具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中连翘脂素与奥沙利铂均通过商业途径购买得到。

在如下的实施例中，连翘脂素的化学结构为：

实施例1连翘脂素对结肠癌细胞株HCT116和结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP增殖抑制作用

细胞培养：人结肠癌细胞株HCT116和结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP。培养基为90％RPMI-1640和10％小牛血清，加1％双抗，于37℃、CO₂体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后，每1-2天换液1次，HCT116/L-OHP细胞培养时加入含5μg/mL奥沙利铂药物的培养基，细胞长至80％-90％后，用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。

细胞传代：将快长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入3-4mL PBS洗两遍，加入1mL胰蛋白酶消化1-2min，显微镜下观察，细胞都变圆后加入2mL培养基终止消化，吹打混匀细胞。将细胞悬液吸入离心管中，1000r/min，离心5min，弃去上清液，加入培养基混匀后分装稀释细胞，放于培养箱中继续培养。

样品浓度梯度配制：称取连翘脂素，用DMSO(二甲基亚砜)溶解，配制成100mg/mL储液浓度，然后用培养基稀释成不同浓度梯度的连翘脂素的工作液浓度。DMSO含量控制在0.2％以下。

调整细胞悬液浓度为5×10⁴cell/mL，吹打混匀后，每孔加入100μL，铺板使细胞调密度至5000个cell/孔，(边缘孔用无菌PBS溶液填充)。5％CO₂，37℃孵育24小时，至细胞贴壁(96孔平底板)，吸弃旧培养基，加入刚配制的含不同浓度连翘脂素的新培养基。

5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。

每孔加入20μL MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，即噻唑蓝，简称MTT，5mg/mL)溶液，继续培养4小时。

然后小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD₅₇₀nm处测量各孔的吸光度值A。

每组设置5个重复孔，根据吸光度值A作图。

细胞活力(％)＝(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)×100％，细胞增殖抑制率(％)＝1-细胞活力，计算每个浓度的药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，采用SPSS 23软件计算出半数抑制率IC₅₀。

实验结果

连翘脂素对结肠癌细胞株HCT116的增殖抑制作用结果如图1(*p<0.05，**p<0.01)，连翘脂素浓度依次为：0、25、50、100、200、(μg/mL)，随着连翘脂素浓度的增加，HCT116细胞活力逐渐下降，表明连翘脂素对HCT116细胞有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性。用SPSS 23软件计算得出连翘脂素对结肠癌细胞株HCT116的IC₅₀为：120.51μg/mL。

连翘脂素对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖抑制作用结果如图2(*p<0.05，**p<0.01)，连翘脂素浓度依次为：0、25、50、100、200(μg/mL)，随着连翘脂素浓度的增加，HCT116/L-OHP细胞活力逐渐下降，表明连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性。用SPSS 23软件计算得出连翘脂素对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的IC₅₀为：126.73μg/mL。

结论：连翘脂素对结肠癌细胞株HCT116和结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖均有抑制作用，且随着连翘脂素浓度的增加，抑制作用依次增大。

实施例2奥沙利铂对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP耐药性检测

细胞培养：人结肠癌细胞株HCT116和结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP。培养基为90％RPMI-1640和10％小牛血清，加1％双抗，于37℃、CO₂体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后，每1-2天换液1次，HCT116/L-OHP细胞培养时加入含5μg/mL奥沙利铂药物的培养基，细胞长至80％-90％后，用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。

调整细胞悬液浓度为5×10⁴cell/mL，吹打混匀后，每孔加入100μL，铺板使细胞调密度至5000个cell/孔，(边缘孔用无菌PBS溶液填充)。5％CO₂，37℃孵育24小时，至细胞贴壁(96孔平底板)，吸弃旧培养基，加入含不同浓度奥沙利铂的新培养基。5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20μL MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，即噻唑蓝，简称MTT，5mg/mL)溶液，继续培养4小时。

然后小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD₅₇₀nm处测量各孔的吸光度值A。

细胞活力(％)＝(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)×100％，细胞增殖抑制率(％)＝1-细胞活力，计算每个浓度的药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，采用SPSS 23软件计算出半数抑制率IC₅₀。

实验结果

用不同浓度的奥沙利铂分别作用于结肠癌细胞HCT116和结肠癌耐奥沙利铂细胞HCT116/L-OHP 48小时，通过MTT法检测细胞活力。如图3和图4所示(*p<0.05，**p<0.01)，奥沙利铂对HCT116和HCT116/L-OHP的抑制作用呈浓度依赖性，用SPSS 23软件计算得出奥沙利铂作用于HCT116和HCT116/L-OHP细胞的IC₅₀值分别为9.7和78.6μg/mL，其耐药指数为8.1。

实施例3连翘脂素联合奥沙利铂对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP增殖抑制作用

细胞培养：人结肠癌细胞株HCT116和结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP。培养基为90％RPMI-1640+10％小牛血清，加1％双抗，于37℃、CO₂体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后，每1-2天换液1次，HCT116/L-OHP细胞换液时加入含奥沙利铂药物(5μg/mL)培养基，细胞长至80％-90％后，用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。

样品浓度梯度配制：称取连翘脂素，用DMSO溶解，配制成100mg/mL储液浓度，然后用培养基稀释成不同浓度(30μg/mL、50μg/mL、60μg/mL)的含连翘脂素药物工作液浓度。DMSO含量控制在0.2％以下。

调整细胞悬液浓度为5×10⁴cell/mL，吹打混匀后，每孔加入100μL，铺板使细胞调密度至5000cell/孔，(边缘孔用无菌PBS溶液填充)。5％CO₂，37℃孵育24小时，至细胞贴壁(96孔平底板)，吸弃旧培养基，加入刚配制的含连翘脂素和相应的奥沙利铂药物的新培养基。5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。

每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。

终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD₅₇₀nm处测量各孔的吸光度值A。

每组设置5个重复孔，根据吸光度值作图。

细胞活力(％)＝(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)×100％，细胞增殖抑制率(％)＝1-细胞活力，算出每个浓度的药物下对肿瘤细胞的增殖抑制率，采用SPSS 23软件计算出半数抑制率IC₅₀。

实验结果

连翘脂素(50μg/mL)联合奥沙利铂(10-160μg/mL)对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖抑制作用结果如图5(*p<0.05，**p<0.01)，其中横坐标指的是奥沙利铂的浓度，连翘脂素(50μg/mL)联合奥沙利铂(10-160μg/mL)能增加奥沙利铂对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖抑制作用。用SPSS 23软件计算得出连翘脂素(50μg/mL)联合奥沙利铂(10-160μg/mL)对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的IC₅₀为：26.38μg/mL。计算逆转倍数＝单用奥沙利铂IC₅₀/联合作用IC₅₀＝78.59/26.38＝3。

连翘脂素联合奥沙利铂对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖抑制作用结果如图6(*p<0.05，**p<0.01)，连翘脂素(30μg/mL、60μg/mL)和奥沙利铂(20μg/mL)联用能降低HCT116/L-OHP细胞的活力，且连翘脂素(30μg/mL、60μg/mL)和奥沙利铂(20μg/mL)联合作用，比单用奥沙利铂(20μg/mL)时HCT116/L-OHP细胞活力更低。表明连翘脂素能增加奥沙利铂对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖抑制作用。

结论：连翘脂素具有抗结肠癌耐奥沙利铂耐药株的作用，其联合奥沙利铂，能增加奥沙利铂对结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖抑制作用，且逆转倍数为3。

实施例4细胞集落形成实验，检测连翘脂素对耐药细胞株HCT116/L-OHP细胞集落形成的影响

实验步骤

细胞培养：人结肠癌耐奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP。培养基为90％RPMI-1640+10％小牛血清，加1％双抗，于37℃、CO₂体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后，每1-2天换液1次，换液时加入奥沙利铂药物，细胞长至80％-90％后，用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。

样品浓度梯度配制：称取连翘脂素，用DMSO溶解，配制成100mg/mL储液浓度，然后用培养基稀释成0、50、100μg/mL梯度的含连翘脂素药物工作液浓度。

调整细胞悬液浓度，吹打混匀后，加入6孔板中，每孔加入2000个细胞，5％CO₂，37℃孵育24小时，至细胞贴壁，吸弃旧培养基，每孔分别加入3mL现配好的含连翘脂素药物培养基。

5％CO₂，37℃培养10天，中间根据培养液pH变化适时更换含药新鲜培养液，在倒置显微镜下观察。

当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，用PBS液小心浸洗2次，然后置于空气中干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

拍照记录，Image J软件计算细胞克隆形成的数量，计算相对克隆形成率并分析结果(被定义为至少50个细胞的集群)。

相对克隆形成率(％)＝(实验组集落克隆数/对照组集落克隆数)×100％。

实验结果及分析

连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞集落形成的影响见图7，连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞集落形成的影响分析结果见图8，从图7、8可知：HCT116/L-OHP细胞集落克隆数随连翘脂素的浓度增大而递减，当连翘脂素浓度为50μg/mL时，HCT116/L-OHP细胞相对克隆形成率为26.5％，当连翘脂素浓度为100μg/mL时，HCT116/L-OHP细胞相对克隆形成率仅为0.3％，表明连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞集落形成有很强的抑制作用。

实施例4流式细胞术检测连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞凋亡的影响

实验步骤

样品浓度梯度配制：称取连翘脂素，用DMSO溶解，配制成100mg/mL储液浓度，然后用培养基稀释成0、25、50、100μg/mL浓度梯度的含连翘脂素药物工作液浓度。

调整细胞悬液浓度，吹打混匀后，加入6孔板中。5％CO₂，37℃培养至细胞长至60％-70％，吸弃旧培养基，每孔分别加入3mL现配好的含连翘脂素药物培养基。5％CO₂，37℃培养48h，在倒置显微镜下观察。

收集细胞：将旧培养液弃去，加入1-2mL PBS洗两遍，加入1mL胰蛋白酶消化1min，显微镜下观察，待细胞变圆后加入2mL培养基终止消化，吹打混匀细胞。将细胞悬液吸入离心管中，1000rpm，离心5min，弃去上清液，加入无血清培养基混匀重悬。

按细胞凋亡检测试剂盒说明书对样品染色：用预冷的PBS洗涤细胞2次，4℃离心5min。收集1-5×10⁵细胞。吸弃PBS，加入100μL1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μLAnnexin V-FITC(膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素)和10μL PI(碘化丙啶)染色液，轻轻混匀。避光、室温反应10-15min。加入400μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

实验结果及分析

连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞凋亡的影响结果见图9。由实验结果可知连翘脂素能促进HCT116/L-OHP细胞凋亡，当连翘脂素浓度为25μg/mL时，HCT116/L-OHP细胞凋亡率为25.52％，作用最为明显。

实施例5通过Elisa实验检测连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞内蛋白酪氨酸激酶JAK2及磷酸化JAK2的影响

实验步骤

样品浓度梯度配制：称取连翘脂素，用DMSO溶解，配制成100mg/mL储液浓度，然后用培养基稀释成0、50、100μg/mL浓度梯度的含连翘脂素药物浓度。

调整细胞悬液浓度，吹打混匀后，加入6孔板中。5％CO₂，37℃培养至细胞长至60％-70％，吸弃旧培养基，每孔分别加入3mL现配好的含连翘脂素药物培养基。5％CO₂，37℃培养48h，在倒置显微镜下观察。

细胞总蛋白提取：用刮刀将细胞轻轻刮下，接着用移液器将细胞和上清液转移至1.5ml离心管中，置入4度离心机(提前开离心机预冷)，离心15min，弃去上清液。配制裂解液(所用裂解液为RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分释放)，每1mL裂解液加10μL PMSF(苯甲基磺酰氟，100mM)，摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。将配制好的裂解液加入获得的细胞沉淀中，一般5×10⁶个细胞加入100μL的裂解液，然后吹打重悬，使细胞充分裂解。冰上裂解30min，中间每过10min在振荡器上晃匀后继续裂解，12 000rpm离心15min，吸取上清，BCA法检测蛋白浓度。

按Elisa试剂盒说明书操作步骤进行检测。

实验结果及分析

连翘脂素对HCT116/L-OHP细胞内JAK2及磷酸化JAK2蛋白含量的影响见图10-11。由实验结果可知：随着连翘脂素浓度的增大，HCT116/L-OHP细胞JAK2和磷酸化JAK2蛋白含量递增，表明连翘脂素能促进JAK2相关蛋白的表达，同时促进JAK2的磷酸化。表明连翘脂素逆转耐药细胞的耐药性可能与JAK2相关信号通路有关。

实施例6连翘脂素联合奥沙利铂对HCT116/L-OHP细胞形态的影响

将连翘脂素(50μg/mL)和奥沙利铂(20μg/mL)分别单独和联合作用于HCT116/L-OH细胞48小时后，使用倒置显微镜观察细胞生长形态的变化。从图12中可以看出，单加连翘脂素或奥沙利铂与对照组相比细胞形态并无明显变化，而加入连翘脂素、奥沙利铂药物联用组细胞形态发生明显变化，细胞间隙逐渐增大，细胞密度逐渐减小，细胞体积回缩，呈梭形。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。