一种药物组合物及其应用
阅读说明：本技术 一种药物组合物及其应用 (Pharmaceutical composition and application thereof ) 是由 戚进 李鑫琦 张静雯 常山泉 于 2021-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种药物组合物及其应用,主要包括哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸。本发明的药物组合物能够降低空腹血糖和糖化血清蛋白水平,改善血糖调节能力；调节血脂紊乱、改善血脂代谢；缓解胰岛素分泌不足；改善胰岛素抵抗水平,增加机体胰岛素敏感性,具有保护胰岛细胞的作用。因此,本发明的药物组合物具有较好的改善2型糖尿病的作用,可用于制备治疗2型糖尿病的药物。(The invention relates to a pharmaceutical composition and application thereof, and the pharmaceutical composition mainly comprises harpagide, harpagoside, verbascoside, cinnamic acid, ferulic acid and p-coumaric acid. The pharmaceutical composition can reduce the levels of fasting blood sugar and glycated serum protein and improve the blood sugar regulation capability; regulating blood lipid disorder and improving blood lipid metabolism; relieving insulin hyposecretion; improving insulin resistance level, increasing insulin sensitivity of body, and protecting islet cells. Therefore, the pharmaceutical composition has a better effect of improving type 2 diabetes, and can be used for preparing a medicament for treating type 2 diabetes.)
技术领域
本发明涉及一种药物组合物，特别涉及一种药物组合物及其在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。
背景技术
2型糖尿病(T2DM)是糖尿病最常见的类型，其占所有糖尿病患者的90％以上，是一种病理生理学基础非常复杂的代谢综合征，其主要病理表现为胰岛素分泌相对不足或者机体对胰岛素的敏感性降低。
目前临床用于治疗T2DM的药物主要有双胍类、格列奈类、噻唑烷酮类、磺酰脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽-1类似物、DPP-4抑制剂、胰岛素等化学药物，常伴有不同类型、不同程度的副作用；并且随着糖尿病患者的逐年增多，用于糖尿病治疗的医疗支出逐年加大，因此开发新的更安全和毒副作用低的2型糖尿病治疗药物具有重要的现实意义。
传统复方药物长期以来凭借多成分、多靶点、整体观的作用特点愈发受到重视，但由于成分复杂、物质基础不明反而成为了制约其走向世界的瓶颈。
本发明所涉及的一种治疗2型糖尿病的药物组合物来源于经典名方增液汤。增液汤，始载于清代吴鞠通所编《温病条辨》卷二，由玄参、生地和麦冬三种常用滋阴药以5：4：4组成，具养阴增液润肠之功，主治阳明津液灼伤，肠燥便秘之邪少虚多证，近年来被临床作为治疗阴虚热盛型糖尿病(2型糖尿病早期)的常用方剂。文献报道增液汤(德学慧，内蒙古中医药，2007,(01)：34-35；王清仪，中医临床研究，2016,8(31):97-9；邹译娴等，浙江中医药大学学报，2019,43(08):810-813；韩辅等，中国中医药现代远程教育，2014,12(10):15-16；陈文群等，湖南中医杂志，2012,28(06):32-33)具有改善2型糖尿病的作用。
中国专利CN 111632058A、CN 111358800A、CN 111214476A、CN110403948A、CN109125334A、CN 107375308A、CN 105412131A、CN108451961A等分别报道了毛蕊花糖苷具有抗神经退行性疾病的作用，防止老年痴呆的作用，抗炎的功效，促进神经功能恢复和预防新生儿缺氧缺血性脑病后致残致死的作用，改善肾小球足细胞损伤型肾脏疾病的作用，改善肺炎的作用，改善2型糖尿病肾病的作用。
中国专利CN 110123800A、CN 102600120A分别报道了肉桂酸具有明显的抗鼻咽癌的效果，抗家禽病毒病活性的作用。中国专利CN 109260188A报道了对香豆酸具有改善人急性淋巴细胞白血病的功效。中国专利CN 111481533A、CN 108714146A、CN 104337801A、CN106256350A、CN 103642850A、CN111012771A、CN 104083349A、CN 102342926A、CN102125542A、CN 1718566A等分别报道了阿魏酸具有治疗血管疾病的作用，防治放射性肠、脑损伤的作用，治疗脑组织缺血损伤的效用，有良好的抗氧化能力，抑制肺部炎性损伤的作用，抗焦虑的作用，促进皮肤伤口愈合的效用，防治骨质疏松的作用，预防和治疗老年痴呆的作用。
目前尚无增液汤成分及其组合物用于2型糖尿病的相关作用报道，以上述有效成分组成的组合物也未见其关于治疗2型糖尿病的报道。
发明内容
针对临床上现有的治疗2型糖尿病的缺点，本发明的目的在于提供一种具有降低血糖、血脂作用的药物组合物及其在制备治疗2型糖尿病的应用。
技术方案
一种药物组合物，其特征在于：包括哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸。
进一步而言：
一种药物组合物，其特征在于按配制1mL溶液计，包括哈巴苷700-1500μg/ml、哈帕俄苷200-400μg/ml、毛蕊花糖苷140-280μg/ml、肉桂酸100-250μg/ml、阿魏酸10-25μg/ml、对香豆酸10-25μg/ml。
所述的药物组合物在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。
具体而言：本发明通过步骤获得：
一种用于治疗2型糖尿病的药物组合物，其特征在于由下述重量配比的以下成分组成，哈巴苷(708.632-1417.264μg/ml)、哈帕俄苷(207.128-414.256μg/ml)、毛蕊花糖苷(139.352-278.704μg/ml)、肉桂酸(116.632-233.264μg/ml)、阿魏酸(11.92-23.84μg/ml)、对香豆酸(12.192-23.384μg/ml)；
通过如下方法和步骤制备：
a.增液汤按玄参、生地、麦冬5：4：4的比例称取，以10倍量、8倍量、6倍量的水热提取3次，每次1h，合并提取液，于55℃水浴旋蒸，得到的浸膏冷冻干燥成冻干粉，得率为75.38％。
b.HPLC测定增液汤中哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸的含量。
c.按6种单体成分在增液汤中的比例，配制为等剂量的药物组合物溶液。
d.按6种单体成分在增液汤中的比例，配制c中所述溶液的2倍浓度即为高剂量的药物组合物溶液。
按照上述方法所制备的药物组合物，其特征在于，主要的化学成分为哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸而且它们的重量配比分别为708.632-1417.264μg/ml、207.128-414.256μg/ml、139.352-278.704μg/ml、116.632-233.264μg/ml、11.92-23.84μg/ml、12.192-23.384μg/ml。
药效学实验结果显示，本发明制备的药物组合物可降低2型糖尿病模型大鼠的血糖、血脂，且提取工艺简单，成本低廉，可用于制备治疗2型糖尿病药物。
有益效果：
作为中药领域的公知常识，一般来说作为中药复方的汤剂效果最好，但其制备复杂，不易保存，服用大量，患者难以接受。因此有必要对传统中药组方进行优化或简化，其中很重要思路是将其中主要成分进行组方，但令人遗憾的是往往用主要成分组方后，其效果大打折扣，原因有很多，如原方产生中复杂的成分之间协同增效，或产生新的成分参与药效等，故在中药领域能够保持原来药效有效成分组方是本领域一直需要解决难题，如果有效成分组方的效果优于原方，那么难度更大，更难解决。
本发明根据增液汤进行简化，具体为将主要成分代替中药材重新组方，令人惊讶地是组方后的结果优于原增液汤，可显著地降低2型糖尿病模型大鼠的血糖、血脂，同时制备更为简单，患者服用剂量更小，更便于制备成片剂等。作为药品注册来说，其工艺更为简单，质量更为可控，是属于中药现代化的一部分。
附图说明
图1(A)为喂养高脂饲料3周后的大鼠体重，图1(B)为注射链脲佐菌素后3天的空腹血糖值。**，p<0.01，*，p<0.001，与对照组比较。
图2(A)为给药3周后的大鼠体重，图2(B)为给药3周后的大鼠摄食量。##，p<0.01，###，p<0.001，与空白组比较；*，p<0.05，**，p<0.01，***p<0.001，与模型组比较。C组为对照组；M组为模型组；DM组为等量药物组合物。DH，高量药物组合物。ZYD，8g/kg增液汤。MET，25mg/kg二甲双胍。
图3(A)为大鼠给药24天后的空腹血糖，图3(B)为大鼠给药24天后的GSP浓度，图3(C)为大鼠给药三周后的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，图3(D)是OGTT血糖曲线下面积。##，p<0.01，###，p<0.001，与空白组比较；*，p<0.05，**，p<0.01，***p<0.001，与模型组比较。
图4(A)为大鼠给药24天后甘油三酯的浓度，图4(B)大鼠给药24天后总胆固醇的浓度，图4(C)大鼠给药24天后低密度脂蛋白的浓度。##，p<0.01，###，p<0.001，与空白组比较；ns,p>0.05，*，p<0.05，**，p<0.01，***p<0.001，与模型组比较。
图5(A)为大鼠给药24天后空腹胰岛素的浓度，图5(B)胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，图5(C)胰岛素敏感指数(HOMA-ISI)。##，p<0.01，###，p<0.001，与空白组比较；ns,p>0.05，*，p<0.05，**，p<0.01，***p<0.001，与模型组比较。
图6为对照组、模型组、等量药物组合物、高量药物组合物、增液汤、二甲双胍6个组别胰腺组织的HE染色(×200)。
具体实施方式
实施例1毛蕊花糖苷、哈巴苷、哈帕俄苷、肉桂酸、对香豆酸、阿魏酸6种药物组合物的制备
1、材料：对照品：Acteoside(毛蕊花糖苷)，harpagide(哈巴苷)，harpagoside(哈帕俄苷)购自四川省维克奇生物科技有限公司(纯度≥98％)，cinnamic acid(肉桂酸)，p-coumaric acid(对香豆酸)，ferulic acid(阿魏酸)购自成都普瑞法科技开发有限公司，对照品纯度均达到98％以上。玄参、生地、麦冬(南京传统中医药门诊部)，甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司)，乙腈(德国Merck公司)，甲酸(阿拉丁生化科技有限公司)，纯水(屈臣氏饮用水有限公司)，正丁醇(Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd)。
2、仪器：Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)，低温离心机(德国Beckman公司)，冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)，电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)，恒温水浴锅(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)，HQ-300E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，岛津LC-2010C液相色谱系统(岛津(中国)有限公司)。
3.增液汤的制备
增液汤按玄参、生地、麦冬5：4：4的比例称取，以10倍量、8倍量、6倍量的水热提取3次，每次1h，合并提取液，于55℃水浴旋蒸，得到的浸膏冷冻干燥成冻干粉，得率为75.38％。
4、HPLC测定增液汤中哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、对香豆酸、阿魏酸的含量
通过建立哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、对香豆酸、阿魏酸6种化合物的标准曲线，最终对6种化合物的含量进行测定，测量结果如表3所示。
表3增液汤中各组分含量测定结果(μg/g,n＝3)
5、哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸药物组合物的制备
按6种成分在增液汤中的比例，配制为每1mL分别含有708.632μg、207.128μg、139.352μg、116.632μg、11.92μg、12.192μg的哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸，即为等剂量药物组合物溶液(DM)。
按6种成分在增液汤中的比例，配制为每1mL分别含有1417.264μg、414.256μg、278.704μg、233.264μg、23.84μg、24.384μg的哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸，即为高剂量药物组合物溶液(DH)。
实施例2哈巴苷、哈帕俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸组合物对2型糖尿病大鼠的影响
1、材料：高脂饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)，链脲佐菌素(STZ，德国BIOFoxx公司)，大鼠INS测定试剂盒(上海科鉴生物有限公司)葡萄糖(α-D-Glucose，阿拉丁公司)，盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司)，糖原含量、糖化血清蛋白(GSP)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。受试药物为实施例1制备得到的药物组合物溶液。
2、仪器：酶标仪(美国Bio-Tek公司)，低温离心机(Thermo公司)，血糖仪(德国罗氏诊断有限公司)，PHS-3BWpH计(上海班特仪器有限公司)。
3、药物配制
高脂饲料：10％猪油，10％蛋黄，1％胆固醇，0.2％胆酸盐，78.8％普通饲料。盐酸二甲双胍溶液：取适量二甲双胍片剂，粉碎，以双蒸水配制成浓度为25mg/mL的溶液，4℃保存。增液汤：将增液汤冻干粉溶于双蒸水中，配置成浓度为0.8g/mL的增液汤溶液。葡萄糖溶液：取适量葡萄糖粉末，以双蒸水溶之，配制成0.2g/mL的葡萄糖溶液。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：取1.05g柠檬酸(FW 210.14)，溶于50mL双蒸水中，得A液；取1.47g柠檬酸钠(FW,294.10)，溶于50mL双蒸水中，得B液。混合A,B液(v/v,1:1.32)，测量pH值，调节pH到4.25。0.22μm滤膜过滤，4℃冷藏备用。
链脲佐菌素(STZ)溶液：称取STZ粉末50mg共三份，置于锡箔纸包裹的离心管内，连同柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液置于冰浴中。注射前50mg的STZ粉末溶于5mL的缓冲液中，配制成1％浓度(w/v)的STZ溶液。STZ溶液易失活，故须避光操作，且现用现配。
4、T2DM大鼠模型建立
动物购自扬州大学比较医学中心。雄性5周龄Wistar大鼠(140-160g)，饲养于温度22±1℃，相对湿度50-60％，12h光/暗循环的动物房内，自由饮食。大鼠适应性饲养一周后，以高脂饲料喂食3周。之后禁食不禁水12h，称量大鼠体重，以35mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液。三天后，禁食12h，以血糖测试仪测量并记录大鼠血糖，大鼠血糖值≥11.1mM表明造模成功，见图1A和图B。
分组及给药
空白组(C)：以1mL/100g灌胃给予双蒸水，一日一次，连续三周。模型组(M)：以1mL/100g灌胃给予双蒸水，一日一次，连续三周。增液汤组(ZYD)：以1mL/100g灌胃给予0.8g/mL的ZYD，一日一次，连续三周。二甲双胍组(Met)：以1mL/100g灌胃给予25mg/mL的二甲双胍溶液，一日一次，连续三周。等剂量药物组合物溶液(DM)：以1mL/100g灌胃给予实施例1配好的等剂量药物组合物溶液，一日一次，连续三周。高剂量药物组合物溶液(DH)：以1mL/100g灌胃给予实施例1配好的高剂量药物组合物溶液，一日一次，连续三周。
5、实验方法
6.1血糖测定
空腹血糖测定：大鼠给药24天后，禁食12h，尾尖采血，血糖仪测定空腹血糖值。
口服糖耐量测定：大鼠给药3周后，禁食12h，测定血糖，作为0min血糖值，随后灌胃给予2g/kg的葡萄糖溶液，测定给予葡萄糖之后的15min、30min、60min、120min的血糖值，梯形法计算血糖曲线下面积(AUC)：AUC＝0.5×(Bg0+Bg30)/2+0.5×(Bg30+Bg60)/2+1×(Bg60+Bg120)/2。
6.2大鼠体重、进食量的测定
于造模前记录大鼠体重，给药后每日记录各组大鼠进食量、体重。
6.3血清生化指标的测定
给药24天后，大鼠眼眶后静脉丛取血，在室温下3500rpm离心10min，取上清，在-20℃下保存。按照试剂盒说明书测定各组大鼠血清的糖化血清蛋白(GSP)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。
6.4病理组织形态学观察
摘除大鼠胰腺于4％多聚甲醛溶液中固定，常规取材，脱水，石蜡包埋。切片经HE染色，光学显微镜观察。
6、实验结果
7.1T2DM大鼠模型建立
空白组大鼠连续给予普通饲料3周，造模大鼠连续给予高脂饲料3周，对比两组体重，统计具有显著性差异(p<0.01)，造模大鼠比空白大鼠的体重明显增加(图1-A)。
在模型大鼠注射STZ、空白组大鼠注射等量的柠檬酸钠缓冲液之后的第三天，对空白、造模大鼠进行空腹血糖测定，造模大鼠空腹血糖值≥11.1mmol/L为模型成功大鼠(图1-B)。
实验结果表明此次T2DM大鼠模型建立成功。
7.2对T2DM大鼠体重、饮食量变化
给药三周后，除空白组，其他组大鼠体重均有所下降；与模型组相比，各给药组体重改变量没有明显的差异，DM组、ZYD组和Met组有对体重下降改善的趋势(图2-A)。
在摄食量方面，模型组均较空白组有明显的增加，DM组较模型组饮食有所下降(p<0.05)；DH组较模型组无明显变化；ZYD组及Met组均有明显改善(p<0.01，p<0.001)，具体见图2-B。
以上结果可以看出DM组能够改善大鼠的多食症状，轻微改善体重下降及多饮症状。
7.3对T2DM大鼠血糖水平的影响
2型糖尿病最显著的临床症状为血糖升高。给药24天后，测定各组大鼠的空腹血糖值(图3-A)，模型组较空白组，其空腹血糖值始终居于很高的水平，统计具有极显著差异(p<0.001)；各给药组相较于模型组，空腹血糖值均有明显的下降(p<0.01)，且DM组、DH组较ZYD组降糖作用更强。结果表明DM组、DH组均具有降低T2DM大鼠空腹血糖的作用，且较全方ZYD效果更显著。
糖化血清蛋白与血糖均能反映机体血糖的控制程度，与空腹血糖反映即时血糖不同，糖化血清蛋白能够反映采血前1-3周内的血糖平均水平。通过测定血清中GSP的含量发现(图3-B)，模型组相较于空白组，其GSP含量明显上升，而各给药组均较模型组GSP含量有所下降，其中DM组下降最明显(p<0.001)。结果表明DM组、DH组均可降低糖化血清蛋白水平，降低血糖，且DM组较全方ZYD组效果更明显。
T2DM大鼠由于胰岛细胞相对受损或胰岛素抵抗，使得机体调节血糖的能力降低，通过口服糖耐量测试，了解机体对血糖的调节能力。通过测定发现(图3-C，图3-D)，相较于空白组，模型组血糖曲线下面积明显增加(p<0.001)，说明其血糖调节能力显著降低；DM组能够显著降低T2DM大鼠的血糖曲线下面积(p<0.01)，而其它组大鼠均未改善葡萄糖耐量。结果说明DM组可以改善T2DM大鼠的口服糖耐量，提高T2DM大鼠的血糖调节能力。
7.4对T2DM大鼠血脂水平的影响
给药24天后，测定大鼠血清中TG、T-CHO、LDL-C的含量。结果显示(图4)，相较于空白组，模型组T-CHO、TG、LDL-C显著性升高(p<0.001)；与模型组相比，DM组、DH组、ZYD组、Met组的TG、T-CHO、LDL-C均有显著性降低(p<0.001)。结果表明DM组、DH组、ZYD均能降低糖尿病大鼠的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，调节血脂紊乱、改善血脂代谢的作用。
7.5对糖尿病大鼠血清胰岛素水平的影响
给药24天后，测定各组大鼠空腹血清胰岛素含量。结果如(图5-A)所示，相较于空白组，模型组空腹血清胰岛素水平有所下降(p<0.05)；DM组、ZYD组、Met组与模型组相比，胰岛素水平有所上升(p<0.05)。结果表明DM组、ZYD组均能使T2DM大鼠的血清胰岛素增加，缓解胰岛素分泌不足的症状。
以空腹血糖值与空腹胰岛素值计算大鼠的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(HOMA-ISI)。结果发现(图5-B，图5-C)，相较于空白组，模型组HOMA-IR显著升高(p<0.001)，HOMA-ISI显著降低(p<0.001)；表明模型大鼠胰岛素抵抗水平增加而胰岛素敏感性降低；DM组和DH组相较于模型组，则HOMA-IR显著降低(p<0.001)，HOMAISI显著升高(p<0.001)；ZYD组HOMA-IR显著降低(p<0.01)，HOMA-ISI显著升高(p<0.01)。结果表明DM组、DH组均能改善胰岛素抵抗水平，增加机体胰岛素敏感性，且均比ZYD组、Met组的效果要强。
7.6对糖尿病大鼠胰岛组织形态学的影响
通过对胰腺组织H-E染色发现(图6)，正常大鼠胰岛组织分布于腺泡之间，周界清晰整齐，胰岛细胞成团状，胰岛细胞核呈圆形，蓝色着染；模型组胰岛发生病变，胰岛萎缩，胞质疏松淡染，外分泌腺侵入胰岛，少量腺泡细胞伸入胰岛内并与胰岛细胞相参差，胰岛与分泌腺之间周界消失，且部分胰岛细胞发生空泡变性；各给药组相较于模型组细胞变形程度均有不同程度减轻，胰岛细胞周界稍清晰，结果表明DM、DH组及ZYD均具有一定的胰岛细胞保护作用。
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