基于人突变蛋白为基础的gdh抑制剂高通量筛选方法
阅读说明：本技术 基于人突变蛋白为基础的gdh抑制剂高通量筛选方法 (GDH inhibitor high-flux screening method based on human mutant protein ) 是由 李长红 储春霞 袁月 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法,达到筛选的抑制剂接近生理状态,涉及药物筛选技术领域,其技术方案要点是：包括以下步骤,步骤一,突变基因的质粒构建和制备携带突变基因质粒的逆转录病毒,该质粒装有红色荧光蛋白；步骤二,细胞转染：步骤三,酶学检测：绘制GDH活性抑制曲线,若待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移,则表明该化合物具有抑制GDH的活性。(The invention discloses a GDH inhibitor high-flux screening method based on human mutant protein, which achieves that the screened inhibitor is close to the physiological state, relates to the technical field of drug screening, and has the technical scheme that: the method comprises the following steps of firstly, constructing a mutant gene plasmid and preparing a retrovirus carrying the mutant gene plasmid, wherein the plasmid is filled with red fluorescent protein; step two, cell transfection: step three, enzymatic detection: a GDH activity inhibition curve is plotted, and if the compound to be screened can shift the GDH inhibition curve to the left, the compound is indicated to have GDH inhibitory activity.)
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域,更具体地说，它涉及一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法。
背景技术
新生儿低血糖是威胁新生儿健康甚至生命的严重疾病，反复发作的严重低血糖不仅威胁生命也能造成永久且不可逆的脑功能伤害，发生脑功能损害的比例高达60%～70%，终身致残，给家庭和社会都带来严重的伤害和负担。因为引起低血糖的原因复杂（已经发现了至少11个致病基因），主要致病基因包括：氨基酸代谢关键酶，谷氨酸脱氢酶（GDH）获得功能突变等。
谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）是氨基酸代谢的关键酶，GDH获得功能突变是新生儿低血糖的一个亚型，病人不仅有低血糖，还有肝肾功能损害造成的高氨血症及脑功能损害造成的癫痫和脑发育延迟，学习能力障碍等，是一个全身的系统性疾病，目前仅仅用二氮嗪控制低血糖，对脑功能障碍及肝肾损害没有任何治疗办法，所以急需要一个针对突变GDH的全身性的抑制剂。
目前，高通量筛选是当前创新药物发现的重要模式，GDH抑制剂的研发需要在化合物库中通过高通量药物筛选的办法找到GDH酶的抑制剂。目前的筛选办法是基于牛肝脏GDH为基础的，由于是基于牛肝脏GDH为基础的，因此细胞内表达的GDH无法保持了人体细胞内的微环境，无法具备完整的相关蛋白调节及小分子变构调节的环境，最终导致筛选体系无法接近生理状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，达到筛选的抑制剂接近生理状态。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤，
步骤一，突变基因的质粒构建和制备携带突变基因质粒的逆转录病毒，该质粒装有红色荧光蛋白；
步骤二，细胞转染：在培养基中加入携带了突变基因质粒的逆转录病毒，转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下判断红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，达到60%以上，就收取细胞，冻存在-80℃冰箱；
步骤三，酶学检测：冻存细胞化冻后，加入细胞裂解液，匀浆破损细胞，确定蛋白含量，之后用0.1 M 磷酸缓冲液将裂解液的蛋白稀释，随后待筛选的化合物经系列稀释后加入反应体系中，所述反应体系中包括谷氨酸和NAD+，酶学反应是基于如下反应：
谷氨酸 + NAD+ àalpha-酮戊二酸 + NH4++ NADH
绘制GDH活性抑制曲线，若待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，则表明该化合物具有抑制GDH的活性。
通过采用上述技术方案，该质粒装有红色荧光蛋白可以直接检验细胞转染的效率，在培养基中加入携带了突变基因质粒的逆转录病毒，转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下判断红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，GTP是GDH的天然细胞内抑制剂，突变GDH获得功能的特点表现为对GTP的敏感性降低，抑制曲线明显右移，在酶学检测中，待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，提示以上化合物具有抑制GDH的活性，细胞内表达的GDH保持了细胞内的微环境，具备完整的相关蛋白调节及小分子变构调节的环境，筛选体系更接近生理状态，此外突变基因的质粒构建为从在先天性高胰岛素血症病人中发现的GDH突变，用从病人身上发现的突变蛋白为筛选模板，筛选的抑制剂有直接的临床指导意义。
优选的，步骤三中，酶反应在0.1 M，pH 7.5的磷酸缓冲液中进行，NAD+ 浓度为0.2mM，谷氨酸钠的浓度为50 mM， 加入反应的细胞裂解液的蛋白浓度为1 mg/mL，每个反应添加5 ul，所有反应溶液都在实验当日新鲜配置，酶反应用酶标仪读数，测定反应波长为340nm，反应在384孔板中进行，反应体系总容量是25 ul。
优选的，步骤三中，待筛选的化合物经系列稀释后加入反应体系中，每个待筛选化合物都从最高浓度稀释，按照每次稀释1倍，共稀释11次。
优选的，0.1 M 磷酸缓冲液为pH 7.0，并加入 1 mM EDTA。
优选的，所述待筛选化合物在反应体系中的浓度范围为～mol/L。
优选的，步骤二中细胞转染中用到的细胞为239T细胞。
优选的，步骤一中突变基因的质粒构建，首先用标准分子生物学的方法做GDH基因的点突变，GDH基因的点突变用从先天性高胰岛素血症病人身上发现的突变蛋白为筛选模板。
优选的，GDH基因的点突变分别为H454Y、S445L、R221L、V453M和R269H的五个点位的基因突变。
综上所述，本发明具有以下有益效果：该质粒装有红色荧光蛋白可以直接检验细胞转染的效率，在培养基中加入携带了突变基因质粒的逆转录病毒，转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下判断红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，GTP是GDH的天然细胞内抑制剂，突变GDH获得功能的特点表现为对GTP的敏感性降低，抑制曲线明显右移，在酶学检测中，待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，提示以上化合物具有抑制GDH的活性，细胞内表达的GDH保持了细胞内的微环境，具备完整的相关蛋白调节及小分子变构调节的环境，筛选体系更接近生理状态，此外突变基因的质粒构建为从在先天性高胰岛素血症病人中发现的GDH突变，用从病人身上发现的突变蛋白为筛选模板，筛选的抑制剂有直接的临床指导意义。
附图说明
图1为GTP浓度对野生型人GDH（WT）以及不同获得功能突变的GDH活性的影响；
图2为三个待筛选化合物Comp-1,Comp-2和Comp-3对突变R221L人GDH的抑制作用曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤，
步骤一，突变基因的质粒构建和制备携带突变基因质粒的逆转录病毒，该质粒装有红色荧光蛋白；五个GDH突变（H454Y、S445L、R221L、V453M和R269H）都是在先天性高胰岛素血症病人中发现的，每个突变都是通过点突变表达于逆转录病毒质粒上。
首先用标准分子生物学的方法做GDH基因的点突变，以H454Y为例，1532位“C”突变为“T”。
（1）引物设计：
上游引物：CATCTGAGAAAGACATCGTGTACTCCTGGCTTGG
下游引物：ACACGATGTCTTTCTCAGATGCACCCGATATC
（2） PCR克隆：
以原质粒为模板，进行PCR扩增（10 ul即可）；
（3） 从上述PCR体系中取2-3 ul，核酸电泳验证大小,若大小正确，在剩下的反应体系中加入0.5 ul DpnI，37℃消化>3h（或过夜）；
（4）将步骤三的反应液吸取5 ul转化DH5a化转感受态；
（5）挑取单克隆，测序验证是否突变成功；
（6）送生物公司，制备携带该突变基因质粒的lenti病毒；
（7）相同的方法制备携带S445L、R221L、V453M和R269H突变基因质粒的lenti病毒。
S445L，1505和1506位“TC”突变为“CT”，设计上游引物为CAGAGTTCCAAGACAGGATACTGGGTGCATCTGA，下游引物为 AGTATCCTGTCTTGGAACTCTGCCGTGGGTACA。
R221L，833位“G”突变为“T”，设计上游引物为ACGCATCTCTGCTACTGGCCTTGGTGTCTTCCA，下游引物为AGGCCAGTAGCAGAGATGCGTCCATGGATTCC。
V453M，1529位“G”突变为“A”，设计上游引物为GTGCATCTGAGAAAGACATCATGCACTCTGGCT ，下游引物为TGATGTCTTTCTCAGATGCACCCGATATCCTG。
R269H，978位“G”突变为“A”，设计上游引物为CACTCTATGAGATATTTACATCATTTTGGTGCTAA，下游引物为 TGATGTAAATATCTCATAGAGTGTAGGCCCAC。
其余过程均与上述（2）~（5）一致。
步骤二，细胞转染：
239T细胞作为突变基因的表达体系，具体转染步骤如下：
Day 0：将HEK 293细胞用0.25%胰酶消化液进行消化，消化后计数使细胞悬液浓度保持在6×106/mL左右，用13mL DMEM培养基(含血清但不含抗生素)中充分混匀，加入100 mm的培养皿中，放置 37℃，5%CO2培养过夜(约20 -24小时)；
Day 1：感染前2小时，弃去培养液，加入8.5mL新DMEM培养液(不含血清但不含抗生素)，将1.5mL病毒预混合液加入100mm培养皿中，37℃，5% CO2培养(16-18小时，可延长感染时间至24小时)。如果可能的话，在感染期间要摇晃几次。
Day2：弃去培养液，加入15mL新DMEM培养液（含血清不含抗生素），在37℃，5% CO2培养箱中培养。如果细胞几乎达到融合，可将细胞分离到两到三个新的100mm的培养皿；
Day 4-5：转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，达到60%以上，就可以收取细胞(使用0.5%的胰蛋白酶)，用冷PBS洗涤2次，将细胞分离到15-16个1.5mL EP试管中，离心（13000rpm 1min），弃PBS，于-80℃冰箱保存。
注：如果感染效果不佳，可在第3天再次感染。
五个GDH突变（H454Y、S445L、R221L、V453M和R269H）都是在先天性高胰岛素血症病人中发现的，每个突变都是通过点突变表达于lenti病毒（逆转录病毒）质粒上，通过转染293T细胞后表达的。GTP是GDH的天然细胞内抑制剂，突变GDH获得功能的特点表现为对GTP的敏感性降低，抑制曲线明显右移（如图1）。
步骤三，酶学检测：从步骤二中选取R221L的GDH基因的点突变后转染的细胞，冻存细胞化冻后，加入细胞裂解液，匀浆破损细胞，确定蛋白含量，之后用0.1 M 磷酸缓冲液（pH7.0，加 1 mM EDTA）把裂解液的蛋白稀释到理想浓度（大约1 mg/mL），随后待筛选的化合物经系列稀释后加入反应体系中，待筛选化合物所想达到的效果是具有抑制GDH的活性，反应体系中包括谷氨酸和NAD+，酶学反应是基于如下反应：
谷氨酸 + NAD+ àalpha-酮戊二酸 + NH4++ NADH
酶反应在0.1 M，pH 7.5的磷酸缓冲液中进行，NAD+ 浓度为0.2 mM，谷氨酸钠的浓度为50 mM。加入反应的细胞裂解液的蛋白浓度为1 mg/mL，每个反应添加5 ul，但根据反应速度做微调。所有反应溶液都在实验当日新鲜配置。酶反应用BMG公司的Clariostar酶标仪读数，测定反应波长为340 nm，反应在384孔板中进行，反应体系总容量是25 ul，选取三种待筛选化合物，该三种待筛选化合物所想达到的效果是具有抑制GDH的活性，每个待筛选的化合物都从最高浓度稀释，按照每次稀释1倍，共稀释11次，如最低浓度为1，则最高浓度为211。
用酶标仪读取波长340nm的吸收光，反应时间1小时。GDH抑制剂的IC50 值的计算：用软件Prism 6.0计算GDH抑制剂的IC50 。
绘制活性抑制曲线，如图2，显示这三种待筛选化合物均能使GDH抑制曲线左移，提示以上化合物具有抑制GDH的活性，细胞内表达的GDH保持了细胞内的微环境，具备完整的相关蛋白调节及小分子变构调节的环境，筛选体系更接近生理状态，此外突变基因的质粒构建为从在先天性高胰岛素血症病人中发现的GDH突变，用从病人身上发现的突变蛋白为筛选模板，筛选的抑制剂有直接的临床指导意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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