具体实施方式

本发明提供了一种降压的药物组合物，所述药物组合物包括异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐。本发明所述药物组合物能够协同减轻高血压血管内皮损伤；明显降低自发性和高盐饮食诱导的两种高血压大鼠模型的舒张压和收缩压，有确切的降压稳压效果。异钩藤碱为白色结晶粉末，分子式为C₂₂H₂₈N₂O₄，分子量为384.47，可溶于氯仿；芥子碱硫氰酸盐为白色结晶性粉末，分子式为C₁₆H₂₄NO₅·CNS，分子量为368.45，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂。异钩藤碱的结构式如式I所示，芥子碱硫氰酸盐的结构式如式II所示：

在本发明中，所述药物组合物优选包括以下重量份的组分：异钩藤碱0.3～1.2份和芥子碱硫氰酸盐5～20份，更优选为异钩藤碱0.6份和芥子碱硫氰酸盐10份。

本发明还提供了上述技术方案所述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐混合，得到药物组合物。

在本发明中，所述异钩藤碱的制备方法优选包括：将钩藤在体积百分含量为70％的乙醇水溶液中冷浸，过滤取滤液，减压浓缩至无醇味，调节pH值至1.0～3.0，更优选为2.0，得到第一提取液，将所述第一提取液按照(1～2):(1～2)，更优选为1:1的体积比与氯仿混合进行萃取，取水相调节pH值至10.0～12.0，更优选为11.0，得到第二提取液，将所述第二提取液按照(1～2):(1～2)，更优选为1:1的体积与氯仿混合，进行萃取，取有机相，减压回收，得到总生物碱，进行硅胶柱层析，得到异钩藤碱。在本发明中，调节pH值至1.0～3.0优选使用HCl进行调节，调节pH值至10.0～12.0优选使用NH₃.H₂O进行调节。本发明进行硅胶柱层析的作用为富集精制。本发明上述制备方法得到的异钩藤碱产品纯度为95％以上。本发明所述制备方法简单、可控，易用于工业化大规模生产中，所得化合物纯度较高。

在本发明中，所述芥子碱硫氰酸盐的制备方法优选包括：使用石油醚对莱菔子进行脱脂，脱脂得到的残渣使用体积百分含量为80％的乙醇水溶液进行回流提取，得到芥子碱硫氰酸盐浸膏，将所述浸膏与质量百分含量为20％的硫氰化钾水溶液(KSCN)混合，0～4℃静置24～48h，更优选4℃静置48h，析出芥子碱硫氰酸盐粗品，重结晶，得到芥子碱硫氰酸盐。在本发明中，所述所述浸膏与质量百分含量为20％的硫氰化钾水溶液混合前，优选进行稀释，本发明所述稀释优选加水稀释。本发明所述重结晶优选反复进行，本发明所述制备方法得到的芥子碱硫氰酸盐产品纯度为95％以上。本发明所述制备方法易操作、可控性强，成本低、易用于工业化大规模生产中，所得化合物纯度较高。

本发明还提供了上述技术方案所述药物组合物或上述技术方案所述制备方法得到的药物组合物在制备治疗高血压的药物中的应用。

在本发明中，所述高血压包括自发性高血压和/或高盐饮食诱导的高血压。试验结果表明，自发性和高盐饮食诱导的两种高血压大鼠模型的降压药效实验的最佳灌胃用量分别为异钩藤碱0.6mg/kg/d和芥子碱硫氰酸盐10mg/kg/d。

本发明还提供了上述技术方案所述药物组合物或上述技术方案所述制备方法得到的药物组合物在制备降低高盐饮食诱导的高血压患者的Ang II含量的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述药物组合物或上述技术方案所述制备方法得到的药物组合物在制备抑制Ang II诱导的血管内皮细胞损伤的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述药物组合物或上述技术方案所述制备方法得到的药物组合物在制备提高内皮细胞中NO水平和/或降低细胞内皮素1水平的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种降压的药物组合物及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐对血管紧张素II诱导的HUVECs细胞损伤的协同保护作用

实验材料

实验细胞：人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Endothelial Cells，HUVECs)，购于ScienCell公司(美国)，第4-7代用于实验。

实验药物：异钩藤碱(Isorhynchophylline，IRN)、芥子碱硫氰酸盐(Sinapinethiocyanate，ST)、缬沙坦(Valsartan，Val)均购于成都克洛玛生物科技有限公司。血管紧张素II(Angiotensin II，Ang II)购于北京索莱宝科技有限公司。

实验试剂：一氧化氮(NO)(货号：A013-2-1)购于南京建成生物工程研究所，内皮素1(ET-1)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(货号：JYM0710Hu)购于武汉基因美科技有限公司，细胞增殖及毒性检测(CCK-8)试剂盒(货号：MAO218-1)购于大连美仑生物技术有限公司。

实验仪器：全波长酶标仪(BioTek Cytation 5)，BioTek公司(美国)。

实验分组与给药：

正常对照组(Control)：正常状态下培养HUVECs，不加特殊处理因素；

模型组(Ang II)：给予Ang II(2×10^-6mol·L^-1)干预细胞24h；

缬沙坦组(Ang II+Val)：给予缬沙坦(5μmol·L^-1)+Ang II(2×10^-6mol·L^-1)干预细胞24h；

异钩藤碱组(Ang II+IRN)：给予异钩藤碱(10μmol·L^-1)+Ang II(2×10^-6mol·L^-1)干预细胞24h；

芥子碱硫氰酸盐组(Ang II+ST)：给予芥子碱硫氰酸盐(200μmol·L^-1)+Ang II(2×10^-6mol·L^-1)干预细胞24h；

组合组(Ang II+IRN+ST)：给予异钩藤碱(10μmol·L^-1)+芥子碱硫氰酸盐(200μmol·L^-1)+Ang II(2×10^-6mol·L^-1)干预细胞24h。

实验方法

1.CCK-8法筛选缬沙坦、异钩藤碱、芥子碱硫氰酸盐对HUVECs合适的干预浓度：首先，采用CCK-8法检测三种药物单体的细胞毒性，以筛选出无细胞毒性的药物作用浓度。三种单体以相应浓度梯度(缬沙坦：0.1μmol·L^-1、1μmol·L^-1、5μmol·L^-1、10μmol·L^-1、15μmol·L^-1、20μmol·L^-1、50μmol·L^-1；异钩藤碱：5μmol·L^-1、10μmol·L^-1、25μmol·L^-1、50μmol·L^-1、100μmol·L^-1、200μmol·L^-1、300μmol·L^-1；芥子碱硫氰酸盐：50μmol·L^-1、100μmol·L^-1、200μmol·L^-1、300μmol·L^-1、400μmol·L^-1、500μmol·L^-1、600μmol·L^-1)干预HUVECs 24小时，加入CCK-8溶液孵育2小时后用酶标仪检测其在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。结果发现，缬沙坦浓度小于5μmol·L^-1、异钩藤碱浓度小于10μmol·L^-1、芥子碱硫氰酸盐浓度小于200μmol·L^-1时HUVECs细胞活力与正常组相比无显著差异。然后，CCK-8法检测药物单体对Ang II诱导的HUVECs细胞损伤的保护作用。三种单体以相应浓度梯度(缬沙坦：0.1μmol·L^-1、1μmol·L^-1、2.5μmol·L^-1、5μmol·L^-1；异钩藤碱：2.5μmol·L^-1、5μmol·L^-1、7.5μmol·L^-1、10μmol·L^-1；芥子碱硫氰酸盐：25μmol·L^-1、50μmol·L^-1、100μmol·L^-1、200μmol·L^-1)干预HUVECs 1小时后，加入浓度为2×10^-6mol·L^-1的Ang II，继续培养24小时，检测吸光度，计算细胞存活率。根据单体药物不同浓度对细胞活性的影响，筛选出药物干预浓度为：缬沙坦5μmol·L^-1，异钩藤碱10μmol·L^-1，芥子碱硫氰酸盐200μmol·L^-1。

2.细胞一氧化氮(NO)水平检测：药物干预结束后取细胞培养上清液，用一氧化氮(NO)测定试剂盒检测细胞NO水平，按说明书操作后，550nm波长处测定吸光度(OD值)。NO含量(μmol/L)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度×样品稀释倍数。

3.细胞内皮素1(ET-1)水平检测：药物干预结束后取细胞培养上清液，用人内皮素1(ET-1)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测细胞ET-1水平，按说明书操作后，450nm波长处测定吸光度(OD值)。以标准物的OD值为横坐标，浓度为纵坐标，计算出标准曲线的二次回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。

4.统计学处理:使用SPSS statistics 25.0软件对数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

实验结果

1.Ang II及药物干预对HUVECs中NO水平的影响

与正常对照组相比，模型组HUVECs中NO水平明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明Ang II能显著抑制内皮细胞中NO的合成和释放。经过药物干预后，各组HUVECs中NO水平较模型组均明显提高(P＜0.05)，提示缬沙坦、异钩藤碱、芥子碱硫氰酸盐均能显著提高内皮细胞中NO水平，减轻AngⅡ对内皮细胞的损害。其中缬沙坦组和组合组中NO水平比异钩藤碱组和芥子碱硫氰酸盐组更高，两个单体组分别与缬沙坦组和组合组相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，而组合组和缬沙坦组相比无显著差异(P＞0.05)，两者与正常对照组相比均无显著差异(P＞0.05)，表明异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐组合使用后效果优于单独使用，具有协同作用，与缬沙坦作用效果相同。各组间NO含量对比结果见图1，注：n＝3，经单因素方差分析，与正常对照组相比，^*P＜0.05；与模型组相比，^#P＜0.05；与缬沙坦组相比，^&P＜0.05；与组合组相比，^△P＜0.05。

2.Ang II及药物干预对HUVECs中ET-1水平的影响

Ang II干预后，HUVECs中ET-1水平显著提高(P＜0.05)。经过药物干预后，各组HUVECs中ET-1水平较模型组显著降低(P＜0.05)，提示缬沙坦、异钩藤碱、芥子碱硫氰酸盐均能显著降低内皮细胞中ET-1水平，并且组合组比单一组分组ET-1水平更低，两者具有协同作用。异钩藤碱组和芥子碱硫氰酸盐组与组合组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明合用组效果最好，并且组合组与缬沙坦组相比无显著差异(P＞0.05)，表明异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐组合使用后对ET-1的抑制作用与缬沙坦作用效果相同。各组间ET-1含量对比结果见图2，注：n＝5，经单因素方差分析，与正常对照组相比，^*P＜0.05；与模型组相比，^#P＜0.05；与缬沙坦组相比，^&P＜0.05；与组合组相比，^ΔP＜0.05。

实施例2

异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐组合物对自发性高血压大鼠(SHR)的降压药效学实验

实验材料

实验动物：模型组为SPF级8周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)，体重180～200g，正常组为SPF级8周龄雄性wistar京都种大鼠(WKY)，体重180～200g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)：2016-0005)，饲养于动物实验室，室温20～25℃，湿度50～65％。

实验药物：异钩藤碱及芥子碱硫氰酸盐，均购于成都克洛玛生物科技有限公司，生产批号20201011，规格2g/瓶；缬沙坦，生产批号x1041 H2020723，北京诺华制药有限公司产品。

实验仪器：BP-98A大小鼠无创血压仪，生产厂家：北京软隆技术有限公司；BioTekCytation 5全波长酶标仪，生产厂家：美国BioTek公司。

实验分组与给药：将大鼠随机分为：SHR模型对照组、药物组合物高、中、低剂量组及阳性药对照组，另设WKY空白对照组，每组10只。

给药剂量如下：

药物组合物高剂量组：异钩藤碱1.2mg/kg/d∶芥子碱硫氰酸盐20mg/kg/d。

药物组合物中剂量组：异钩藤碱0.6mg/kg/d∶芥子碱硫氰酸盐10mg/kg/d。

药物组合物低剂量组：异钩藤碱0.3mg/kg/d∶芥子碱硫氰酸盐5mg/kg/d。

阳性药对照组(缬沙坦组)：给予缬沙坦混悬液14.4mg/kg/d。

按上述分组及对应给药剂量，给药体积：10mL/kg，WKY空白对照组和SHR模型对照组给予同等体积蒸馏水。

实验方法：对各实验组大鼠连续灌胃给予相应药物30天(每天上午定时给药一次)，采用尾动脉测压法测定给药前、给药后第7天、第15天及第30天大鼠尾动脉收缩压和舒张压，连续测量3次取平均值作为血压值。同期比较收缩压和舒张压，以评价药物的降压作用。

实验结果

连续给药30天大鼠尾动脉收缩压、舒张压的变化

与给药前比较，各给药组给予药物7天后即有降压效应(P＜0.05)，随着干预时间的延长，各药物持续发挥其降压效应，干预30天后收缩压与舒张压均降至最低，与给药前比具有统计学差异(P＜0.01)。缬沙坦组与药物组合物中剂量组相比，降低收缩压与舒张压的效应无统计学差异(P>0.05)。结果见表1和表2。

表1连续给药30天大鼠收缩压变化(mmHg)

注：与给药前相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与模型组相比，^#p<0.05，^##p<0.01

表2连续给药30天大鼠尾动脉舒张压变化(mmHg)

注：与给药前相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与模型组相比，^#p<0.05，^##p<0.01

实施例3

异钩藤碱和芥子碱硫氰酸盐组合物对经高盐饮食诱导(HSD)的高血压大鼠模型的降压作用

实验材料

实验动物：SPF级3周龄雄性wistar京都种大鼠(WKY)，体重70～80g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)：2016-0007)，饲养于动物实验室，室温20～25℃，湿度50～65％。

实验药物：异钩藤碱及芥子碱硫氰酸盐，均购于成都克洛玛生物科技有限公司，生产批号20201011，规格2g/瓶；缬沙坦，生产批号x1041 H2020723，北京诺华制药有限公司产品。

实验试剂：血管紧张素II(Ang II)(货号：ml058803)，购于上海酶联生物科技有限公司。

实验仪器：BP-98A大小鼠无创血压仪，生产厂家：北京软隆技术有限公司；BioTekCytation 5全波长酶标仪，生产厂家：美国BioTek公司。

实验造模-高盐饲料诱导高血压大鼠模型：将WKY大鼠随机分为WKY空白组10只和高盐饮食诱导模型组40只，WKY空白组给予AIN-93纯化型饲料，高盐饮食诱导模型组给予8％高盐饲料(8％氯化钠，92％AIN-93纯化型饲料)。连续喂养3月后统一测量血压，模型组按收缩压SBP>130mmHg筛选达标大鼠，并且改AIN-93纯化型饲料喂养1周后，收缩压仍达标者为造模成功。

实验分组与给药：将大鼠随机分为：高盐饮食诱导模型对照组、药物组合物组及阳性药对照组，另设WKY空白对照组，每组10只。药剂量如下：

药物组合物组：异钩藤碱0.6mg/kg/d∶芥子碱硫氰酸盐10mg/kg/d。(实施例2中最优药效剂量组)

阳性药对照组(缬沙坦组)：给予缬沙坦混悬液14.4mg/kg/d。

按上述分组及对应给药剂量，给药体积：10mL/kg，WKY空白对照组和高盐饮食诱导模型对照组给予同等体积蒸馏水。

实验方法：

1.降压作用-大鼠尾动脉血压值的检测

对各实验组大鼠连续灌胃给予相应药物30天(每天上午定时给药一次)，采用尾动脉测压法测定给药前、给药后第7天、第15天及第30天大鼠尾动脉收缩压和舒张压，连续测量3次取平均值作为血压值。同期比较收缩压和舒张压，以评价药物的降压作用。

2.降压作用-大鼠血清Ang II的检测

在测完给药前和给药30天后的血压值后，分别对大鼠眼眶静脉取血，离心取上清液，取100uL血清用于Ang II的检测：按照Ang II的ELISA试剂盒说明书操作制备样品，反应完成后用酶标仪于450nm波长处测定吸光度(OD₄₅₀值)。以标准物的OD₄₅₀值为横坐标，浓度为纵坐标，计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD₄₅₀值代入方程式，计算出样品浓度，分别对各组大鼠Ang II的含量值进行对比。

实验数据处理：检测所得数据资料采用SPSS statistics 25.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，利用t检验、单因素方差分析(ANOVA)检验均值差异是否显著，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

实验结果

1.药物组合物对大鼠血压的影响

与给药前比较，各给药组给予药7天后即有降压效应(P＜0.05)，随着干预时间的延长，各药物持续发挥其降压效应，干预30天后收缩压和舒张压降至最低，与给药前比具有统计学差异(P＜0.01)。缬沙坦组与药物组合物组相比，降低收缩压和舒张压的效应均无统计学差异(P>0.05)。结果见表3和表4。

表3连续给药30天大鼠收缩压变化(mmHg)

注：与给药前相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与模型组相比，^#p<0.05，^##p<0.01

表4连续给药30天大鼠尾动脉舒张压变化(mmHg)

注：与给药前相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与模型组相比，^#p<0.05，^##p<0.01

2.药物组合物对大鼠血清Ang II水平的影响

结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清Ang II含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，药物组与缬沙坦组大鼠血清Ang II含量降低，有显著性差异(P<0.01)；药物组与缬沙坦组之间无显著性差异(P>0.05)。各组间Ang II含量对比见下表5。

表5连续给药30天大鼠血清Ang II含量变化

注：与给药前相比，^●p<0.01；与模型组相比，^◆p<0.01

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。