一种取代苯并噻唑类化合物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
阅读说明：本技术 一种取代苯并噻唑类化合物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 (Application of substituted benzothiazole compound in preparation of medicine for treating ulcerative colitis ) 是由 庄春林 王志斌 张万年 朱静 李娇 于 2021-01-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种取代苯并噻唑类化合物、其异构体、溶剂合物或前体、或药学上可接受的盐在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用,所述取代苯并噻唑类化合物的结构式如式I所示：本发明的实验结果表明,在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中,化合物I可以有效减轻炎症,对该疾病有良好的治疗效果,在有效剂量内没有显示出毒性；在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中,化合物I可以有效保护溃疡性结肠炎小鼠,使小鼠体重恢复、溃疡症状减轻、修复变短结肠、改善结肠通透性以及改善结肠组织受损,明显改善炎症相关症状；说明化合物I可以作为治疗溃疡性结肠炎的药物。(The invention discloses an application of a substituted benzothiazole compound, an isomer, a solvate or a precursor thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof in preparing a medicament for treating ulcerative colitis, wherein the structural formula of the substituted benzothiazole compound is shown as a formula I: the experimental results show that in a DSS-induced ulcerative colitis mouse model, the compound I can effectively reduce inflammation, has good treatment effect on the disease and does not show toxicity in effective dose; in a DSS-induced ulcerative colitis mouse model, the compound I can effectively protect an ulcerative colitis mouse and recover the weight of the mouse and treat ulcerRelieving symptoms, repairing and shortening colon, improving colon permeability, improving damaged colon tissue, and improving inflammation related symptoms; indicating that the compound I can be used as a medicine for treating ulcerative colitis.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种取代苯并噻唑类化合物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症性肠病，病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等。UC可发生于各年龄层，难治愈，且发病率呈逐年升高趋势，已被世界卫生组织(WHO)列为现代难治性疾病之一。UC治愈难度大，常易复发，有癌变倾向，目前尚无特效疗法。
目前，UC以药物治疗为主，包括氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂以及抗生素等。①氨基水杨酸类:是治疗UC的首选用药，但易产生与剂量相关的不良反应。②糖皮质激素:治疗UC有效率能够达到90％，尤其对急性活动期的UC近期疗效好，但不能控制UC复发。③免疫抑制剂:主要有6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤。硫唑嘌呤易发生不良反应，如中性粒细胞减少、肝脏毒性、胰腺炎等，临床治疗UC多与氨基水杨酸类药物合用，可能会加重骨髓抑制。④生物制剂:常用英夫利昔和抗CD3单抗。英夫利昔有较多不良反应，如血液中白细胞、中性粒细胞及全血细胞减少等。抗CD3单抗也包括恶心、发热等不良反应。这些副作用正日益成为溃疡性结肠炎临床治疗中显现的问题。因此，开发具有治疗溃疡性结肠炎的新型小分子药物具有重要临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种取代苯并噻唑类化合物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种取代苯并噻唑类化合物、其异构体、溶剂合物或前体、或药学上可接受的盐在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
所述取代苯并噻唑类化合物的结构式如式I所示：
所述取代苯并噻唑类化合物的作用靶点为RIPK1，通过抑制RIPK1激酶活性，从而抑制程序性细胞坏死。
所述取代苯并噻唑类化合物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，在治疗溃疡性结肠炎时，可治疗或缓解腹痛、便血以及溃疡性结肠炎引起的呕吐等症状。
所述药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、微囊微球制剂、栓剂、软膏剂、喷雾剂或靶向制剂。
所述药物的给药方式为口服、注射。
本发明所述取代苯并噻唑类化合物的药学上可接受的盐是由药学上可接受的无机酸和有机酸所形成的盐，其中较优的无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；较优的有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亚细亚酸、甘珀酸、甘草次酸、齐墩果酸、山楂酸、熊果酸、科罗索酸、白桦酸、乳香酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的实验结果表明，在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，化合物I可以有效减轻炎症，对该疾病有良好的治疗效果，在有效剂量内没有显示出毒性；在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，化合物I可以有效保护溃疡性结肠炎小鼠，使小鼠体重恢复、溃疡症状减轻、修复变短结肠、改善结肠通透性以及改善结肠组织受损，明显改善炎症相关症状；说明化合物I可以作为治疗溃疡性结肠炎的药物。
本发明的实验结果考察了化合物I的治疗作用，造模后再给药治疗进行评价，不是预防给药，更接近临床实际。本发明首次证实，化合物I可以有效减轻炎症，治疗溃疡性结肠炎，可用于制备溃疡性结肠炎治疗药物使用，为临床治疗提供新型小分子药物。
附图说明
图1为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠造模及给药时间轴的示意图。
图2为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠体重随时间的变化图。
图3为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠DAI总评分随时间的变化图。
图4为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠照片及对应长度统计图，其中a图为各组结肠照片(标尺＝1cm)；b图为各组小鼠结肠长度对应统计图。
图5中a为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠HE染色图，b为各组对应的统计图。
图6为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠Tunel试验的显微镜下照片示意图。
图7为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠组织蛋白在坏死通路中的表达水平的示意图。
图8中a为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠通透性检测结果的显微镜下照片的示意图；b为对照组、模型组、高剂量、低剂量组小鼠血清荧光标记物数量统计示意图。
图9为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠IL-1β、IL-6、CCR-2和CCR-5细胞因子的表达水平示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
化合物I的制备参考文献CN112094248A的制备方法获得。
化合物I经MS、NMR、HPLC等方法确定其结构，纯度在95％以上。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.74(s,1H),10.13(s,1H),7.86(d,J＝8.1Hz,1H),7.76(d,J＝11.4Hz,1H),7.66(s,2H),7.63-7.51(m,3H),7.27(t,J＝9.9Hz,1H),6.80-6.74(m,1H),3.85(s,2H),2.01-1.95(m,1H),0.97-0.95(m,4H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ173.33,169.71,160.23,153.79,152.79,148.61,146.15,140.01,137.47,133.96,129.76,129.42,128.10,127.62,126.30,123.85,116.77,116.63,115.31,113.07,111.64,108.71,42.48,14.26,9.24.HRMS(ESI,positive)m/z calcd for C26H18F5N3O3S[M+H]+548.1068；found 548.1064.HPLC analysis:retention time＝10.1min；peak area,>95％(210,254nm).
由DSS(硫酸葡聚糖，dextran sulfatesodium)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，是利用小鼠进行溃疡性结肠炎治疗药物研究的公认模型，该模型中让小鼠饮用溶解有DSS的饮用水，再换正常饮用水饮用，小鼠会有肠道溃疡性病变，包括水肿、腹泻和便血，模拟人类溃疡性肠炎。
药理试验表明，化合物I能够显著抑制DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎，化合物I能够减轻肠炎小鼠的便血情况，减轻小鼠结肠受到的损伤，维持结肠长度并保护结肠组织免受炎症损伤。提示化合物I的新医药用途，从而为临床治疗结肠炎症提供了新的选择。
1.实验方法
1.1受试动物
C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，购自上海毕凯医药科技有限公司。
1.2实验药物与试剂
磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物(PMSF)购自上海维奥生物技术有限公司；鼠RIPK1(3493s)和鼠p-RIPK1(38662)一抗购自Cell Signaling Technology公司；鼠RIPK3(17563-1-AP)和鼠MLKL(66675-1-Ig)一抗购自Proteintech公司；GAPDH(ab181602)、鼠p-RIPK3(ab195117)和鼠p-MLKL(ab196436)一抗购自Abcam公司；硫酸葡聚糖(DSS)，购自MPBiomedicals公司；FITC-葡聚糖购自Sigma公司；二抗(926-32211)购自LI-COR公司。
3％DSS溶液：称取12g DSS至玻璃瓶中，加入400mL纯净水，超声混匀。
低剂量化合物I溶液(10mg/kg)：称取5mg化合物I，加入5mL 0.5％CMC-Na溶液(含1％DMSO)，使用前超声混匀，使用时每只小鼠灌胃剂量0.2mL/20g。
高剂量化合物I溶液(20mg/kg)：称取10mg化合物I，加入5mL 0.5％CMC-Na溶液(含1％DMSO)，使用前超声混匀，使用时每只小鼠灌胃剂量0.2mL/20g。
1.3分组与造模
C57BL/6小鼠适应性喂养一周后分为四组，每组10-13只，分别为对照组，其余分为三组通过DSS建立UC模型。除对照组外其他三组的喂养用水为3％DSS溶液，对照组则给予正常小鼠喂养用水。每天称量小鼠体重，观察小鼠粪便状态和便血情况，并根据具体现象每项在0～4分范围按DAI评分细则对每只小鼠评分，记录并计算DAI总评分(总分最高12分)，DAI评分规则如表1所示。连续喂养7天，根据DAI评分判断小鼠造模是否成功。
表1 DAI评分细则
1.4治疗方法
将3组DSS组重新分组，分为模型组、低剂量组、高剂量组，造模24h后给药；
对照组：0.5％CMC-Na溶液(含1％DMSO)，0.2mL/20g；
模型组：0.5％CMC-Na溶液(含1％DMSO)，0.2mL/20g；
低剂量组(10mg/kg)：化合物溶液(10mg/kg)，0.2mL/20g；
高剂量组(20mg/kg)：化合物溶液(20mg/kg)，0.2mL/20g。
1.5、实验步骤：
1.5.1肠通透性实验：在处死小鼠前4小时通过灌胃向小鼠施用200μL FITC-葡聚糖(给药剂量：600mg/kg)。通过去除眼球获得全血，并通过荧光法(Ex：488nm，Em：525nm)测量血清的FITC-葡聚糖水平。
1.5.2结肠取材：取材前禁食12小时，将小鼠脱颈椎处死，打开腹腔，将盲肠至肛门整个肠段剥离出来，从盲肠末端到直肠(肛门上端1cm)处为结肠部分，测量结肠长度，清除结肠内容物并用PBS漂洗干净，截取结肠下端部分，用滤纸吸取水分后分为两部分，部分采用4％多聚甲醛溶液固定，其余样本置于-80℃冰箱保存，并进行石蜡包埋、切片和HE染色、结肠组织mRNA的提取以及结肠组织蛋白的提取。
1.5.3HE染色：将收集的结肠组织固定在10％磷酸盐缓冲液中，并进行石蜡包埋处理。从每个石蜡块获得4μm切片，并用苏木精和曙红(Servicebio，G1005)染色。
1.5.4Tunel实验：用原位细胞死亡检测试剂盒(Servicebio，GB1502)分析细胞死亡。使用荧光显微镜(NIKON ECLIPSE TI-SR，日本)确定TUNEL阳性细胞的数量，以检测细胞死亡。
1.5.5蛋白免疫印迹：使用组织裂解液、含有蛋白酶抑制剂，PMSF和磷酸酶抑制剂混合物的Nonidet P-40缓冲液(Beyotime Biotechnology，P013F)从结肠组织中提取蛋白质样品，使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime Biotechnology，P0010-1)分析蛋白质的浓度，将蛋白质(20μg)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到NC膜上(Millipore，Bedford，MA，U.S.A.)，然后将膜在5％脱脂奶粉(Sangon Biotech，A600669-0250)中封闭1小时，在5％脱脂奶粉中以1：1000的稀释度制备一抗，将封闭的膜与相应的抗体在4℃孵育过夜，然后在室温下与标记的二抗(1：8000)孵育1h，使用LI-COR Odyssey系统分析结果。
1.5.6实时定量PCR：根据试剂盒流程，用RNAiso Plus试剂(TaKaRa，9109)从小鼠结肠组织匀浆中提取总RNA。使用PrimeScript(RT)Master Mix Perfect Real-Time试剂盒(TaKaRa，RR036A)将RNA逆转录为cDNA。然后将得到的cDNA作为仪器(Roche，LightCyccler96)上qPCR的模板。根据制试剂盒流程，使用PowerUp SYBR Green MasterMix(Thermo Fisher Scientific，A25742)进行实时定量PCR。用于炎症因子和内部参考的引物如下：IL-1β、IL-6、CCR-2、CCR-5和GAPDH(购自生工生物)。
1.6、统计学处理
使用SPSS软件进行统计学分析，*：模型组对比对照组，P<0.05；**：模型组对比对照组，P<0.01；***：模型组对比对照组，P<0.001。#：给药组对比模型组，P<0.05；##：给药组对比模型组，P<0.01；###：给药组对比模型组，P<0.001。
2.实验讨论
图1为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠造模及给药时间轴的示意图；图1中考察药物的治疗作用，造模后再给药治疗进行评价。
图2为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠体重随时间的变化图；图2结果表明：化合物I能够明显改善给药组小鼠的体重下降情况，给药组与模型组相比有明显地统计学差异。
图3为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠DAI总评分随时间的变化图；图3结果表明：化合物I能够明显改善小鼠便血、腹泻等临床症状，给药组与模型组相比DAI评分有显著性差异。
图4为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠照片及对应长度统计图，其中a图为各组结肠照片(标尺＝1cm)；b图为各组小鼠结肠长度对应统计图；图4结果表明：化合物I能够修复小鼠结肠长度，给药组与模型组相比有统计学差异。
图5中a为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠HE染色图，b为各组对应的病理学评分统计图；图5结果表明：化合物I能够明显减轻结肠组织的病理学损伤，结果显示，给药组粘膜屏障功能得到改善、炎症细胞浸润减少、溃疡改善以及杯状细胞的数量及形态得以修复，给药组与模型组相比有统计学差异(P<0.05)。
图6为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠Tunel试验的显微镜下照片示意图；图6结果表明：模型组死亡细胞较多，而给药组死亡细胞减少，化合物I能明显减少结肠组织细胞死亡数目。
图7为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠组织蛋白在坏死通路中的表达水平的示意图；图7结果表明：模型组p-RIPK1、p-RIPK3以及p-MLKL表达水平较空白组升高，表明模型组程序性细胞坏死信号通路已经活化，炎症启动。给予药物治疗后，与模型组比较，给药组p-RIPK1、p-RIPK3以及p-MLKL表达水平明显降低。
图8中a为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠通透性检测结果的显微镜下照片的示意图；b为对照组、模型组、高剂量、低剂量组小鼠血清荧光标记物数量统计示意图；图8结果表明：a图结果表明化合物I能够明显修复小鼠结肠通透性，b图结果表明给药组小鼠血清中大分子荧光标记物减少，表明结肠渗漏减少，结肠通透性得到修复，给药组与模型组相比有显著性差异(P<0.001)。
图9为对照组、模型组、低剂量、高剂量组小鼠结肠IL-1β、IL-6、CCR-2和CCR-5细胞因子的表达水平示意图。图9结果表明：化合物I能够抑制IL-1β、IL-6、CCR-2、CCR-5的表达，给药组与模型组有统计学差异，证明化合物I能改善肠道炎症损伤，具有良好的抗炎活性。
综上所述，本发明提供了式化合物I的新医药用途，为临床治疗溃疡性结肠炎提供了新的选择。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。