磺内酰胺-环己酮螺环衍生物1-3-51在制备治疗胃癌药物中的应用
阅读说明：本技术 磺内酰胺-环己酮螺环衍生物1-3-51在制备治疗胃癌药物中的应用 (Application of sultam-cyclohexanone spiro derivative 1-3-51 in preparation of medicine for treating gastric cancer ) 是由 欧阳勤 古晶 王纳 高梦圆 陈应春 胡长江 杨仕明 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及磺内酰胺-环己酮螺环衍生物1-3-51在制备治疗胃癌药物中的应用,所述药物显著抑制FOXM1的表达以及胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移,干扰FOXM1后,其抑制增殖,侵袭及迁移能力降低。(The invention relates to an application of sultam-cyclohexanone spiro derivative 1-3-51 in preparation of a medicine for treating gastric cancer, wherein the medicine remarkably inhibits the expression of FOXM1 and the proliferation, invasion and migration of gastric cancer cells, and after FOXM1 is interfered, the proliferation inhibition, invasion and migration capabilities are reduced.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及磺内酰胺-环己酮螺环衍生物1-3-51在制备治疗胃癌药物中的应用。
背景技术
胃癌(Gastric Cancer GC)是世界上常见消化系统恶性肿瘤之一，其高发病率和高死亡率已使其成为全世界特别是发展中国家人类公共卫生的一个重大问题，严重危害人体健康和浪费社会资源。目前50％的胃癌是在东亚确诊的，其中大部分病例发生在中国。而全球胃癌发病率和死亡率也在稳步上升，据2018年全球癌症统计，胃癌的发病率居世界第五位，死亡率居世界第三位，预计到2020年和2030年，胃癌将成为全球15大主要死因之一。尽管近年来胃癌的综合治疗取得一定的进展，但胃癌患者5年总体生存率仍很低，不到30％。究其原因，我国大多数胃癌患者初次诊断时已处于进展期，治疗方法有限，主要通过手术结合化疗方式，且有较高的复发率和转移率，胃癌细胞化疗耐药也是胃癌患者预后差的重要原因之一。因此，研究新型胃癌靶向治疗药物至关重要，对改善胃癌患者的治疗和预后有着十分重要的意义。
叉头盒蛋白M1(Forkhead box M1，FOXM1)是Forkhead超家族中的成员之一，是一类具有特定“翼状螺旋结构”DNA结合域的转录因子，包括FOXA、FOXC、FOXM、FOXO和FOXP等几个家族，Forkhead家族广泛参与了生命发生发展的过程，如胚胎发生、增殖、分化、凋亡、转化、肿瘤发生、寿命和代谢稳态，并且在细胞增殖和细胞周期进程中具有明确的作用，与肿瘤的发生也密切相关，其中FOXM1在2010年被评为年度分子。研究表明，FOXM1在多种肿瘤，如乳腺癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、鼻咽癌、喉癌、胃癌、卵巢癌等中普遍上调，肿瘤基因表达谱分析也证实FOXM1是人类恶性肿瘤中表达上调最频繁的基因之一。在胃癌中，FOXM1通路的活化及异常表达与胃癌患者的恶性生物学行为和不良预后密切相关，因此FOXM1被认为是预防和治疗人类癌症的一个潜在靶点。已有研究盐屋霉素A通过抑制FOXM1的表达进而抑制其下游靶基因Bcl-2和Mcl-1的表达以及caspase-3的裂解等来诱导细胞凋亡，硫链丝菌肽在2008年也首次被报道用作FOXM1的抑制剂，它可以干扰FOXM1与DNA结合从而干扰下游靶点的转录。同时研究表明盐屋霉素A还可以抑制母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶(MELK)，硫链丝菌肽也可以靶向Peroxiredoxin 3，但它们靶向FOXM1的特异性不高，临床应用受限。因此，寻找新型靶向FOXM1的小分子药物显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种磺内酰胺-环己酮螺环衍生物1-3-51(下称化合物1-3-51)在制备治疗胃癌药物中的应用，该药物显著抑制FOXM1的表达以及胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移，干扰FOXM1后，其抑制增殖，侵袭及迁移能力降低。
本发明的技术方案是：
磺内酰胺-环己酮螺环衍生物1-3-51在制备治疗胃癌药物中的应用。
所述磺内酰胺-环己酮螺环衍生物的的分子式为C24H21NO3S2，结构式为：
所述药物为叉头盒蛋白M1的抑制剂。
所述药物抑制胃癌细胞中FOXM1的表达。
所述药物抑制FOXM1下游靶基因Cyclin D1、MMP9的表达。
所述药物通过FOXM1抑制胃癌细胞BGC823、MKN45生长迁移和侵袭。
所述药物采用腹腔注射方式给药。
所述药物用量为0.5～5mg/日/公斤。
申请人通过化学合成方法学的研究构建了许多结构新颖的分子骨架。其中，部分化合物的复杂分子结构具有类天然产物的特征，表现出潜在的“类药性”。在前期开展的合成方法学研究中，发展了一类高选择性的不对称[3+3]环化反应，构建了一系列磺内酰胺-环己酮螺环衍生物。在对这类产物进行普遍生物活性评价的过程中，申请人发现其中的代表化合物1-3-51可有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭迁移，促进凋亡，进一步的机制研究发现其显著抑制FOXM1的表达，提示1-3-51可能是一个新型FOXM1小分子抑制剂，为靶向FOXM1小分子抑制剂的设计提供一定的理论基础与思路。
申请人采用CCK-8试剂盒检测1-3-51处理后的BGC823和MKN45细胞IC50；Westernblot检测胃癌细胞FOXM1表达；RT-qPCR检测胃癌细胞FOXM1及其下游分子Cyclin D1和MMP9mRNA表达；流式细胞术测定周期情况；Transwell实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力；在胃癌细胞BGC823、MKN45中转染FOXM1 shRNA质粒及其空载质粒，CCK8实验、Transwell实验分别检测胃癌细胞活性、迁移及侵袭等的变化。实验验证，本发明所述化合物1-3-51在胃癌细胞中可通过抑制FOXM1表达及其下游靶基因Cyclin D1和MMP9等分子的表达，进而降低胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，为靶向FOXM1的新型小分子抗癌药物提供新思路。
附图说明
图1为1-3-51在胃癌细胞中降低FOXM1蛋白及mRNA水平；其中，图1A：1-3-51的化学结构；图1B：1-3-51分别处理BGC823、MKN45细胞48h后采用CCK8测OD450值；图1C：不同浓度1-3-51处理BGC823、MKN45细胞后FOXM1蛋白及mRNA的表达情况；图1D：时间梯度1-3-51处理BGC823、MKN45细胞后FOXM1蛋白及mRNA的表达情况。
图2为1-3-51在胃癌细胞中降低FOXM1下游靶基因Cyclin D1、MMP9的mRNA水平的表达；其中，图2A：浓度梯度1-3-51处理BGC823、MKN45细胞后FOXM1下游靶基因Cyclin D1及MMP9 mRNA的表达情况；图2B：时间梯度1-3-51处理BGC823、MKN45细胞后FOXM1下游靶基因Cyclin D1及MMP9 mRNA的表达情况；
图3为检测1-3-51对胃癌细胞生长周期、迁移及侵袭的影响；其中，图3A：与DMSO组比，流式细胞术测定细胞周期；图3B：与DMSO组比，Transwell实验检测细胞迁移及侵袭；
图4为检测1-3-51对BGC823细胞中FOXM1部分敲除细胞增殖、迁移及侵袭的变化，其中，图4A：Western blot检测BGC823细胞中FOXM1敲降后FOXM1蛋白表达变化；图4B：CCK-8实验检测1-3-51对BGC823 FOXM1敲降前后细胞增殖能力变化；图4C：Transwell实验检测1-3-51BGC823 FOXM1敲降前后细胞胞迁移及侵袭变化。
具体实施方式
本实施例所用试剂：
人胃癌细胞株BGC823、MKN45购买自上海富衡生物；
高糖DMEM培养基、RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司；
胎牛血清购自美国Gibco公司；
抗人FOXM1抗体购自美国Cell SignalTechnology公司；
抗人TUBULIN一抗，HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，CCK8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、结晶紫购自中国上海碧云天公司；
多聚甲醛购自美国博士德公司；
TRIzol、逆转录试剂盒和SYBR Green试剂购自日本TAKARA公司；
FOXM1 shRNA及其空载质粒购自美国Santa公司；
转染试剂LipofectamineTM 2000和质粒小提试剂盒购自美国Invitrogen公司；
APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI购自美国BioLegend公司；
PVDF膜、ECL化学发光试剂盒购自德国Millipore公司。
实施例1细胞的制备、检测及提取
1.1细胞培养
人胃癌细胞BGC823、MKN45分别采用DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和10mg/L链霉素)培养，培养条件：饱和湿度、37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。当细胞生长至80-90％时，1：3消化传代。
1.2 CCK8检测细胞活性
将细胞以4000/孔接种在96孔板后，根据CCK8说明书，在收获时将10μL CCK8添加到每个孔中。加入CCK81h后，在酶标仪450nm波长处的光密度值来测定细胞活性。
1.3提取细胞总蛋白
处理后的细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤两次，尽量弃去PBS，在每孔中加入适量含蛋白酶抑制剂的RIPA(强)裂解液，用细胞刮刮下细胞，转移到新的EP管中，振荡器上每隔1min震荡30s,共3次，冰上裂解30min，然后4℃，14 000rpm，离心15min，最后吸取上清即为总蛋白并使用BCA法测其浓度。
1.4提取RNA
处理后的细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤两次，尽量弃去PBS，在每孔中加入1mL TRIzol，静置1min，吹打使细胞裂解，收集细胞，振荡器上每隔1min震荡30s,共3次，冰上裂解5min；向上述裂解液中加入200μL三氯甲烷，轻微混匀，室温静置15min；离心：4℃，12000g，15min；取上清于无DNA、RNA酶EP管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置5-10min；离心：4℃，12 000g，10min；弃上清，加入1mL 75％酒精，离心：4℃，8000g，5min；再次离心，小心吸尽残余酒精，晾干；加入50μL DEPC水，溶解沉淀，混匀；测浓度。
1.5逆转录
配制如下反应体系:5X gDNA Eraser Buffer2.0μL，gDNA Eraser1.0μL，RNA1.0μg，RNaseFree dH2O补足至10μL(反应条件:42℃，10min)；向上述反应产物中加入如下体系：5×PrimeScript Buffer2(for Real Time)4.0μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL(反应条件:37℃、15min，85℃、5s)；向反应产物cDNA中加入20μL DEPC水，备用。
1.6 RT-q PCR
配制如下体系：TB Green Premix Ex TaqⅡ10.0μL，cDNA 2.0μL，上下游引物各0.8μL，Rox 0.4μL，DEPC水6μL，总体积20μL(反应条件:95℃、15s，58℃、30s)，40个循环，设置3个复孔，最后的数值用Prism 8进行作图和统计学分析。
1.7 WesternBlot
蛋白上样量为30μg，使用10％SDS-PAGE凝胶电泳分离；湿转法转移蛋白至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭30min-1h，加入一抗4℃过夜(FOXM1 1∶1 000，TUBULIN 1∶10 000)，二抗室温孵育1h(山羊抗鼠1∶5000，山羊抗兔1∶10000)，ECL化学发光法显示结果。
1.8 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移
侵袭实验步骤：吸取2.5mg/mL的Matergel添加到Transwell小室的上室中，在37℃培养箱内放置2h。取胃癌细胞采用无血清的细胞培养液重悬细胞浓度为2x105/mL，吸取200μL添加到上室中，然后在下室中添加550μL的含血清的细胞培养液，放在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。PBS洗涤小室，甲醛固定，0.1％的结晶紫染色，镜下记录细胞侵袭数目即细胞穿膜数目。细胞迁移实验同侵袭实验，无Matergel包被步骤。
1.9流式细胞术测定细胞周期
处理后的细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤两次，尽量弃去PBS，收集并洗涤细胞2次，用70％酒精4℃固定过夜，预冷的PBS洗涤细胞两次，加入300μLPI避光染色30min，上流式细胞仪分析细胞周期率。
1.10统计学分析
采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，数据以x±s表示，组间差异比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
实施例2化合物1-3-51在胃癌细胞中抑制FOXM1的表达
化学合成方法(He X L,Xiao Y C,Du W,et al.Enantioselective Formal[3+3]Cycloadditions of Ketones and Cyclic 1-Azadienes by Cascade Enamine-EnamineCatalysis[J].Chemistry-A European Journal,2015.DOI：10.1002/chem.201404550)构建化合物1-3-51化学结构如图1A所示，通过CCK-8试剂盒检测1-3-51在48小时促进胃癌细胞凋亡的半抑制浓度(IC50)，结果显示在BGC823和MKN45细胞中，化合物1-3-51的IC50分别为5.429±0.225μM、5.169±0.239μM(图1B)。随后分别使用DMSO、2.5μM、5μM化合物1-3-15处理上述两种胃癌细胞，采用Western Blot及RT-qPCR检测化合物1-3-51对胃癌细胞中FOXM1蛋白及其mRNA的表达情况，结果显示化合物1-3-51呈浓度依赖的抑制FOXM1蛋白及mRNA表达(图1C)。接着使用化合物1-3-51 5μM处理上述胃癌细胞0h、24h、48h，结果显示其同样呈时间依赖的抑制FOXM1蛋白及mRNA表达(图1D)。
实施例3化合物1-3-51在胃癌细胞中抑制FOXM1下游靶基因Cyclin D1、MMP9的表达
分别使用DMSO、2.5μM、5μM处理Cyclin D1、MMP9两种胃癌细胞，采用RT-qPCR检测FOXM1下游靶基因Cyclin D1、MMP9的mRNA表达，结果显示化合物1-3-51呈浓度依赖的抑制Cyclin D1、MMP9 mRNA表达(图2A)。接着使用化合物1-3-51 5μM处理上述胃癌细胞0h、24h、48h，结果显示其同样呈时间依赖的抑制Cyclin D1、MMP9 mRNA表达(图2B)。
实施例4化合物1-3-51影响胃癌细胞周期，抑制细胞迁移及侵袭
分别使用DMSO、2.5μM、5μM处理上述两种胃癌细胞，通过流式细胞术检测化合物1-3-51对胃癌细胞周期的影响，结果显示化合物1-3-51呈浓度依赖性的使胃癌细胞阻滞在G1期(图3A)。然后使用DMSO、5μM化合物1-3-51处理上述两种胃癌细胞后，通过Transwell实验验证胃癌细胞的迁移和侵袭能力，结果显示化合物1-3-51处理过的胃癌细胞穿过细胞小室膜的数量较对照组穿过小室膜的细胞数量均明显减少(图3B)。以上结果说明，化合物1-3-51可以使胃癌细胞阻滞在G1期，并且抑制胃癌细胞迁移和侵袭。
实施例5敲减FOXM1显著降低化合物1-3-51对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响
为进一步验证化合物1-3-51是否通过抑制FOXM1表达发挥抗癌效应，申请人进一步使用干扰质粒敲降细胞内FOXM1的表达。分别转染FOXM1干扰质粒shFOXM1以及对照质粒shNC至BGC823细胞内，Western Blot实验证实其成功干扰FOXM1表达(图4A)。随后，用5μM化合物1-3-51处理转染shFOXM1或shNC的BGC823细胞，48小时后CCK8检测细胞活性，结果显示干扰FOXM1后其细胞活性明显减低，同时化合物1-3-51促凋亡的效果显著下降(图4B)。Transwell实验结果亦显示干扰FOXM1后化合物1-3-51抑制细胞迁移和侵袭的能力显著下降(图4C)。综上结果表明，化合物1-3-51可通过抑制FOXM1从而发挥抗癌效应。
结果：化合物1-3-51对BGC823和MKN45细胞作用48小时后的IC50分别为5.429±0.225μM、5.169±0.239μM，可以显著抑制FOXM1及其下游基因Cyclin D1和MMP9 mRNA表达，并可以显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移。干扰FOXM1后，其抑制增殖，侵袭及迁移能力降低。