N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用
阅读说明：本技术 N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用 (Application of N-acetylglucosamine as marker in preparation of ischemic cerebral apoplexy diagnosis reagent ) 是由 寇俊萍 马慧芬 李芳� 宫帅帅 张媛媛 余伯阳 于 2021-05-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用；本发明表明N-乙酰葡萄糖胺在缺血性脑中风和非缺血性脑中风对照者血清中的差异性表达,以N-乙酰葡萄糖胺作为标志物,对其血清中的代谢水平进行定量检测,同时,可将N-乙酰葡萄糖胺与调控酶N-乙酰葡萄糖胺激酶结合,减轻脑损伤。因此,N-乙酰葡萄糖胺代谢水平检测在缺血性脑中风的诊断中具有很高的临床应用价值,为缺血性脑中风的快速有效诊断提供了一种全新的途径。(The invention discloses an application of N-acetylglucosamine as a marker in preparing a reagent for diagnosing ischemic cerebral apoplexy; the invention shows that the N-acetylglucosamine is differentially expressed in the serum of ischemic cerebral apoplexy and non-ischemic cerebral apoplexy contrast persons, the N-acetylglucosamine is taken as a marker to quantitatively detect the metabolic level in the serum, and simultaneously, the N-acetylglucosamine can be combined with a regulatory enzyme N-acetylglucosamine kinase to reduce the brain injury. Therefore, the N-acetylglucosamine metabolic level detection has high clinical application value in the diagnosis of ischemic cerebral apoplexy, and provides a brand new way for the rapid and effective diagnosis of ischemic cerebral apoplexy.)
技术领域
本发明涉及N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用，属于医学诊断领域。
背景技术
脑卒中是由血管原因引起的中枢神经系统(即大脑、视网膜或脊髓)急性局灶性损伤引起的神经功能缺陷，可大致分为两类，缺血性和出血性脑卒中。其中，缺血性脑卒中是由动脉阻塞引起的缺血性梗死，是脑卒中的主要类型。目前，溶栓治疗是临床上治疗急性缺血性脑卒中最有效的方法，但治疗时间窗极窄且易引起脑缺血再灌注损伤，加剧疾病的恶化程度。因此，对于缺血性脑卒中的及时诊断与有效治疗越来越受到广大学者的关注。
目前，脑中风的临床诊断主要依靠临床医师对患者症状和体征的判断及脑部成像检查结果。然而，其他疾病如偏头痛和癫痫发作等与脑中风临床症状相似，脑部成像虽然是目前诊断脑中风比较直接的方式，但也具有一定的局限性比如一些患者的金属植入物或者躁动不安都会影响检查。因此，识别和监测在缺血性脑卒中自然病程中存在的分子生物标志物将有助于脑卒中的诊断、预后及制定合理的治疗策略。
代谢组学是系统生物学的重要组成部分，以循环小分子化合物为研究对象，观察在不同生理或病理条件下小分子化合物的变化情况，从而反映引起这些代谢物产生变化的代谢网络活动，比如药物或饮食摄入和肠道微生物群的变化，并由此产生有关所研究系统的潜在生物学状态基本信息。因此，在人类流行病学，药效评价和基础机制研究等领域中应用越来越多，甚至可以指导临床药物个性化使用或预测疾病的发生概率。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中存在的缺血性脑中风的临床诊断手段的缺陷和不足，提供一种N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用。
技术方案：本发明提供了N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用。
本发明检测N-乙酰葡萄糖胺代谢水平的试剂在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用。
进一步的，所述试剂还包括调控酶N-乙酰葡萄糖胺激酶。
进一步的，所述诊断缺血性脑中风试剂包括从偏头痛、癫痫或者脑中风包括缺血性脑中风和出血性脑中风中诊断缺血性脑中风的试剂；所述缺血性脑中风为早期缺血性脑中风。
本发明用于诊断缺血性脑中风的试剂盒，其特征在于，包括作为标志物的N-乙酰葡萄糖胺，以及能够用于检测N-乙酰葡萄糖胺代谢水平的辅助试剂。
进一步的，还包括作为调控酶的N-乙酰葡萄糖胺激酶。
其中，所述试剂盒可以单独采用N-乙酰葡萄糖胺作为标志物，完成缺血性脑中风的早期筛查与鉴别诊断。
所述检测试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管等，其中可放置一种组分，并且可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
本发明基于申请人发现N-乙酰葡萄糖胺在缺血性脑中风和非缺血性脑中风对照者血清中的差异性表达，以N-乙酰葡萄糖胺作为标志物，对其血清中的代谢水平进行定量检测，可以用作缺血性脑中风的特异性诊断指标。此外，申请人还通过将N-乙酰葡萄糖胺与调控酶N-乙酰葡萄糖胺激酶结合，减轻脑损伤。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明公开了与缺血性脑中风相关的代谢标志物N-乙酰葡萄糖胺，通过检测上述代谢物水平可以判断受试者是否患有缺血性脑中风，具有较高的准确度和特异性，以期实现缺血性脑中风的早期诊断，从而在缺血性脑中风早期进行干预治疗，提高治疗效果；
(2)本发明还确证了代谢物N-乙酰葡萄糖胺及其调控酶N-乙酰葡萄糖胺激酶在缺血性脑中风中的功能，代谢物N-乙酰葡萄糖胺在体内的水平升高可促进MCAO/R诱导的脑损伤，结合其调控酶N-乙酰葡萄糖胺激酶，为防治缺血性脑中风提供潜在靶点，通过协同作用可改善MCAO/R诱导的脑损伤，使脑中风导致的脑梗死体积降低到20％。
附图说明
图1：代谢物调控酶功能验证试验中所构建的N-乙酰葡萄糖胺激酶NAGK载体信息；
图2：N-乙酰葡萄糖胺在脑中风小鼠血清中的水平；
图3：N-乙酰葡萄糖胺在临床脑中风患者血清中的水平；
图4：根据临床脑中风患者血清中N-乙酰葡萄糖胺的水平所绘制的受试者工作曲线(ROC)；
图5：N-乙酰葡萄糖胺对MCAO/R诱导的脑梗死体积的影响；
图6：N-乙酰葡萄糖胺对MCAO/R诱导的脑梗死体积统计；
图7：N-乙酰葡萄糖胺对MCAO/R诱导的脑组织损伤程度的影响；
图8：N-乙酰葡萄糖胺对MCAO/R诱导的神经功能障碍的影响；
图9：过表达N-乙酰葡萄糖胺激酶对血清中N-乙酰葡萄糖胺水平的影响；
图10：过表达N-乙酰葡萄糖胺激酶对MCAO/R诱导的脑梗死体积的影响；
图11：过表达N-乙酰葡萄糖胺激酶对MCAO/R诱导的脑梗死体积统计；
图12：过表达N-乙酰葡萄糖胺激酶对MCAO/R诱导的脑组织损伤程度的影响；
图13：过表达N-乙酰葡萄糖胺激酶对MCAO/R诱导的神经功能障碍的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用生物材料、试剂和试剂盒等均可以通过常规商业购买获得，所用实验技术均为本领域内的常规操作或参照相应商品的说明书进行操作。
实施例1
靶向代谢组学验证：
1、制备大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)小鼠模型
小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠，麻醉后，仰卧位固定，颈部中线切口。分离并暴露右侧的颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，依次在颈总动脉近心端预留结扎线，远心端结扎颈外动脉，并游离颈外动脉远端。沿颈内动脉向深部游离一段颈内动脉，于颈外动脉近心端预留结扎线。采用小型无创血管夹夹闭近心端颈总动脉及远端颈内动脉，于颈外动脉远心端用显微剪刀剪一小口，插入线栓。通过颈总动脉分叉，进入颈内动脉。插入线段直至遇到轻微阻力，深度以过颈总动脉分叉8-9mm为宜，此时线段头端插入大脑前动脉约1mm。插线结束后，将预先放置于颈外动脉的结扎线缚紧。MCAO 60min后，分离暴露颈外动脉，松开固定线，拔除线栓，松开颈总和动脉结扎线实现再灌注，常规缝合颈部伤口。手术过程中动物肛温保持在37℃，术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒中自由饮水、进食。
2、样本采集和处理
小鼠样本：摘眼球法取血，将全血室温静置60min后，3500r/min离心10min取上清，分装后保存于-70℃备用。
临床样本：本实验经江苏省中医院共纳入272例研究对象的血清样本，样本保存于-70℃。研究对象经临床诊断分为健康对照组(Normal group)和脑中风组(Strokegroup)。临床样本信息如表1所示：
表1、临床样本信息
取50μL冻存血清样本，解冻后加入150μL含有内标化合物的甲醇，涡旋混匀后13000r/min 4℃离心10min，取上清，再次离心后取上清于进样瓶中，置于4℃待测。
色谱条件如表2所示：柱温，自动进样器和进样量分别设为25℃，4℃和5μL。流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈。梯度洗脱和流速如下表。每次进样前，色谱柱在初始流动相条件下平衡5min。
表2、色谱条件的梯度洗脱和流速
质谱条件：在电喷雾离子源(ESI)负离子模式下检测，信号采集选择反应检测模式(MRM)，GlcNAc碎裂规律为m/z 266.1→119.1，毛细管电压，喷嘴电压，气流，喷雾器压力，鞘气温度，鞘气流速，碰撞能和碎裂电压分别为，3500V，1500V，7L/min，50psi，350℃，12L/min，9V和55V。
3、靶向验证结果
如图2所示，代谢物N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)在MCAO/R小鼠血清中明显升高；如图3所示，代谢物N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)在脑中风患者血清中明显升高；以上结果都表明，脑中风是使血清中代谢物N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)水平明显升高的主要原因。
4、ROC曲线的绘制
可使用诸如受试者工作曲线(ROC)分析之类的工具来评估这样的测试的性能，或测试将疾病组与对照组区分开的准确度。ROC曲线是使用灵敏度作为y轴，将1-特异性作为x轴，使用各种截断值生成的灵敏度和特异度谱图的图形表示。在ROC曲线中，针对不同的截断点绘制了真阳性率(灵敏度)与FP率(100-特异性)的函数关系。ROC曲线上的每个点代表对应于特定决策阈值的灵敏度/特异性对。具有完美判别力的测试(两个分布中没有重叠)的ROC曲线穿过左上角(灵敏度为100％，特异度为100％)。因此，从质量上讲，曲线图越靠近左上角，测试的总体准确度越高。ROC曲线(AUC)下面积反映了测试的准确度，并显示在曲线图的左下角。如图4所示，本发明中ROC曲线下面积为0.9412，表明GlcNAc可以用于制备临床诊断脑中风的试剂，具有较高的准确度和特异性。
实施例2
代谢物功能验证：
1、TTC染色
造模MCAO/R后将各组小鼠脑组织取出，放入-70℃冰箱至脑组织完全冻住，取出在冰盒上将冻好的脑组织切成5片厚约2mm的冠状脑片，迅速将切好的脑片放入2％TTC溶液中，注意朝一个方向放置脑片。随后，在37℃烘箱中避光孵育30min。置于黑色纸板上拍照传入电脑，采用Image J图像分析软件测量脑梗死体积。计算公式如下：
梗死体积百分比＝右半脑梗死体积/脑总体积×100％；
梗死体积越大，脑中风越严重。一般情况下，MCAO/R引起的脑梗死体积为30％-40％；如图5和图6所示，给予GlcNAc后会增加脑中风诱导的脑梗死体积，增长至50％；如图10和图11所示，过表达NAGK后可明显降低脑中风诱导的脑梗死体积，使脑梗死体积降低到20％，由此可见，GlcNAc可加重脑中风，过表达NAGK可改善脑中风。
2、H&E染色
各组小鼠于再灌注24h后处死，取脑，将脑组织浸泡在装有4％多聚甲醛溶液的EP管中，送至江苏省药物安全性评价中心病理室检测。
3、神经功能学评分测定
缺血1h再灌注24h后，各组小鼠神经行为学评分参照Longa5分法，标准如下：0分：无明显神经损伤症状；1分：不能完全伸直左前爪；2分：行走时向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾斜；4分：意识昏迷，不能自发行走。因此，评分越高测试体神经功能障碍越严重。造模MCAO/R后，小鼠的神经功能学评分平均值约2.5，给予GlcNAc后可促进脑中风诱导的神经功能障碍，如图8；过表达NAGK后可改善脑中风诱导的神经功能障碍，如图13所示。结果说明GlcNAc可加重脑中风，过表达NAGK可改善脑中风。
4、结论：代谢物GlcNAc在脑中风中的功能
外源性给予代谢物GlcNAc后会增大MCAO/R诱导的脑梗死体积，促进神经功能障碍和脑组织病理损伤，结果表明GlcNAc的升高可以加重缺血性脑中风。
实施例3
代谢物调控酶功能验证
1、实验试剂及器材
N-乙酰葡萄糖胺激酶(NAGK)过表达腺相关病毒(AAV-NAGK)和空载腺病毒(AAV-control)由上海吉满生物科技有限公司提供，经检测：GPAAV-CMV-M_Nagk-EF1-ZsGreen1-WPRE的滴度为1.21E+13VG/mL；微量注射器(1μL)；脑定位仪(Stoelting，美国)。
2、合成引物
载体信息如图1；设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致，引物序列如下：
3、脑原位注射腺相关病毒
将小鼠用异氟烷麻醉后，用耳杆将小鼠头部固定在脑定位仪上，同时继续给予小鼠口鼻异氟烷以保证手术过程中小鼠的麻醉状态，调整好卡尺。用眼科剪剪开小鼠的头部皮肤，暴露头骨，碘伏消毒后用棉签将头部右侧脑滑膜轻轻拨开。将吸取1μL腺相关病毒的微量注射器固定于定位仪上，并调整位置使注射器可以插入脑皮层。缓慢注入腺相关病毒(1μL/5min)，注射结束后轻轻拔出注射器，快速用骨蜡封住注射器孔。正常缝合并用碘伏消毒后置于洁净的鼠笼，15天后开始实验。
4、动物分组
将20只给予AAV-control小鼠随机分为2组：假手术组(Sham，n＝10只)和模型组(MCAO/R，n＝10只)；将20只给予AAV-NAGK小鼠随机分为2组：假手术组(Sham，n＝10只)和模型组(MCAO/R，n＝10只)。
5、数据统计
所有数据采用Graphpad Prism 5软件进行统计，以mean±SD表示，对于两组间的比较用Students’t检验，当三组或三组以上比较时用单因素方差分析，后检验采用Dunnett’s test，P＜0.05认为有统计学意义。如图2所示，造模MCAO/R后血清中代谢物GlcNAc明显升高，经对比后发现有显著性差异。如图3所示，脑中风患者血清中代谢物GlcNAc明显升高，经对比后发现有显著性差异。如图6和图7所示，GlcNAc可明显增大MCAO/R诱导的脑梗死体积，促进神经功能障碍，经对比后发现有显著性差异。如图9所示，过表达NAGK可明显降低MCAO/R诱导的GlcNAc水平升高，经对比后发现有显著性差异。如图11和图13所示，过表达NAGK可明显降低MCAO/R诱导的脑梗死体积和神经功能障碍，经对比后发现有显著性差异。
6、结论：代谢物GlcNAc调控酶NAGK在脑中风中的功能
如图9所示，造模MCAO/R后代谢物GlcNAc明显升高，高水平的GlcNAc可促进脑中风诱导的脑损伤，增大脑梗死面积，而过表达NAGK后可明显降低体内代谢物GlcNAc水平，从而明显降低MCAO/R诱导的脑梗死体积和脑组织损伤，并明显改善神经功能障碍，结果表明NAGK是防治缺血性脑中风的潜在靶点。
本研究首次发现了与缺血性脑中风相关的代谢标志物N-乙酰葡萄糖胺，通过检测上述代谢物水平可以判断受试者是否患有缺血性脑中风，以期实现缺血性脑中风的早期诊断，从而在缺血性脑中风早期进行干预治疗，提高治疗效果。另外，本研究还确证了代谢物GlcNAc及其代谢酶NAGK在缺血性脑中风中的功能，代谢物GlcNAc在体内的水平升高可促进MCAO/R诱导的脑损伤，而过表达其代谢酶NAGK可改善MCAO/R诱导的脑损伤，从而为防治缺血性脑中风提供潜在靶点。
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