黄岑苷在制备治疗h6n6亚型禽流感的药物中的应用
阅读说明：本技术 黄岑苷在制备治疗h6n6亚型禽流感的药物中的应用 (Application of baicalin in preparation of medicine for treating H6N6 subtype avian influenza ) 是由 欧德渊 李卫鹏 钱林 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及中兽医药领域,具体公开了黄岑苷抗H6N6亚型禽流感病毒的作用。本发明黄岑苷药物抗H6N6亚型禽流感病毒安全有效,可降低H6N6亚型禽流感病毒引起的炎性反应、保护肺损伤,防止肥大细胞脱颗粒释放炎性介质,可用于治疗H6N6亚型禽流感。(The invention relates to the field of Chinese veterinary medicine, and particularly discloses an effect of baicalin on resisting H6N6 subtype avian influenza virus. The baicalin medicine is safe and effective in resisting H6N6 subtype avian influenza virus, can reduce inflammatory reaction caused by H6N6 subtype avian influenza virus, protects lung injury, prevents mast cells from degranulating and releasing inflammatory mediators, and can be used for treating H6N6 subtype avian influenza.)
技术领域
本发明涉及中兽医药领域，具体涉及黄岑苷在制备治疗禽流感 H6N6的药物中的应用。
背景技术
随着H6N6毒株的变异，H6N6亚型AIV可以感染小鼠、雪雕、猪等哺乳动物，甚至在健康人群中检测到H6亚型AIV的血清特异性抗体，表明H6N6亚型禽流感病毒具有跨越物种屏障感染哺乳动物的能力，并对人类健康构成潜在威胁。而传统西药在临床应用多年，有抗流感病毒作用，但是病毒抗原变异，或者适应来自药物的作用，出现逃避和耐药。而中药及其复方在抗流感病毒中具有的独特的优势，发展前景广阔的。我国有很多抗病毒中药，如桂枝、川芎、苍术、大青叶、防风、黄芩、地黄、鱼腥草等，其中有些中药对禽流感病毒也有很好的抑制作用，其效果不亚于西药，通过鸡胚培养试验与血凝试验得出黄芩抗H6N6亚型禽流感效果最佳。黄芩苷(Baicalin)是从黄芩根中分离的黄酮类化合物，具有广泛的药理作用，其中以抗炎和免疫调控作用尤为突出。
现有技术中虽然公开了黄芩苷对H6N6禽流感引起的炎症反应, 具有降低白细胞总数,抑制出血反应的作用，但是具体原理并不知晓，黄岑苷在制备治疗H6N6亚型禽流感的药物中的应用涉及更少，相关专利也未公开治疗H6N6亚型禽流感的黄岑苷药物。例如，专利CN201510096401.6公开了黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性，证明了黄芩苷具有制备抗禽流感病毒H7N9药物的用途。但其并未针对H6N6亚型禽流感，并且未公开具体如何抑制H6N6亚型禽流感病毒。
综上，目前缺乏黄岑苷在制备治疗H6N6亚型禽流感的药物中的应用，知晓其具体致病机理将使人们更好的对症下药，更好的发挥黄岑苷成分治疗亚型H6N6禽流感疾病。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了黄岑苷在制备治疗H6N6亚型禽流感的药物中的应用，通过控制炎性反应、保护肺损伤，防止肥大细胞脱颗粒释放炎性介质治疗H6N6亚型禽流感。
本发明目的之一在于提供黄岑苷在制备治疗H6N6亚型禽流感的药物中的应用，具体技术方案如下：
黄岑苷在制备治疗H6N6亚型禽流感的药物中的应用，所述黄芩苷通过抑制中性粒细胞的产生、降低肺组织中肥大细胞脱颗粒率、抑制炎性因子的分泌来降低禽流感H6N6病毒含量，所述炎性因子为IL- 1、IL-2、TNF-α、IFN-γ和5-HT。
进一步地，所述黄芩苷能抑制血凝素HA2亚基的活性，抑制禽流感H6N6病毒遗传物质在细胞中的复制。
优选的，所述黄芩苷通过减少H6N6亚型禽流感病毒遗传物质抑制中性粒细胞的产生。
进一步地，所述肥大细胞脱颗粒率的降低会抑制炎性因子的分泌。
本发明目的之二在于提供一种黄岑苷抑制剂的应用，具体技术方案如下：
黄岑苷在制备抑制感染H6N6亚型禽流感的体内中性粒细胞的分泌的抑制剂中的应用。
本发明目的之三在于提供一种黄岑苷抑制剂的应用，具体技术方案如下：
黄岑苷在制备抑制感染H6N6亚型禽流感的肺组织中肥大细胞脱颗粒率的抑制剂中的应用。
本发明目的之四在于提供一种黄岑苷抑制剂的应用，具体技术方案如下：
黄岑苷在制备抑制感染H6N6亚型禽流感的体内炎性因子5-HT的分泌的抑制剂中的应用。
进一步地，所述抑制感染H6N6亚型禽流感的体内炎性因子5-HT 的分泌是通过抑制肺组织中肥大细胞脱颗粒率实现的。
本发明的有益之处在于：探究出了黄芩苷在治疗H6N6亚型禽流感时作用的关键炎性因子，并通过对中性粒细胞的产生和肺组织中肥大细胞脱颗粒率的抑制达到治疗目的，为治疗H6N6亚型禽流感提供了具体思路和关键把控因子。
附图说明
图1本发明的黄岑苷抗禽流感H6N6病毒研究流程图。
图2中药在鸡胚内抗AIV试验结果图(n＝6)。
图3各组小鼠白细胞总数图(109·L-1，n＝6)。
图4各组小鼠中性粒细胞数目图(109·L-1，n＝6)。
图5各组小鼠中性粒细胞百分比图(％，n＝6)。
图6各组小鼠淋巴细胞数目(109·L-1，n＝6)。
图7各组小鼠淋巴细胞百分比(％，n＝6)。
图8各组小鼠肺脏组织病毒含量(μL-1，n＝6)。
图9各组小鼠气管组织病毒含量(μL-1，n＝6)。
图10各组小鼠脾脏组织病毒含量(μL-1，n＝6)。
图11肺脏肥大细胞数量(个/mm2，n＝6)。
图12肺脏肥大细胞脱颗粒率(％，n＝6)。
图13各组小鼠血清中IL-1含量(pg·mL-1，n＝6)。
图14各组小鼠血清中IL-2含量(pg·mL-1，n＝6)。
图15各组小鼠血清中TNF-α含量(pg·mL-1，n＝6)。
图16各组小鼠血清中IFN-γ含量(pg·mL-1，n＝6)。
图17各组小鼠血清中5-HT含量(ng·mL-1，n＝6)。
具体实施方式
下面通过实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
具体实施例
1.实验材料
桂枝、川芎、苍术、大青叶、防风、黄芩、地黄、鱼腥草、金银花和荆芥等10种中药，均购自贵阳市同济堂中草药分行；黄芩苷(山西玉宁生物科技有限公司，批号：YN-20180512)，磷酸奥司他(宜昌长江药业有限公司，批号：H20055532)；9日龄非免疫鸡胚，贵州大学科研鸡场提供。6-8周龄昆明系小白鼠108只雌雄各半(22.17± 2.24g)，购于重庆腾鑫生物技术有限公司。H6N6亚型禽流感病毒 (107.66EID50)，来源于贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室。
2.抗禽流感H6N6病毒中药的筛选(如图1所示)
抗禽流感H6N6病毒中药的筛选：将9日龄鸡胚随机平均分成12 组(阴性对照组、病毒阳性组、桂枝组、川芎组、苍术组、大青叶组、防风组、黄芩组、地黄组、鱼腥草组、金银花组、荆芥组)，每组6枚，阴性对照组鸡胚注射生理盐水，0.2mL/枚；病毒对照组鸡胚注射浓度为100EID50的N6亚型AIV病毒，0.2mL/枚；10个中药实验组鸡胚均注射中药汤剂与100EID50病毒1:1混合液，0.2mL/枚。接种完毕放37.8℃恒温箱内孵化72h，弃去24h内死胚，收获24h后死胚及72h后活胚的尿囊液，进行血凝(HA)效价的测定。上述中药在鸡胚内抗AIV试验结果如图2所示，通过HA效价判断黄芩为最佳抗禽流感H6N6病毒的中药。
安全性的测定：低剂量黄芩苷组(0.014mg·只-1·d-1)，中剂量黄芩苷治疗组(0.028mg·只-1·d-1)，高剂量黄芩苷治疗组(0.056mg·只-1·d-1)和超高剂量黄芩苷治疗组(0.112mg·只-1·d-1)注射给小白鼠，未造成明显的临床症状，处死小鼠后，在心、肝和肾组织未发现病变，表明黄芩苷对小鼠是安全的。
将108只6-8周龄昆明系小鼠随机平均分为6组：阴性对照组、病毒阳性组、西药对照组、低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组，所有剂量均结合文献依照《中药药理实验方法》(李仪奎，1991)进行体表面积换算所得。各组小鼠在相同条件环境下隔离饲养，自由采食和饮水。并于攻毒3d后开始治疗，分别于治疗后第 3d、6d和9d(各组每次采取6只小鼠)采用颈静脉放血法处死，采集样品。后续通过荧光定量PCR，得到相应实验组的病毒拷贝数；通过病理切片观察组织损伤、肥大细胞数量；通过血常规、ELISA，得到血细胞的数量变化及形态分布和炎性因子(IL-1、IL-2、TNF-α、 IFN-γ和5-HT)数量。
1.白细胞总数指标
治疗3d、6d和9d时，如图3所示，阴性对照组、西药对照组、高剂量黄芩苷组白细胞总数均极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)；治疗6d和9d时，低、中剂量黄芩苷组白细胞总数均极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)，高剂量黄芩苷组极显著低于低、中剂量黄芩苷组(P＜0.01)(表1)。
表1各组小鼠白细胞总数(109·L-1，n＝6)
注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P＞0.05)。下同。
2.中性粒细胞指标
(1)治疗3d、6d和9d时，如图4所示，病毒阳性组中性粒细胞数目均极显著高于阴性对照组和所有治疗组(P＜0.01)；高剂量黄芩苷组中性粒细胞数目均极显著或显著低于低、中剂量黄芩苷组(P＜0.01或P＜0.05)，治疗3d时，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)(表2)。
表2各组小鼠中性粒细胞数目(109·L-1，n＝6)
(2)治疗3d和6d时，如图5所示，高剂量黄芩苷治疗组中性粒细胞百分比均极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)；治疗9d时，中剂量、高剂量黄芩苷组中性粒细胞百分比显著低于病毒阳性组(P＜0.05)(表3)。
表3各组小鼠中性粒细胞百分比(％，n＝6)
3.淋巴细胞指标
(1)治疗3d、6d和9d时，如图6所示，高剂量黄芩苷组淋巴细胞数目均极显著高于病毒阳性组(P＜0.01)，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)；治疗6d和9d时，低、中剂量黄芩苷治疗组淋巴细胞数目均极显著高于病毒阳性组(P＜0.01)(表4)。
表4各组小鼠淋巴细胞数目(109·L-1，n＝6)
(2)如图7所示，治疗3d、6d和9d时，高剂量黄芩苷组淋巴细胞百分比均极显著高于病毒阳性组(P＜0.01)，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)；治疗6d和9d时，低、中剂量黄芩苷治疗组淋巴细胞百分比均极显著高于病毒阳性组(P＜0.01)(表 5)。
表5各组小鼠淋巴细胞百分比(％，n＝6)
4.组织病理观察
组织学显示小鼠正常的肺组织里有散在的少量红细胞，小鼠偶见有少量的粒细胞，3～9d时，阳性组肺组织有大量出血、脱落的上皮细胞、炎性细胞浸润、纤维蛋白分泌物，3～9d时西药对照组、低、中、高剂量黄芩苷组肺脏较阳性组均不同程度减少出血、炎性渗出物、炎性细胞浸润等现象，气管和脾脏组织学观察均未发现明显损伤。
4.1病毒在肺组织的复制情况
如图8所示，治疗3d、6d时，高剂量黄芩苷治疗组肺脏组织病毒含量显著低于病毒阳性组(P＜0.05)，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)。治疗9d时，中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组肺脏组织病毒含量显著低于病毒阳性组(P＜0.05)，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)(表6)。
表6各组小鼠肺脏组织病毒含量(μL-1，n＝6)
4.2病毒在气管组织的复制情况
如图9所示，治疗3d、6d、9d时，各治疗组气管组织病毒含量均低于病毒阳性对照组，但差异不呈显著性(P＞0.05)(表7)。
表7各组小鼠气管组织病毒含量(μL-1，n＝6)
4.3病毒在脾组织的复制情况
如图10所示，治疗3d、6d、9d时，各治疗组脾脏组织病毒含量均低于病毒阳性对照组，但差异不呈显著性(P＞0.05)(表8)。
表8各组小鼠脾脏组织病毒含量(μL-1，n＝6)
4.4肺脏肥大细胞脱颗粒率
如图11和12所示所示，治疗3d、6d和9d时，病毒阳性组肥大细胞MC脱颗粒率均极显著高于阴性对照组(P＜0.01)；治疗6 d和9d时，中、高剂量黄芩苷组MC脱颗粒率均显著低于病毒阳性组(P＜0.05)，与西药对照组差异不显著(P＞0.05)(表9)。
表9肺脏肥大细胞脱颗粒率(％,n＝6)
5.炎性细胞结果
5.1 IL-1结果
如图13所示，治疗3d、6d、9d时，病毒阳性组小鼠血清中 IL-1均极显著高于阴性对照组(P＜0.01)。治疗3d时，低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组小鼠血清中IL-1含量均与病毒阳性组差异不显著(P＞0.05)。治疗6d和9d时，西药对照组、低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组小鼠血清中IL-1含量均极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)(表10)。
表10各组小鼠血清中IL-1含量(pg·mL-1，n＝6)
5.2 IL-2结果
如图14所示，治疗3d、6d、9d时病毒阳性组、西药对照组、低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组IL-2含量极显著或显著高于阴性对照组(P＜0.01或P＜0.05)，低、中、高剂量黄芩苷组与西药对照组差异差异不显著(P＞0.05)(表11)。
表11各组小鼠血清中IL-2含量(pg·mL-1，n＝6)
5.3 TNF-α结果
如图15所示，治疗3d、6d、9d时，西药对照组、低、中、高剂量黄芩苷组TNF-α含量均极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)，高剂量黄芩苷组与西药对照组差异不显著(P＞0.05)(表12)。
表12各组小鼠血清中TNF-α含量(pg·mL-1，n＝6)
5.4 IFN-γ结果
如图16所示，治疗3d、6d、9d时，病毒阳性组小鼠血清中 INF-γ含量均极显著高于阴性对照组(P＜0.01)，极显著低于西药对照组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组(P＜0.01)，与低剂量黄芩苷组差异不显著(P＞0.05)(表13)。
表13各组小鼠血清中IFN-γ含量(pg·mL-1，n＝6)
5.5 5-HT的结果
如图17所示，治疗3d时，高剂量黄芩苷组5-HT含量极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)，与西药对照组差异不显著(P＞ 0.05)，中剂量黄芩苷组显著低于病毒阳性组(P＜0.05)；治疗6d 和9d时，低、中、高剂量黄芩苷组5-HT含量均极显著低于病毒阳性组(P＜0.01)。中、高剂量黄芩苷组均与西药对照组差异不显著(P＞0.05)(表14)。
表14各组小鼠血清中5-HT含量(ng·mL-1，n＝6)
6.结论
由上述实验数据和图片可知：黄芩苷通过抑制炎性因子的产生从而抑制患鼠的白细胞总数升高。黄芩苷可以通过抑制血凝素HA2亚基的活性，降低病毒遗传物质在细胞中的复制，从而抑制流感细胞对机体的侵入，这也是中性粒细胞数目降低的原因。
高剂量黄芩苷组小鼠肺脏较病毒阳性组能极显著减少肺脏出血、上皮细胞脱落和炎性细胞浸润。特别的，中剂量黄芩苷组和高剂量黄芩苷组肥大细胞脱颗粒率均显著低于病毒阳性组，这说明了黄芩苷能有效抑制患鼠肺组织中MC脱颗粒。
黄芩苷能有效抑制患鼠IL-1、TNF-α、IFN-γ、5-HT升高，在治疗6d和9d时，低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组和高剂量黄芩苷组5-HT含量均极显著低于病毒阳性组，其应是通过抑制MC脱颗粒间接抑制5-HT的含量，同时也抑制了IL-1，TNF-α和IFN-γ的分泌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。