具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。本发明实施例中所使用的生物材料和试剂，如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1治疗剂量的C16对小鼠无毒副作用

1实验材料与方法

1)小鼠的给药、饲养与取材

本发明使用的C57BL/6种属雄性小鼠(8周龄，体重20-24g)购自南京医科大学实验动物中心，饲养于南京医科大学实验动物中心SPF级屏障环境中，动物自由进食，维持12小时光照和12小时黑暗的昼夜节律。实验室温度：20-25℃，湿度50±5％。小鼠在适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝10)和C16组(n＝10)。

本发明使用C16(纯度＞99％)购自Santa Cruz公司。溶媒为生理盐水。给药组小鼠剂量分别为300μg/kg，通过腹腔注射进行给药，给药体积为每10g体重给0.1ml；对照组小鼠腹腔注射给予同样体积的上述溶媒，每天给药一次，共给药7天。末次给药24h后采集小鼠血清，进行血清生化分析血清中肾功能、肝功能和心功能等标志物的浓度，以评估C16对正常小鼠的肾、肝、心功能的影响。

2)实验结果

为研究高剂量组C16重复给药的安全性，在小鼠连续7天重复给药300μg/kg C16后，分析其血清中各脏器生化指标的变化情况，以评估C16对肾、肝、心功能的影响。从结果可知，在此情况下C16对肾功能标志物血清尿素氮(图1A)和血清肌酐(图1B)浓度无影响，对肝功能标志物谷丙转氨酶(图1C)、谷草转氨酶(图1D)无影响，对心功能标志物谷草转氨酶(图1D)、乳酸脱氢酶(图1E)和肌酸激酶(图1F)无影响，这些结果说明C16在300μg/kg这一治疗剂量下对肾、肝、心无明显毒性。

实施例2C16改善UUO模型中的肾纤维化

1实验材料

本发明使用的C57BL/6种属小鼠和C16(纯度≥99％)与实施例1中的来源相同。

2实验方法

2.1动物给药、造模与取材

雄性C57BL/6小鼠30只(购买时7周龄，体重20-24g)饲养于南京医科大学实验动物中心SPF级屏障环境中，动物自由进食，维持12小时光照和12小时黑暗的昼夜节律。实验室温度：20-25℃，湿度50±5％。小鼠在适应性饲养1周后随机分为对照组和C16组。其中，C16组分成低剂量组(100ug/kg)和高剂量组(300ug/kg)，每组十只小鼠。分组后，对照组小鼠和C16组小鼠分别每天进行一次腹腔注射溶媒或C16。具体操作与实施例1中相同。第一次给药后24h进行单侧输尿管结扎手术(unilateral ureteral obstruction，UUO)，术后7天对小鼠进行安乐死后取双侧肾脏，去除肾包膜后取肾皮质保存于-80℃以供提取RNA和蛋白，或将肾脏组织采用多聚甲醛固定后进行病理检验。

2.2肾皮质病理检验

肾脏组织经多聚甲醛固定、石蜡包理，组织切片后进行组织学检验。采用马松三色法染色，观察肾间质纤维化程度。其中蓝色面积指示纤维化区域。

3实验结果

为了评估检测C16对肾纤维化的作用，我们采用马松三色法染色检测了小鼠肾皮质病理和间质纤维化程度。UUO造模7天后，肾皮质出现明显的间质纤维化和肾小管扩张坏死等肾脏病理损伤，而C16治疗后，其相应肾脏病理损伤都显者下降(图2)。因此，C16可以显著减轻肾脏纤维化病理和肾小管损伤。这些结果表明C16可以减轻肾小管间质纤维化的病理改变。

实施例3C16降低了肾脏组织中纤维化指标的表达水平

1.实验材料与方法

小鼠和C16的来源和使用同实施例2中所述。小鼠UUO模型的建立方法、组织取材同实施例2。

1)RT-PCR

采用Takara公司RNAiso试剂按照说明书提取样本中的RNA后，利用Vazyme公司逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，并采用SYBR green PCR mix结合相应引物进行RT-PCR检测。

1)蛋白质免疫印迹

肾脏组织提取蛋白，按照文献方法操作。

2)统计分析

使用均值±SEM表示数据。多组间比较用方差分析(ANOVA)，两组间数据比较用T检验。以P<0.05为具有统计学意义。

2.实验结果

为了进一步确证C16对UUO模型中肾纤维化具有治疗作用，我们检测了肾皮质中肾纤维化特异性分子指标Fibronectin、α-sma、collagen I等的表达情况。C16显著降低了UUO模型中的纤维化指标fibronectin的蛋白水平，且呈剂量依赖性(图3A)。如图3的RT-PCR检测显示，Fibronectin、α-sma、collagen I等肾纤维化指标在小鼠UUO模型肾皮质中显著高表达，而C16可显著降低其表达水平(图3B-D)。因此，这些纤维化指标在mRNA水平和蛋白水平的变化结果进一步说明C16可减轻UUO模型中的肾间质纤维化。

实施例4C16显著抑制TGF-β诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

1.实验材料与方法

小鼠肾小管上皮细胞(RTECs)采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究PKR及其特异性抑制剂C16对肾小管上皮细胞的影响，我们采用TGF-β1处理来在体外诱导RTECs纤维化。我们将RTECs在低血清培养基中进行0.5μM的C16预处理2h，之后加入终浓度为5ng/ml的TGF-β1模拟慢性肾纤维化过程中的肾小管上皮细胞纤维化，24h后收集细胞提取总蛋白进行Western Blot检测，或提取RNA进行RT-PCR检测Collegen I、Collegen III。纤维化指标分子Fibronectin抗体购于Abcam公司。内参蛋白β-actin及二抗购于南京巴傲得公司。数据的统计与分析同实施例3所述。

2.实验结果

TGF-β1刺激RTECs可在体外模拟慢性肾脏病中肾小管上皮纤维化。在TGF-β1的刺激下，肾间质成纤维细胞活化可由fibronectin等细胞外基质的表达水平来进行检测。C16在蛋白水平上显著抑制了TGF-β1诱导的纤维化基因fibronection的表达上调情况(图4A)。给予C16可抑制TGF-β诱导的RTECs细胞纤维化基因Collegen I、Collegen III mRNA的表达上调(图4B&C)。这些结果说明C16抑制了肾小管上皮细胞的纤维化。

实施例5C16显著抑制TGF-β诱导的肾间质成纤维细胞活化。

1.实验材料与方法

大鼠肾间质成纤维细胞NRK-49F采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究C16对肾间质成纤维细胞活化的影响，我们采用TGF-β1处理来在体外诱导NRK-49F细胞活化，我们将NRK-49F在低血清培养基中加入0.5μM的C16预处理2h，之后加入终浓度为5ng/ml的TGF-β1模拟慢性肾纤维化过程中的成纤维细胞活化，24h后收集细胞总蛋白进行Western Blot检测，或收集细胞，提取RNA后采用RT-PCR检测纤维化基因，fibronectin、α-sma、Vimentin、Collagen I和Collagen III的表达情况。纤维化指标分子Fibronectin抗体购于Abcam公司。内参蛋白GAPDH及二抗购于南京巴傲得公司。数据的统计与分析同实施例3所述。

2.实验结果

肾间质成纤维细胞的活化是导致肾间质纤维化的直接细胞机制，活化的成纤维细胞可产生大量细胞外基质，如fibronectin，Collagen I和Collagen III等，直接导致肾间质纤维化。在TGF-β1的刺激下，肾间质成纤维细胞活化可由fibronectin等细胞外基质的表达水平来进行检测。实验结果表明，在蛋白水平上，C16显著抑制了TGF-β1诱导的Fibronectin的表达(图5A)。与此一致的是，C16在mRNA水平上同样显著抑制了TGF-β1诱导的纤维化基因，fibronectin、α-sma、Vimentin、Collagen I和Collagen III的表达上调情况(图5B-F)。这些结果说明，C16显著抑制了TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞活化。

综上所述，本发明提供了化合物C16在制备防治慢性肾纤维化药物中的新用途，该抑制剂通过注射途径给药，通过抑制PKR，抑制成纤维细胞的过度激活和直接抑制肾小管上皮细胞纤维化的作用机制，有效抑制了肾纤维化，从而发挥防治慢性肾纤维化的目的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。