著性差异。
四、实验结果
(1)细胞生长曲线
由图1可知：细胞培养前五天OD值呈现增长趋势，尤其是第五天达到最高峰，OD值越大，表明活细胞数越多，第六天开始OD值减少，活细胞数减少。数据分析可知：第一天与第二天之间有显著性差异(P<0.01)，可以认为第二天A549细胞生长达到对数生长期，因此之后两天传代一次，后续细胞可培养相同时间后再进行药物干预。
(2)顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
表1顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响(x±s，n＝6)
注：a:与阴性对照组，P＜0.01，给药24h,顺铂低浓度5μg/mL与中浓度10μg/mL、高浓度20μg/mL给药组之间有显著性差异。
由表1可知，相同给药时间，随着对照药物给药剂量的增加，顺铂对人肺腺癌A549细胞的抑制作用增强，呈现浓度依赖性增加。顺铂低浓度5μg/mL与中浓度10μg/mL、高浓度20μg/mL给药组之间有显著性差异，但中、高浓度之间无显著差异，而且IC50接近中浓度顺铂组，故后续顺铂给药采用10μg/mL。
(3)芜菁中性多糖对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
表2芜菁中性多糖对人肺腺癌A549细胞增殖的影响(x±s，n＝6)
注：a P＜0.01vs与阴性对照组，给药24h，各给药组之间也有显著性差异。
相同给药时间，随着芜菁中性多糖给药剂量的增大，多糖对人肺腺癌A549细胞的抑制作用增强，呈现浓度依赖性增加。
(4)不同浓度芜菁中性多糖对A549细胞形态的影响
如图2所示，图2A细胞形态正常，呈梭形，细胞生长密集；图2B细胞形态发生变化，大多细胞皱缩，且数量减少；图2C部分细胞形态发生变化，呈皱缩样，变圆；图2D少量细胞形态发生变化，较阴性对照组相比，细胞生长缓慢，且少量细胞皱缩呈圆形。
(5)人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达
表3人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达(x±s,n＝6)
注：给药24h，a P＜0.01vs与阴性对照组。
如表3所示，相同给药时间，随着芜菁中性多糖给药剂量的增大(400-600μg/mL)，使人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达显著升高，促进了细胞的凋亡，故药物毒性可能与促进细胞凋亡的机制相关。
综上所述，随着给药剂量的增加，抑制率逐步增加；不同浓度芜菁中性多糖可以改变A549细胞的形态；相同给药时间，随着芜菁中性多糖给药剂量的增大，使人肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达水平升高，促进了细胞凋亡。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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