具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对SARS-CoV-2病毒复制的抑制能力的组合物及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步描述。

实施例1

本发明诃黎勒酸以100％质量比含量在制备对SARS-CoV-2病毒复制抑制的药物中的用途。

所述诃黎勒酸在制备新型SARS-CoV-2抑制剂中的用途。

本发明提供一种用于表达所述用途中新型SARS-CoV-2抑制剂抑制 SARS-CoV-2复制的靶细胞。

本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2病毒复制抑制能力的试剂盒，所述试剂盒包含所述的用途中诃黎勒酸，以及所述的靶细胞。

本发明提供一种所述用途中诃黎勒酸在制备抑制3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性药物中的用途。

所述制备抑制3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性药物中，包括对3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性的抑制效果的筛选：

通过原核表达纯化的SARS-CoV-23CL^Pro携带天然的N端，且于C端带有 His纯化标签；当3CL^pro和荧光共振能量转移基肽底物在反应缓冲液中混合后，底物在酶的作用下水解；

水解后，荧光团Edans不再受猝灭分子Dabcyl的影响，荧光信号增加，荧光信号在336/20nm处激发，在490/20nm处发射。

所述反应缓冲液包括：50mM Tris-HCl，pH7.3，1mM EDTA。

实施例2

本发明安石榴苷以100％质量比含量在制备对SARS-CoV-2病毒复制抑制的药物中的用途。

所述安石榴苷以任意比例组合在制备新型SARS-CoV-2抑制剂中的用途。

本发明提供一种用于表达所述用途中新型SARS-CoV-2抑制剂抑制 SARS-CoV-2复制的靶细胞。

本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2病毒复制抑制能力的试剂盒，所述试剂盒包含所述的用途中安石榴苷，以及所述的靶细胞。

本发明提供一种所述安石榴苷在制备抑制3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性药物中的用途。

所述制备抑制3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性药物中，包括对3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性的抑制效果的筛选：

通过原核表达纯化的SARS-CoV-23CL^Pro携带天然的N端，且于C端带有 His纯化标签；当3CL^pro和荧光共振能量转移基肽底物在反应缓冲液中混合后，底物在酶的作用下水解；

水解后，荧光团Edans不再受猝灭分子Dabcyl的影响，荧光信号增加，荧光信号在336/20nm处激发，在490/20nm处发射。

所述反应缓冲液包括：50mM Tris-HCl，pH7.3，1mM EDTA。

实施例3

本发明提供一种诃黎勒酸和安石榴苷以任意比例组合在制备对 SARS-CoV-2病毒复制抑制的药物中的用途。

所述诃黎勒酸和安石榴苷以任意比例组合在制备新型SARS-CoV-2抑制剂中的用途。

本发明提供一种用于表达所述用途中新型SARS-CoV-2抑制剂抑制 SARS-CoV-2复制的靶细胞。

本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2病毒复制抑制能力的试剂盒，所述试剂盒包含所述的用途中诃黎勒酸和安石榴苷以任意比例组合物，以及所述的靶细胞。

本发明提供一种所述用途中诃黎勒酸和安石榴苷以任意比例组合在制备抑制3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性药物中的用途。

所述制备抑制3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性药物中，包括对3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶3CL^Pro活性的抑制效果的筛选：

通过原核表达纯化的SARS-CoV-23CL^Pro携带天然的N端，且于C端带有 His纯化标签；当3CL^pro和荧光共振能量转移基肽底物在反应缓冲液中混合后，底物在酶的作用下水解；

水解后，荧光团Edans不再受猝灭分子Dabcyl的影响，荧光信号增加，荧光信号在336/20nm处激发，在490/20nm处发射。

所述反应缓冲液包括：50mM Tris-HCl，pH7.3，1mM EDTA。

下面结合具体实验对本发明的技术方案作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例提供的检测CHLA和PUG对SARS-CoV-2感染的抗病毒活性的方法包括以下步骤：

S101，将12孔板中生长为单层细胞的VERO-E6用不同浓度的CHLA或PUG 预处理1h；

S102，加入SARS-CoV-2临床分离株Isolate USA-WA1/2020进行感染；

S103，共同培养1h后，将培养基换为含有1.25％Avicel的新鲜MEM，并于37℃、5％CO₂环境中孵育48h；

S104，用10％福尔马林固定细胞，1％结晶紫染色并观察。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

新出现的SARS-CoV-2感染是全球COVID-19大流行的原因。迄今为止，防治这种疾病的治疗方案有限。在此，本发明实验了两种广谱抗病毒天然产物诃黎勒酸(chebulagicacid，CHLA)和安石榴苷(punicalagin，PUG)对SARS-CoV-2病毒复制的抑制能力。在非细胞毒性浓度下，CHLA和PUG通过靶向病毒3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(3CL^Pro)的酶活性，以可逆的、非竞争性的方式减少病毒诱导的VERO-E6细胞单层空斑的形成。本发明的实验表明CHLA和PUG作为新的COVID-19疗法的潜在用途。

在开发SARS-CoV-2治疗药物的紧急实验中，来自药用植物的天然产物一直是新型先导化合物的重要来源，这些先导化合物具有不同作用机制，如紫草素、丹酚酸C、千金藤碱、番石榴碱等等。本发明从中国传统药用植物诃子中分离出的另外两种天然产物诃黎勒酸(chebulagic acid，CHLA)和安石榴苷(punicalagin， PUG)作为新型SARS-CoV-2抑制剂。

CHLA和PUG是一种可水解的多酚类物质，已被报道用于阻断细胞表面糖胺聚糖(GAG)与病毒糖蛋白之间的相互作用。利用该作用机制，CHLA和PUG 能够抑制多种依赖GAG进入宿主细胞的病毒感染，如单纯疱疹病毒1型、人巨细胞病毒和丙型肝炎病毒。此外，最近实验结果发现，CHLA和PUG通过靶向神经氨酸酶介导的病毒释放过程抑制流感病毒的复制。所有这些都表明CHLA 和PUG具有低成本高效益的广谱抗病毒药物潜力。

本发明在BSL-3级实验室检测了CHLA和PUG对SARS-CoV-2感染的抗病毒活性，并以瑞德西韦为阳性对照。将12孔板中生长为单层细胞的VERO-E6 用不同浓度的CHLA或PUG预处理1h，然后加入SARS-CoV-2临床分离株 IsolateUSA-WA1/2020(来自BEI资源库)进行感染。共同培养1h后，将培养基换为含有1.25％Avicel的新鲜MEM，并于37℃、5％CO₂环境中孵育48h。然后用10％福尔马林固定细胞，1％结晶紫染色并观察。结果显示，CHLA和PUG均以剂量依赖性的方式抑制SARS-CoV-2空斑的形成(图2A)，EC₅₀数值分别为 9.76±0.42μM和7.20±1.08μM(图2B)。为了排除病毒复制抑制是由化合物介导的细胞毒性导致的可能性，本发明进行了基于细胞增殖的细胞毒性试验。如图2B 所示，CHLA和PUG的CC₅₀(50％细胞毒性浓度)值均在100μM左右，选择性指数(SI[CC₅₀/EC₅₀])分别为10和13。这些结果表明CHLA和PUG具有体外抑制SARS-CoV-2复制的活性。

两项独立实验表明，细胞表面GAGs如硫酸乙酰肝素，通过与病毒表面糖蛋白(S)相互作用参与了SARS-CoV-2的进入。

因此，本发明首先测试CHLA和PUG是否通过阻止SARS-CoV-2进入而起作用。本发明制备了携带SARS-CoV-2S蛋白的慢病毒假病毒(SARS-CoV-2pp)，并利用瞬时表达人ACE2和TMPRSS2的293T细胞作为靶细胞(图3A)。在 SARS-CoV-2pp接种过程中加入了终浓度为100μM至1.56μM梯度浓度的CHLA 或PUG，共同孵育48h后，分析荧光素酶活性，监测病毒进入效果。在不干扰靶细胞活力的情况下，CHLA和PUG都不影响SARS-coV-2pp的进入，这表明 CHLA和PUG通过另外一种机制来抑制SARS-CoV-2的复制，而不是通过抑制病毒糖蛋白S介导的病毒进入(图3B)。

3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(3CL^Pro)是冠状病毒中最具潜力的药物靶点之一。和木瓜蛋白酶(PL^Pro)一样，3CL^Pro是一种必需的病毒蛋白酶来处理病毒多聚蛋白，因此，抑制该酶的活性将会阻断病毒复制。一项模拟实验结果表明，包括CHLA在内的几种水解多酚是SARS-CoV-23CL^Pro的潜在抑制剂。为了验证这一问题，本发明对CHLA和PUG进行了SARS-CoV-23CL^Pro酶抑制筛选试验。通过原核表达纯化的SARS-CoV-23CL^Pro携带天然的N端，且于C端带有His 纯化标签。当3CL^pro和荧光共振能量转移(FRET)基肽底物 (Dabcyl-KTSAVLQ/SGFRKME-Edans，50μM)在反应缓冲液(50mM Tris-HCl， pH7.3，1mM EDTA)中混合后，底物在酶的作用下水解。水解后，荧光团Edans 不再受猝灭分子Dabcyl的影响，导致荧光信号增加，荧光信号在336/20nm处激发，在490/20nm处发射(图4A)。结果显示CHLA和PUG能够剂量依赖性地减少荧光的产生，IC₅₀值分别为9.09±0.87μM和4.62±0.27μM(图4B和2C)。荧光干扰实验进一步表明，CHLA和PUG只在较高浓度下影响荧光检测(>50μM，数据未显示)。综上所述，本发明的实验表明CHLA和PUG可以阻断3CL^Pro的酶活性。值得注意的是，CHLA对SARS-CoV-2PL^Pro的酶活性影响不大，而PUG 微弱抑制PL^Pro的IC₅₀超过50μM(图5)。这些数据表明PUG是一种潜在的双靶点SARS-CoV-2抑制剂，尽管它抑制PL^Pro的活性较弱。

为了更好地了解CHLA和PUG与SARS-CoV-23CL^Pro相互作用的动力学模式，在不同浓度抑制剂存在下测定了系列浓度蛋白酶的水解活性，底物浓度在亚饱和水平保持不变。在每个抑制剂浓度下，用初始反应速度相对3CL^Pro的浓度作图，并用线性回归分析拟合到一条直线上。如图2D所示，随着CHLA或 PUG浓度的增加，直线的斜率减小，表明CHLA和PUG都是可逆的抑制剂。为了推导结合模式，在3CL^Pro恒定浓度(250nm)、在没有或存在不同浓度的CHLA或PUG的情况、增加底物浓度，分别检测酶活性并绘制Lineweaver-Burk图。结果表明，所有的线都在x轴相交，表明CHLA和PUG都表现非竞争性的抑制模式(图2E)。

根据本发明的酶学分析，CHLA和PUG都是非竞争性变构抑制剂。为了搜索潜在的变构结合位点，本发明利用AutoDockVina软件进行CHLA和PUG到 3CL^Pro的虚拟对接。如图2F所示，CHLA和PUG都可能结合到3CL^Pro的结构域II和III之间的裂缝处，且具有稳定的结合自由能。这一结合位点与底物结合位点距离稍远。

总之，本发明的实验结果表明CHLA和PUG是一种新型的针对3CL^Pro蛋白酶的SARS-CoV-2抑制剂，并提供这些抑制剂作为潜在的COVID-19治疗的证据。同时，这表明中药提取物作为发现和开发潜在的抗病毒疗法的重要性。

图2是Chebulagic acid(CHLA)和Punicalagin(PUG)通过阻断3CL^Pro酶活性抑制SARS-CoV-2感染。A.在一定浓度下，CHLA和PUG以及瑞德西韦(3μM)对 SARS-CoV-2的空斑形成抑制实验。B.CHLA和PUG对SARS-CoV-2复制呈现剂量依赖性抑制作用。抗病毒活性和细胞毒性分别以红色和蓝色显示。IC₅₀和CC₅₀显示在每个化合物的左上角。数据表示三份测量±平均标准差(SD)。IC₅₀用 GraphPad(版本8.1.2)中的四参数逻辑回归拟合剂量-反应曲线来确定数值，所有数据都与对照组归一化处理。C.CHLA和PUG对3CL^Pro的剂量依赖性抑制作用。采用基于荧光共振能量转移(FRET)的裂解法进行测定。每个化合物的IC₅₀值显示在左上角。数据表示三份测量±平均标准差(SD)。D.不同浓度的CHLA和PUG对 SARS-CoV-23CL^pro酶活性的影响。E.CHLA或PUG对SARS-CoV-23CL^pro抑制的Lineweaver-Burk图。F.预测CHLA(i)和PUG(ii)与3CL^pro(PDB ID:6m2n)的结合模式。红色圆圈表示催化位点。SARS-CoV-23CL^pro以小麦色卡通表示，而CHLA 和PUG表现为棍状。结合键表示为虚线，键长在重原子之间测量。

图3是假病毒感染试验。A.SARS-CoV-2假病毒实验图，其中293T细胞瞬时表达ACE2和TMPRSS2后作为靶细胞。B.抗假病毒活性和细胞毒性分别以红色和蓝色显示。数据表示三次重复测量±平均标准差(SD)。

图4中，A.以荧光共振能量转移(FRET)为基础，对3CL^Pro的酶活性进行了监测。3CL^Pro经切割后猝灭分子Dabcyl与荧光团Edans之间断裂，导致荧光信号增加。B.在一定浓度的CHLA或PUG下3CL^Pro初始荧光酶谱曲线(250nm)。

图5表明，CHLA和PUG对PLPro活性的影响不大。

将SARS-CoV-2的PL^pro基因(957bp)从pET-32a(+)-pap_like protease质粒(上海交通大学陶博士惠赠)中进行PCR扩增，克隆成pET32a(+)表达载体，转化DH5α感受态细胞。通过测序，在pET32a(+)载体中正确克隆出含有PL^pro基因的质粒，并转化进BL21(DE3)大肠杆菌中进行蛋白表达和纯化，在活性测定前用牛肠激酶 (EK)消化去除N末端标记。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检测蛋白纯度，以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定蛋白浓度。

用于PL^Pro活性检测的底物为NJPeptide公司合成的荧光标记肽 Z-Arg-Leu-Arg-Gly-AMC(Z-RLRGG-AMC)。水解AMC肽键可显著增加AMC分子的荧光，从而准确测定酶活性。反应的总体积为100μL，其中包含以下成分：20mM Tris-buffer缓冲液，pH 8.0，4mM二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)，300nM PL^pro以及梯度浓度的抑制剂(0-100μM)。通过添加Z-RLRGG-AMC来启动检测，最终酶浓度为30μM。在微板阅读器BioTek Synergy LX(λex＝360nm；λem＝460nm；增益＝40)上连续监测反应进展。

图5是体外测定CHLA(A)和PUG(B)对PL^pro酶活性的抑制作用。利用荧光标记肽Z-RLRGG-AMC作为底物，对SARS-CoV-2PL^pro进行原核表达、纯化和荧光测定。

如图5所示，CHLA对PL的影响很小活性，而PUG在较高浓度时表现出较弱的抑制作用(IC₅₀值超过50μM)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。