低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒及制备方法、用途
阅读说明：本技术 低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒及制备方法、用途 (Low-dispersion chitosan-carried astragalus polysaccharide nanoparticles, and preparation method and application thereof ) 是由 王铮 姜明燕 李凯 万龙 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于药品制备技术领域,具体提供一种低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒及制备方法、用途,采用喷雾干燥的方法进行制备,具体包括称取黄芪多糖,溶于乙酸溶液中,超声后,一定转速下搅拌一定时间,得到黄芪多糖-乙酸混合液；将混合液在一定转速下离心,取上清液,称取壳聚糖加入上清液中,超声后一定转速下搅拌一定时间,得低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液；将低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液进行喷雾干燥,得到低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒。本发明提供的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒增加了黄芪多糖的吸收,并且具有免疫系统增强和免疫系统纠正的作用。(The invention belongs to the technical field of medicine preparation, and particularly provides a chitosan-loaded astragalus polysaccharide nanoparticle with low dispersity, a preparation method and application thereof, wherein the chitosan-loaded astragalus polysaccharide nanoparticle is prepared by adopting a spray drying method, and the preparation method specifically comprises the steps of weighing astragalus polysaccharide, dissolving the astragalus polysaccharide in an acetic acid solution, carrying out ultrasonic treatment, and stirring for a certain time at a certain rotating speed to obtain an astragalus polysaccharide-acetic acid mixed solution; centrifuging the mixed solution at a certain rotating speed, taking supernatant, weighing chitosan, adding into the supernatant, and stirring for a certain time at a certain rotating speed after ultrasonic treatment to obtain a low-dispersion chitosan-carried astragalus polysaccharide solution; and (3) carrying out spray drying on the low-dispersion-degree chitosan-carried astragalus polysaccharide solution to obtain the low-dispersion-degree chitosan-carried astragalus polysaccharide nanoparticles. The chitosan-loaded astragalus polysaccharide nanoparticles with low dispersity provided by the invention increase the absorption of astragalus polysaccharide, and have the functions of enhancing and correcting an immune system.)
技术领域
本发明属于药品制备技术领域，具体提供一种低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒及制备方法、用途。
背景技术
癌症的发病率、死亡率、复发率均高，严重威胁着人们的健康。很多病人难以早期诊断，就诊时多已经处于进展期，手术疗效欠佳或失去手术的机会，术后化学药物治疗在癌症综合治疗中发挥了重要作用。但现有的化疗药物在抑制和杀伤肿瘤组织的同时，大多引起其他组织细胞的破坏和损伤，局部组织细胞变性坏死，出现炎症反应。以中药联合治疗胃癌患者，可以在保证化疗药物效果的同时减少毒副反应，改善机体免疫功能，减轻炎症反应，这已经成为目前的研究热点，并取得了显著效果。传统中药黄芪益气补虚，适用于因化疗后白细胞减少、免疫功能低下的肿瘤患者。黄芪多糖是黄芪的主要有效成分，在肿瘤治疗中发挥了较好的作用。但黄芪多糖是否能改善癌症术后的炎性反应报道较少，药物研发及临床应用尚不成熟。
由于黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)分子量过大，水溶性差，吸收不好，生物利用度低，容易受胃酸影响(胃溶型)等因素，从而影响治疗效果，这也是目前限制黄芪多糖广泛应用于癌症临床治疗的主要因素。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒及制备方法、用途。
本发明是这样实现的，提供一种低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒的制备方法，采用喷雾干燥的方法进行制备，具体包括如下步骤：
1)称取1～2.831g黄芪多糖，溶于2000～2200ml的0.5～0.65％乙酸溶液中，超声10～15min后，500～600rpm下搅拌10-12小时，得到黄芪多糖-乙酸混合液；
2)将混合液在4000～4500rpm下离心10～15min，取上清液，称取5～6g壳聚糖加入上清液中，超声10～15min，600～650rpm下搅拌10-12小时，得低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液；
3)将步骤2)制备的低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液进行喷雾干燥，参数设置为入口温度：120～125℃，蠕动泵进样速度：3～4mL/min，空气压缩机的喷雾器流量：650～700L/h，吸气机功率：90～95％，得到低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒。
优选地，所述步骤1)中，称取黄芪多糖的质量为2.831g，溶于2000ml的0.5％乙酸溶液中。
进一步优选，所述步骤3)中，使用的喷雾干燥仪的喷头为0.7mm。
本发明还提供一种上述的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒的制备方法制备的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒。
本发明还提供一种上述的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒的制备方法制备的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒在免疫系统增强和免疫系统纠正上的应用。
优选地，所述免疫系统增强包括治疗免疫缺陷疾病、慢性感染疾病和癌症的过程中造成的免疫系统低下的增强；所述免疫系统纠正包括用于治疗自身免疫性疾病。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
选取生物相容性好的壳聚糖作为黄芪多糖纳米载体，不但可以增加黄芪多糖的稳定性，而且壳聚糖作为阳离子型聚合物，其独特的生物学性质可使其可以打开肠道的紧密连接，进而增加黄芪多糖的口服吸收。黄芪多糖的免疫调节作用能够控制Th1/Th2细胞比例的平衡，使其不但可以用于免疫系统的增强，也可以用于治疗免疫系统亢进疾病。免疫增强作用用于治疗免疫缺陷疾病、慢性感染和作为癌症的辅助治疗。免疫纠正作用可用于治疗自身免疫性疾病如鼻炎，红斑狼疮等。
附图说明
图1为采用本发明提供的喷雾干燥的方法制备的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒外观照片；
图2为图1中低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒的透射电镜照片；
图3为实施例4中按照冷冻干燥的方法制备的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒外观照片；
图4为图3中低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒的透射电镜照片；
图5为低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒对胃癌小鼠脾指数的影响；
图6为低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒对胃癌小鼠胸腺指数的影响；
图7为低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒对胃癌小鼠T淋巴细胞百分比的影响；
图8为低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒对胃癌小鼠CD4+/CD8+的比值的影响；
图9为低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒对胃癌小鼠调节血浆细胞因子IFN-γ和IL-4水平的影响；
图10为低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒对胃癌小鼠IFN-γ/IL-4的比值的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、
1)称取1g黄芪多糖，溶于2000ml的0.5％乙酸溶液中，超声10min后，500rpm下搅拌10-12小时，得到黄芪多糖-乙酸混合液；
2)将黄芪多糖-乙酸混合液在4000rpm下离心10min取上清液，沉淀弃去，称取5g壳聚糖加入上清液中，超声10min，600rpm下搅拌10-12小时，得低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液；
3)将低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液转移至喷雾干燥仪B-290的样品台上，备用，喷嘴选最小的喷头(0.7mm)。仪器参数设置为入口温度(inlet temperature)：120℃，蠕动泵进样速度(feed rate)：3mL/min(12.4％)，空气压缩机的喷雾器流量(spray air flow)：调至4cm高(约667L/h)，吸气机功率(aspirator flow)设为90％，得低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒粉末。
4)精密称取干燥恒重的黄芪多糖50mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液(每1mL含黄芪多糖0.50mg)。应用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，取供试液0.5mL，加入0.5mL水，将试管置于冰水浴中加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀。沸水浴15min，静置10min至室温，以空白管调零测定吸光度，将吸光度带入D-葡萄糖对照品标准曲线回归方程计算总糖含量。可得黄芪多糖的百分含量即载药量为50％。
实施例2、
1)称取1.5g黄芪多糖，溶于2000ml的0.5％乙酸溶液中，超声10min后，500rpm下搅拌10-12小时。
2)将黄芪多糖-乙酸混合液在4000rpm下离心10min取上清液，沉淀弃去，称取5g壳聚糖加入上清液中，超声10min，600rpm下搅拌10-12小时，得低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液。
3)将低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液转移至喷雾干燥仪B-290的样品台上，备用。喷嘴选最小的喷头(0.7mm)。仪器参数设置为入口温度(inlet temperature)：120℃，蠕动泵进样速度(feed rate)：3mL/min(12.4％)，空气压缩机的喷雾器流量(spray air flow)：调至4cm高(约667L/h)，吸气机功率(aspirator flow)设为90％。得低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒粉末。
4)精密称取干燥恒重的黄芪多糖50mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液(每1mL含黄芪多糖0.50mg)。应用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，取供试液0.5mL，加入0.5mL水，将试管置于冰水浴中加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀。沸水浴15min，静置10min至室温，以空白管调零测定吸光度，将吸光度带入D-葡萄糖对照品标准曲线回归方程计算总糖含量。可得黄芪多糖的百分含量即载药量为60％。
实施例3、
1)称取2.831g黄芪多糖，溶于2000ml的0.5％乙酸溶液中，超声10min后，500rpm下搅拌10-12小时。
2)将低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液在4000rpm下离心10min取上清液，沉淀弃去。称取5g壳聚糖加入上清液中，超声10min，600rpm下搅拌过夜，得低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液。
3)将低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液转移至喷雾干燥仪B-290的样品台上，备用。喷嘴选最小的喷头(0.7mm)。仪器参数设置为入口温度(inlet temperature)：120℃，蠕动泵进样速度(feed rate)：3mL/min(12.4％)，空气压缩机的喷雾器流量(spray air flow)：调至4cm高(约667L/h)，吸气机功率(aspirator flow)设为90％。得低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒粉末。
4)精密称取干燥恒重的黄芪多糖50mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液(每1mL含黄芪多糖0.50mg)。应用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，取供试液0.5mL，加入0.5mL水，将试管置于冰水浴中加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀。沸水浴15min，静置10min至室温，以空白管调零测定吸光度，将吸光度带入D-葡萄糖对照品标准曲线回归方程计算总糖含量。可得黄芪多糖的百分含量即载药量为80％。
实施例4
1)称取2.831g黄芪多糖，溶于2000ml的0.5％乙酸溶液中，超声10min后，500rpm下搅拌10-12小时。
2)将低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液在4000rpm下离心10min取上清液，沉淀弃去。称取5g壳聚糖加入上清液中，超声10min，600rpm下搅拌10-12小时，得低分散度壳聚糖载黄芪多糖溶液。
3)将样品分装到培养皿中，在深低温冰箱中(-80℃)冷冻过夜。第二天将冷冻好的样品转移至冻干仪的冷冻仓隔板上。打开冷冻开关至冷冻仓温度低于-40℃后，打开真空泵开关，等待15min，直到系统压力低于100millitorr。对样品进行冻干72h，即可得冻干LCA纳米粒样品。
4)精密称取干燥恒重的黄芪多糖50mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液(每1mL含黄芪多糖0.50mg)。应用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，取供试液0.5mL，加入0.5mL水，将试管置于冰水浴中加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀。沸水浴15min，静置10min至室温，以空白管调零测定吸光度，将吸光度带入D-葡萄糖对照品标准曲线回归方程计算总糖含量。可得黄芪多糖的百分含量即载药量为70％。
试验例、
实验用小鼠由北京华富康生物技术有限公司提供。
1.形态表征
取实施例1-4制备的低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒适量，用双蒸水稀释，滴一滴在覆盖碳膜的铜网上，再加一滴磷钨酸钠溶液负染，室温条件自然晾干，在透射电镜下观察制剂形态。喷干低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒呈淡黄色，颗粒均匀，表面蓬松(如图1)，透射电镜观察低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒形态均匀一致，呈球形，分散良好，无黏连，直径达纳米级(如图2)。冻干低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒呈金色，絮状盘绕，质韧(如图3)，透射电镜观察冻干低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒形态杂乱，不均一，局部呈现黏连(如图4)
2.包封率及载药量测定
因为此发明用喷干的方法，默认制剂整体被包封，所以暂不需要测定包封率。
精密称取干燥恒重的黄芪多糖50mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液(每1mL含黄芪多糖0.50mg)。应用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，取供试液0.5mL，加入0.5mL水，将试管置于冰水浴中加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀。沸水浴15min，静置10min至室温，以空白管调零测定吸光度，将吸光度带入D-葡萄糖对照品标准曲线回归方程计算总糖含量。最后，根据以下公式可得黄芪多糖的百分含量即载药量。
载药量(％)＝纳米粒中APS质量/纳米粒总质量×100％
结果见表1
载药量(％)
实施例1
50
实施例2
60
实施例3
80
实施例4
70
3.体内实验
取0.2mL对数生长期的MFC胃癌细胞悬液接种于小鼠右侧腋窝皮下，待肿瘤长至直径约为1cm(约2～3周)时，将40只成瘤的Balb/c小鼠应用随机数字表法分为6组，每组6只，雌雄各半。设为阴性对照组；环磷酰胺组；LCA纳米粒低、中、高剂量+环磷酰胺组；香菇多糖阳性对照中药+环磷酰胺组。
LCA纳米粒低、中、高剂量+环磷酰胺组在分组当天分别灌胃给予黄芪多糖200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg，日1次，0.2mL，连续给药14天；香菇多糖阳性对照中药+环磷酰胺组灌胃给予香菇多糖400mg/kg，日1次，0.2mL，连续给药14天。其中涉及环磷酰胺用药均通过腹腔注射环磷酰胺，30mg/kg，0.2mL，给药周期为第5-14天，日一次；阴性对照组灌胃给予水0.2mL，日一次，第5-14天腹腔注射生理盐水0.2mL，日一次。最后一次给药24h后，于第15天，小鼠摘眼球取血，EDTA抗凝，一部分全血进行T淋巴细胞亚群分析，一部分全血1000g离心30min，得到血浆样品，-20℃保存，用于测定血浆细胞因子。颈椎脱位处死后，迅速解剖小鼠，称量脾脏和胸腺湿重，计算脾指数和胸腺指数，器官指数＝器官质量(mg)/体重(g)，结果显示LCA对脾指数和胸腺指数有显著影响(如图5和图6)。
免疫相关指标测定，结果显示通过腹腔注射环磷酰胺以及皮下成瘤，造成免疫抑制小鼠成瘤模型，并给予LCA治疗，结果表明LCA可以增加T淋巴细胞百分比及改善CD4+/CD8+的比值，并通过调节血浆细胞因子IFN-γ和IL-4水平，IFN-γ/IL-4比例，从而调节Th1和Th2细胞平衡,进而改善机体的免疫功能。证明了低分散度壳聚糖载黄芪多糖纳米粒能显著改善化疗药致免疫低下小鼠的免疫功能，对胃癌化疗小鼠有显著的辅助治疗作用(如图7、8、9和10)。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种黄芪多糖组合物及其在抗癌药物中的应用