一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用
阅读说明：本技术 一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用 (Glycoside hydrolase CmChi3 and application thereof in degradation of hydrocolloid chitin ) 是由 陈可泉 王成勇 张阿磊 周宁 王莹莹 陈燕 陈雪曼 欧阳平凯 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解胶体几丁质上的应用。将从土壤中筛选到的菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1进行基因组测序分析、克隆CmChi3、构建重组菌株、表达CmChi3蛋白、纯化HIS-TAG、并鉴定重组蛋白具有两个催化结构域,两个几丁质结合域,具有内切酶和糖苷水解酶两种酶的性质,能高效水解几丁质并以GlcNAc为终产物。此研究预期为单酶法高效生产GlcNAc提供理论依据和基础。(The invention discloses a glycoside hydrolase Cm Chi3 and its application in degrading colloidal chitin. Strains screened from soil Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 for genome sequencing analysis and cloning Cm Chi3, construction of recombinant strain and expression Cm Chi3 protein, purified HIS-TAG, and identified recombinant protein having two catalytic domains, two chitin binding domains, and two enzymes, endonuclease and glycoside hydrolaseThe chitin can be efficiently hydrolyzed and GlcNAc is used as a final product. This study is expected to provide theoretical basis and foundation for efficient production of GlcNAc by a single enzyme process.)
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用。
背景技术
几丁质（Chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键聚合而成的天然高分子多糖，是地球上含量仅次于纤维素的第二大糖类聚合物，其分子式为(C8H13O5N)n，相对分子量在100万以上。几丁质在自然界中广泛存在于真菌细胞壁、昆虫甲壳及虾蟹壳中。几丁质主要来源于虾蟹壳，使用10%的氢氧化钠和浓盐酸对其进行脱蛋白和脱钙处理后可以得到较高纯度的几丁质。随着虾蟹养殖业的发展，产生的虾蟹壳等下脚料越来越多，而这些下脚料多作为固体废弃物被丢弃，堆放几天即会发生腐化并散发出难闻的恶臭，不仅浪费了资源，同时还大大加重了环境负担。因此，利用几丁质废弃物生产高附加值化学品不仅能解决环境问题，还能带来巨大的经济效益。
几丁质作为虾蟹壳中一个主要的组分，可用来生产多种高附加值的含氮化学品，如N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、几丁寡糖及其衍生物等。其中，GlcNAc属于功能性氨基单糖，具有重要的生理功能。目前有许多报道是关于GlcNAc生理活性的应用，比如，GlcNAc对关节炎、类风湿性关节炎、软骨挫伤、关节损伤和退行性关节病治疗也具有增强关节病的治疗效果；GlcNAc含有氨基带正电荷与酸性基团发生反应进而调节细胞周围的酸碱性，达到抑制癌细胞的增长的作用；GlcNAc作为透明质酸的组成成分，用于护肤品具有很好的保湿效果，通常的添加量为0.1-0.5%。另外还有报道GlcNAc在食品添加剂行业具有广泛的应用空间。
目前利用几丁质生产GlcNAc 的方法主要有化学法、物理法和生物酶法。化学转化法主要是通过浓盐酸分解几丁质得到氨基葡萄糖盐酸盐，之后进一步乙酰化合成GlcNAc。该方法成本较低，是目前工业化生产GlcNAc的主要手段，但其产物并不认为是天然的GlcNAc，不能作为食品添加剂使用，并且这种方法会产生大量的工业废水，对环境造成一定的污染。微生物发酵法是目前比较流行的一种方法，通过大肠杆菌的基因工程菌株进行生产GlcNAc。微生物发酵合成法虽然条件温和，但此法后期分离成本高、难度大，也会造成虾蟹壳大量的积累。生物酶法是通过酶催化反应，对几丁质进行酶解，过程绿色、能耗低及专一性强，是实现几丁质向GlcNAc转化的最佳途径，近年来已成为几丁质降解研究的热点。
文献“Production of N-Acetyl-d-glucosamine from Mycelial Waste by aCombination of Bacterial Chitinases and an Insect N-Acetyl-d-glucosaminidase[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2016, 64(35):6738.” 中报道Zhu等利用三个细菌来源的重组几丁质酶 (SmChiA、SmChiB、SmChiC)和一个昆虫来源的重组N-乙酰氨基葡萄糖苷酶协同降解结晶型几丁质，24 h 后GlcNAc 与几丁二糖的比例达93:7。该方法从降解几丁质获取GlcNAc需要多种酶的共同作用，成本较高，转化时间长，无法应用于大规模的生产。
申请号201910242877.4公开了一种同样来源于Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1菌株的几丁质酶。该几丁质酶以胶体几丁质为底物时，主要水解产物为几丁二糖，并不能直接得到GlcNAc。
申请号201410785604.1公开了一种通过微生物发酵产生的粗酶液直接将几丁质转化为N-乙酰氨基葡萄糖的方法。该方法在降解几丁质的过程中需要多种几丁质酶的协同作用，产物不易分离并且降解过程容易染菌。
综合一些文献和专利报道，GlcNAc的酶法制备需要多种几丁质酶如内切型几丁酶（EC 3.2.1.14）、外切型几丁质酶（EC 3.2.1.20）和（EC 3.2.1.201）和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGase, EC 3.2.1.52)等多种酶的协同作用，由于多种酶的提取和纯化的高成本以及转化率不高等原因，目前该法尚未实现工业化生产。因此，挖掘具有多催化活性的几丁质酶，实现单酶法转化几丁质制备GlcNAc是一种能够降低生产成本的有效方法。
发明内容
酶法降解几丁质生产GlcNAc需要多种酶的协同参与，由于多种酶的提取和纯化的高成本，尚未实现工业化生产。本发明提供了一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解胶体几丁质上的应用，旨在通过实现单酶高效水解几丁质制备GlcNAc的方法。这是一种能够有效降低酶提取成本、简化生产工艺的方法，是生物酶法以几丁质为原料制备GlcNAc的有效途径。
氨基酸序列同源性的比较结果显示CmChi3属于糖苷水解酶GH18家族（http://www.cazy.org/）。
一种糖苷水解酶CmChi3，其氨基酸序列如SEN ID NO：2所示；
所述SEN ID NO：2具体如下：
MLKQTRAPYGAKPAFALKTLSAALLLASSVASATEIAPYFEMWYGGASGYPAPTLASAQQQLGLKSVTLAFTIASNGQCKISNDGGGNDLLNGAMKGDIASFRQAGGRVIMSFGGAAGTYIEAVCSVDQMVSLIEGMILNHGIRALDFDVEGGQLSNTQLNNTRNAALKALQAKYPDLYVSFTLPVLPSGLTSPGVAVVRSAAQAGVRVDLVNVMAMDYGSSISSGKKMGDLAVQAAQSLFNQIKPIFPTKTDAELWSMVGVTPMIGQNDVQGEVFTLADAQTLTDFAKQKGLGLIAWWSFQRDRTGTGSYGEYSQVNKANFDFYNIFKAAGTPGSSPTPSPVTPTPVTPVPVTPAPVTPTPVAGQYPEWSASGVYTGGQRVTYQGAVYEAKWWTQGDNPGQSGEWGVWKKVGGAPSPVTPAPVTPAPVTPAPVTPAPVTPAPVTPAPVTPVPVTPAPSGCYAAWAEGKTYAAGTQVTYNNRNYQALVAHTAYAGTGWNPAASPTLWKDIGACSGSPSPVTPAPVTPAPVTPAPVTPAPVTPVPVTPAPVTPAPVTPVPAGDRVVGSYFTQWGVYGRGYEVADVVSSGSASQLTFINYAFGNIYQKNGGYECAAGIDKLESGATNPSDPSAGTGGDAWADYGRTPGRLVDPSKPYTWESPLAGNFGELKNLKAKYPQLKVLISLGGWTWSKWFSAASKTDALRKQLVSSCVDVFIKGNLPSYSGRGGPGSAKGVFDGIDIDWEYPGVIGQPYNTIDAADKQNFTLLLAEFRRQLDALNDGHKLLTVAIGSGKDKIDQTEPAKYSQYLDWINVMTYDFHGGWEATGPTNFQSHLYPDPADPSQGTARTYNVDDAIKNMIAAGTPAKKLVVGVPFYGRGWTGVAAGGNNGLYQAATGPARGTYEAGIEDYKVLKNAAGTVYVHPVTKQSYKYDGTNWWSYDTPAVIQTKIDYVKSQGLGGVFSWSLDGDSNGELAKVLGNGR。
编码上述氨基酸序列的核苷酸序列如SEN ID NO：1所示；
所述SEN ID NO：1具体如下：
ATGTTGAAGC AAACCCGGGC GCCTTACGGC GCCAAGCCGG CTTTTGCGCT GAAAACGCTG 60
AGCGCGGCCC TGCTGCTGGC ATCGAGCGTT GCCAGCGCCA CCGAGATCGC CCCGTACTTC 120
GAGATGTGGT ACGGCGGCGC GAGCGGCTAT CCCGCCCCCA CCCTCGCTTC GGCCCAGCAG 180
CAGCTCGGCC TCAAGAGCGT GACACTGGCG TTCACCATCG CCAGCAATGG CCAGTGCAAG 240
ATCTCCAATG ACGGCGGTGG CAACGATCTG CTGAATGGCG CGATGAAGGG CGATATCGCC 300
AGCTTCCGCC AAGCCGGTGG TCGCGTGATC ATGTCGTTCG GCGGCGCCGC TGGTACCTAT 360
ATCGAGGCGG TGTGTTCGGT CGACCAGATG GTCAGCCTGA TCGAGGGCAT GATCCTCAAC 420
CACGGCATCC GCGCGCTGGA CTTCGACGTC GAGGGCGGCC AGCTTTCCAA CACCCAGCTC 480
AACAACACCC GCAATGCCGC ACTGAAGGCA CTGCAGGCCA AGTATCCGGA TCTGTATGTG 540
TCGTTCACGC TGCCGGTGCT GCCGAGCGGC CTGACCAGCC CGGGCGTGGC CGTGGTGCGT 600
TCCGCTGCGC AAGCTGGCGT GCGCGTTGAC CTCGTCAACG TGATGGCGAT GGATTACGGC 660
TCCAGCATCT CCAGCGGCAA GAAGATGGGC GACCTCGCTG TCCAGGCCGC GCAATCGCTG 720
TTCAACCAGA TCAAGCCGAT CTTCCCGACC AAGACCGATG CCGAATTGTG GTCCATGGTC 780
GGCGTGACGC CGATGATTGG CCAGAACGAC GTGCAGGGTG AAGTCTTCAC CCTGGCCGAT 840
GCGCAGACGC TGACCGACTT CGCCAAGCAG AAGGGCCTTG GCCTGATCGC CTGGTGGTCG 900
TTCCAGCGCG ACCGCACTGG TACGGGCAGC TACGGCGAAT ACAGCCAAGT CAATAAGGCC 960
AACTTCGACT TCTACAACAT CTTCAAGGCT GCCGGCACGC CGGGCAGCTC GCCGACGCCG1020
TCGCCGGTGA CCCCTACCCC GGTCACCCCG GTACCGGTGA CCCCAGCGCC TGTGACGCCG1080
ACCCCGGTGG CCGGCCAGTA TCCGGAATGG AGCGCGAGCG GCGTCTACAC CGGTGGCCAG1140
CGCGTGACCT ATCAAGGTGC CGTGTACGAA GCCAAGTGGT GGACCCAGGG CGACAACCCG1200
GGCCAATCCG GCGAATGGGG CGTATGGAAG AAGGTTGGCG GCGCGCCGTC CCCGGTGACC1260
CCGGCTCCCG TGACACCCGC TCCGGTCACC CCGGCTCCGG TCACACCTGC CCCGGTGACT1320
CCGGCCCCGG TGACTCCGGC CCCTGTGACG CCCGTTCCGG TCACCCCGGC GCCGTCCGGC1380
TGCTATGCGG CCTGGGCTGA AGGCAAGACC TACGCCGCCG GCACCCAGGT CACCTACAAC1440
AACCGCAATT ACCAGGCGCT GGTGGCGCAC ACCGCCTACG CCGGTACTGG CTGGAACCCT1500
GCCGCGAGCC CGACGCTGTG GAAGGACATT GGCGCCTGCA GCGGCTCGCC GAGCCCGGTC1560
ACCCCGGCGC CGGTGACACC CGCTCCCGTA ACGCCTGCGC CGGTCACTCC GGCCCCTGTC1620
ACCCCGGTTC CGGTCACCCC GGCTCCCGTG ACGCCCGCTC CGGTCACCCC GGTCCCGGCC1680
GGTGATCGCG TCGTCGGCTC CTACTTCACC CAGTGGGGCG TGTACGGCCG TGGCTACGAA1740
GTGGCCGATG TGGTCAGCAG CGGCAGCGCG TCGCAGCTCA CCTTCATCAA CTACGCCTTC1800
GGCAATATCT ACCAGAAGAA TGGCGGCTAC GAGTGCGCGG CCGGCATCGA CAAGCTGGAA1860
TCGGGCGCGA CCAACCCGAG CGATCCGTCC GCCGGCACCG GTGGTGACGC CTGGGCCGAC1920
TACGGCCGCA CACCGGGCCG CCTGGTCGAT CCGAGCAAGC CCTACACCTG GGAATCGCCG1980
CTGGCCGGTA ACTTCGGCGA GCTGAAGAAC CTGAAGGCCA AGTATCCTCA GCTCAAGGTG2040
CTGATCTCGC TGGGCGGCTG GACTTGGTCG AAGTGGTTCT CGGCAGCCAG CAAGACCGAC2100
GCACTGAGGA AGCAGTTGGT GAGCTCGTGC GTGGACGTGT TCATCAAGGG CAACCTGCCG2160
AGCTACAGCG GTCGCGGTGG TCCTGGTTCG GCCAAGGGCG TGTTCGACGG CATCGACATC2220
GACTGGGAAT ACCCGGGCGT GATCGGCCAG CCGTACAACA CCATCGACGC TGCCGACAAG2280
CAGAACTTCA CGCTGCTGCT GGCCGAGTTC CGCCGCCAGC TCGACGCGCT GAACGACGGC2340
CACAAGCTCC TGACCGTGGC CATCGGCTCG GGCAAGGACA AGATCGACCA GACCGAGCCG2400
GCCAAGTACA GCCAGTACCT CGACTGGATC AACGTGATGA CCTACGACTT CCACGGTGGT2460
TGGGAAGCGA CTGGTCCGAC CAACTTCCAG TCGCACCTGT ACCCGGATCC GGCCGATCCG2520
TCGCAAGGCA CCGCGCGGAC CTACAACGTC GACGATGCGA TCAAGAACAT GATCGCCGCC2580
GGTACACCGG CCAAGAAGCT GGTGGTGGGC GTGCCGTTCT ACGGCCGTGG CTGGACCGGT2640
GTCGCCGCAG GTGGCAATAA CGGTCTGTAC CAGGCTGCGA CTGGCCCGGC CCGTGGCACG2700
TACGAAGCCG GCATCGAGGA CTACAAGGTA CTGAAGAACG CCGCCGGTAC CGTGTATGTC2760
CACCCGGTGA CCAAGCAGTC GTACAAGTAC GATGGCACCA ACTGGTGGTC GTACGATACG2820
CCGGCCGTGA TCCAAACCAA GATCGACTAC GTGAAGTCGC AAGGCCTGGG TGGCGTGTTC2880
AGCTGGTCGC TCGATGGCGA CTCCAACGGC GAACTTGCCA AGGTGCTGGG CAACGGCCGC2940
TAA 2943。
一种重组表达载体，含有权利要求2所述编码糖苷水解酶CmChi3基因的核苷酸序列的重组表达载体。
一种重组菌，表达含有权利要求3所述的重组表达载体的菌株。
基于所述的糖苷水解酶 CmChi3基因的克隆表达，包括以下步骤：
步骤1，PCR扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
步骤2，构建重组质粒pCold I- CmChi3
将PCR扩增的DNA序列和pCold I载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4 DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组质粒；pCold I- CmChi3；
步骤3，将重组质粒pCold I- CmChi3导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pCold I- CmChi3的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌；
步骤4，挑选重组菌的单克隆，摇床过夜培养后，将种子液以体积分数1%-5%接种量接入LB培养基中，37℃下培养至菌密度OD600为0.4-0.6时，加入诱导剂诱导12-14h后收集发酵液，再在4℃进行6000-8000g离心，收集菌株；
步骤5，向沉淀中加入缓冲液重悬菌株，在超声裂解后，离心，收集上清后冷冻备用。
作为改进的是，步骤1中PCR扩增所用的引物为：
CmChi3-F：5’-GGGAATTCCATATGACCGAGATCGCCCCGTAC-3’；
CmChi3-R：5’-CCGGAATTCGCGGCCGTTGCCCAGCAC-3’。
上述糖苷水解酶 CmChi3在水解胶体几丁质上的应用，所述胶体几丁质被降解为N-乙酰氨基葡萄糖。
作为改进的是，糖苷水解酶 CmChi3水解胶体几丁质的温度25-55℃、pH 5.0-8.0。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种糖苷水解酶 CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用，具有如下优势：
本发明双功能几丁质酶CmChi3即具有几丁质内切酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGase)两种酶的性质，其能高效降解几丁质并以GlcNAc为最终产物。最适温度50℃，最适pH6.0；50℃以下孵育2h保持80%以上的活力；pH5.0-8.0下能保持较高的活力。本发明几丁质酶CmChi3属于一个新型具有双催化域多功能几丁质酶CmChi3，可以单酶实现几丁质高效转化为单一产物GlcNAc。
附图说明
图1为几丁质酶CmChi3的保守结构域示意图；
图2为几丁质酶CmChi3的SDS-PAGE图，其中，M为蛋白marker从上至下分别是180kDa，130 kDa，95 kDa，70 kDa，53 kDa，40 kDa，33kDa，1为纯化后的条带，2为重组菌株诱导表达后的粗酶条带；
图3为本发明中温度对几丁质酶CmChi3活性的影响；
图4为本发明中pH对几丁质酶CmChi3活性的影响；
图5为几丁质酶CmChi3以胶体几丁质为底物的水解模式示意图。
具体实施方案
下面通过实施例对本发明做进一步的描述，但不用于限制本发明的保护范围，实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
菌种来源
本发明所用菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1由本实验室筛选并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC 3438）和美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC BAA-2140）。
实施例2
几丁质酶CmChi3重组菌株的构建，具体步骤如下：
（1）获取几丁质酶CmChi3的基因，其核苷酸序列如SEN ID NO：1所示。
（2）设计PCR扩增引物：
CmChi3-F：5’-GGGAATTCCATATGACCGAGATCGCCCCGTAC-3’，
CmChi3-R：5’-CCGGAATTCGCGGCCGTTGCCCAGCAC-3’扩增出该基因的全长；
（3）PCR扩增程序：
95℃预热5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存；
（4）PCR扩增后的目的基因CmChi3和质粒Pcold I均使用限制性内切酶NdeI和EcoRI，37℃孵育1h，酶切后目的基因使用普通DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后置于-20℃保存备用，酶切后载体经琼脂糖凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收后置于-20℃保存备用；
（5）胶回收的目的基因片段分别和与之对应的酶切后载体用T4连接酶相连；将连接后的液体转化至E.coli DH5α中，转化步骤：感受态细胞E.coli DH5α从-80℃取出后迅速置于冰上融化；向融化后的感受态细胞中加入连接液，再置于冰上30 min；42℃水浴热激45s，之后迅速置于冰上2~3 min；热激后的液体加入800μL的LB液体培养基，37℃培养1h；培养1 h后的菌液涂布到含0.05 g/L氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上后，在37℃下过夜培养；
（6）利用菌落PCR验证转化平板上的克隆，筛选出阳性克隆。将菌落PCR验证正确的菌落挑取至5mL含有0.05 g/L Amp的液体LB培养基，37℃培养12h后使用质粒提取试剂盒提取质粒，并送至南京擎科生物技术有限公司测序。测序结果与基因进行比对，比对结果正确的质粒即构建成功的重组质粒，同时将构建成功的重组质粒置于-20℃保存备用。
实施例3
重组几丁质酶CmChi3的表达及纯化
（1）保藏的重组表达菌株在平板上复苏后，挑取单菌落接种于5 mL含有0.05 g/LAmp的LB液体培养基中，37℃条件下，200rpm培养8~10 h。将活化后的菌液按体积比1%的接种量转接至装有100 mL LB培养基（0.05g/L Amp）的500 mL锥形瓶中，37℃，200 rpm培养至OD600为0.6~0.8时加入诱导剂IPTG诱导，诱导温度为18℃，诱导时间为16 h。
（2）培养结束后，在温度为4℃条件下，6000 rpm离心10 min，收集菌体。使用超声破碎仪进行破碎后，4℃条件下，8000 rpm离心20 min，收集上清。此上清即为含重组几丁质酶的粗酶液，4℃保存备用。
（3）收集的上清粗酶液利用Ni2+-NTA层析柱与AKTA蛋白纯化系统纯化蛋白，纯化后的重组蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳分析，上层浓缩胶百分比为5%，下层分离胶为8%，电泳结束后使用蛋白染色液对凝胶进行染色，再使用脱色液对其进行3次脱色。获得103kDa的蛋白条带（如图2所示），
酶活单位（U）的定义为：在37℃时，每分钟生成1μmol 还原糖所需的酶量。根据上述酶活力计算方法，酶活力为4.36U/mg(胶体几丁质为底物)。
实施例4
几丁质酶CmChi3酶活性的鉴定
利用4-甲基伞形酮-N-乙酰-D葡萄糖胺可以定性的检测糖苷酶的活性，其在紫外下具有荧光。将所纯化得到的酶与4-甲基伞形酮-N-乙酰-D-葡萄糖胺，以体积比1:10进行反应，在波长450nm处4-甲基伞形酮具有荧光。根据是否在450nm处是否具有荧光可判定其是否具有活性。
实施例5
重组几丁质酶CmChi3的最适反应温度的测定
（1）以1%的胶体几丁质为底物测定重组酶CmChi3的酶活力，步骤如下：取500μL的底物，加入450μL PBS（pH7.0，50mM），预热10 min，再加入50μL适当稀释的酶液，反应30min后，移至沸水浴中煮沸5 min使酶失活，再加入1 mLDNS溶液，100℃煮沸5 min。冷却至室温后，12000rpm离心10 min，取上清测定其在540 nm下的吸光值下测吸光度，以灭活的等量酶液作为空白对照。
酶活单位（U）的定义为：在37℃时，每分钟生成1μmol 还原糖所需的酶量。
（2）蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为0.66g/L。
（3）在反应温度分别为：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55 ℃、60℃时，测定CmChi3的酶反应速率，结果为3次重复取平均值。
（4）结果如图3所示，反应温度为50℃时酶活力最高，以最高酶反应速率计为100％，计算其余酶活力作图。
实施例6
重组几丁质酶CmChi3的温度稳定性的测定
(1)将CmChi3的蛋白液分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下孵育2h。
(2)以1%的胶体几丁质为底物测定重组酶CmChi3的酶活力。取500μL的底物，加入450μL PBS（pH 7.0，50 mM），预热10 min，再加入50μL适当稀释的酶液，反应30 min后，移至沸水浴中煮沸5 min使酶失活，再加入1 mL DNS溶液，100℃煮沸5 min。冷却至室温后，12000rpm离心10min，取上清测定其在540 nm下的吸光值下测吸光度，以灭活的等量酶液作为空白对照。酶活单位（U）的定义为：在37℃时，每分钟生成1μmol 还原糖所需的酶量。
(3)蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为0.66g/L。
(4)将不进行孵育的CmChi3蛋白液的酶活力计为100％，计算各个温度预处理的相对酶活(％)，结果如图3所示。
(5)结果表明：CmChi3在处理2小时后，25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55 ℃、60℃分别为未预处理的酶反应速率的100％、98％、95.4％、91.55％、
85.7％、53.6％、20.9％、18.4％。温度大于等于45℃时稳定性急剧下降。
实施例7
重组几丁质酶CmChi3的最适pH的测定
(1) 以1%的胶体几丁质为底物测定重组酶CmChi3的酶活力。取100μL的底物，加入850μL不同pH值缓冲液：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5~6.0)，磷酸盐缓冲液（pH 6.0~8.0），Tis-HCl（pH 8.0~9.0），甘氨酸-氢氧化钠（pH 9.0~10.0）中。预热10 min，再加入50 μL适当稀释的酶液，反应30 min后，移至沸水浴中煮沸5 min使酶失活，再加入1mL DNS溶液，100℃煮沸5 min。冷却至室温后，12000rpm离心10 min，取上清测定其在540 nm下的吸光值下测吸光度，以灭活的等量酶液作为空白对照。
(2) 酶活单位（U）的定义为：在37℃时，每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量。
(3)蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为0.66g/L。
(4)pH为6.0时酶活力最高，将最高酶反应速率计为100％，其他pH下的反应速率除以最高反应速率得到相对应的相对反应速率，结果如图4所示。
(5)结果表明CmChi3作为糖苷水解酶的最适pH为6.0，在pH＝5.5～8.0范围内活性较高。
实施例8
重组几丁质酶CmChi3的pH稳定性测试
(1)将CmChi3蛋白液与不同pH的缓冲液按照等体积混合，25℃孵育2小时；当所用缓冲液分别为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5-6.0)，磷酸盐缓冲液（pH 6.0-8.0），Tis-HCl（pH 8.0-9.0），甘氨酸-氢氧化钠（pH 9.0-10.0）。
(2)将上述预处理后的蛋白液，以1%的胶体几丁质为底物测定重组酶CmChi3的酶活力。取100μL的底物，加入850μL不同pH值缓冲液，在37℃，pH6.0，以相同的加酶量50μL反应时间30min，移至沸水浴中煮沸5 min使酶失活，再加入1 mL DNS溶液，100℃煮沸5 min。冷却至室温后，12000 rpm离心10 min，取上清测定其在540 nm下的吸光值下测吸光度，以灭活的等量酶液作为空白对照。
(3) 酶活单位（U）的定义为：在37℃时，每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量。
(4)蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为0.66g/L；
(5)结果如图4所示，CmChi3蛋白液保存于pH为5.0、6.0、7.0、8.0时相对活力(计算方法同实施例6)依次为：67.5％、96.7％、96.3％、95.5％；
(6)结果表明CmChi3蛋白液在pH5.0-8.0范围内较稳定，说明其在中性条件下具有较好的pH稳定性。
实施例9
重组几丁质酶CmChi3的水解模式的测定
(1)将购买的的几丁寡糖(GlcNAc) 2-6 （青岛博智汇力生物技术有限公司）标准品配制成10g/L的水溶液；
(2)使用1%的胶体几丁质为底物，通过高效液相色谱(HPLC)，采用 ALLTECH的Prevail Carbohydrate ES 5u色谱柱分析结果；
(3)流动相成分为乙腈和甲醇，梯度洗脱条件为：0min，75％乙腈，7min，75％乙腈；8min，65％乙腈；15min，65％乙腈；16min，75％乙腈；22min，75％乙腈。柱温箱温度为 40℃，流速为1mL/min。
(4)结果如图5所示，酶CmChi3在最开始的时间内将胶体几丁质切割成单糖，二糖和三糖，展现出内切酶的活性，随着切割时间的增加，产物中单糖的含量逐渐变高，到最后产物中只存在单糖，展现出糖苷酶的活性。因此，本发明的酶具有两种不同的几丁质酶活，分别为内切酶活性和糖苷酶活性，它能将几丁质专一水解为N-乙酰氨基葡萄糖。
以上所述的
具体实施方式
，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggaattcca tatgaccgag atcgccccgt ac 32
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggaattcg cggccgttgc ccagcac 27
<210> 3
<211> 2943
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttgaagc aaacccgggc gccttacggc gccaagccgg cttttgcgct gaaaacgctg 60
agcgcggccc tgctgctggc atcgagcgtt gccagcgcca ccgagatcgc cccgtacttc 120
gagatgtggt acggcggcgc gagcggctat cccgccccca ccctcgcttc ggcccagcag 180
cagctcggcc tcaagagcgt gacactggcg ttcaccatcg ccagcaatgg ccagtgcaag 240
atctccaatg acggcggtgg caacgatctg ctgaatggcg cgatgaaggg cgatatcgcc 300
agcttccgcc aagccggtgg tcgcgtgatc atgtcgttcg gcggcgccgc tggtacctat 360
atcgaggcgg tgtgttcggt cgaccagatg gtcagcctga tcgagggcat gatcctcaac 420
cacggcatcc gcgcgctgga cttcgacgtc gagggcggcc agctttccaa cacccagctc 480
aacaacaccc gcaatgccgc actgaaggca ctgcaggcca agtatccgga tctgtatgtg 540
tcgttcacgc tgccggtgct gccgagcggc ctgaccagcc cgggcgtggc cgtggtgcgt 600
tccgctgcgc aagctggcgt gcgcgttgac ctcgtcaacg tgatggcgat ggattacggc 660
tccagcatct ccagcggcaa gaagatgggc gacctcgctg tccaggccgc gcaatcgctg 720
ttcaaccaga tcaagccgat cttcccgacc aagaccgatg ccgaattgtg gtccatggtc 780
ggcgtgacgc cgatgattgg ccagaacgac gtgcagggtg aagtcttcac cctggccgat 840
gcgcagacgc tgaccgactt cgccaagcag aagggccttg gcctgatcgc ctggtggtcg 900
ttccagcgcg accgcactgg tacgggcagc tacggcgaat acagccaagt caataaggcc 960
aacttcgact tctacaacat cttcaaggct gccggcacgc cgggcagctc gccgacgccg 1020
tcgccggtga cccctacccc ggtcaccccg gtaccggtga ccccagcgcc tgtgacgccg 1080
accccggtgg ccggccagta tccggaatgg agcgcgagcg gcgtctacac cggtggccag 1140
cgcgtgacct atcaaggtgc cgtgtacgaa gccaagtggt ggacccaggg cgacaacccg 1200
ggccaatccg gcgaatgggg cgtatggaag aaggttggcg gcgcgccgtc cccggtgacc 1260
ccggctcccg tgacacccgc tccggtcacc ccggctccgg tcacacctgc cccggtgact 1320
ccggccccgg tgactccggc ccctgtgacg cccgttccgg tcaccccggc gccgtccggc 1380
tgctatgcgg cctgggctga aggcaagacc tacgccgccg gcacccaggt cacctacaac 1440
aaccgcaatt accaggcgct ggtggcgcac accgcctacg ccggtactgg ctggaaccct 1500
gccgcgagcc cgacgctgtg gaaggacatt ggcgcctgca gcggctcgcc gagcccggtc 1560
accccggcgc cggtgacacc cgctcccgta acgcctgcgc cggtcactcc ggcccctgtc 1620
accccggttc cggtcacccc ggctcccgtg acgcccgctc cggtcacccc ggtcccggcc 1680
ggtgatcgcg tcgtcggctc ctacttcacc cagtggggcg tgtacggccg tggctacgaa 1740
gtggccgatg tggtcagcag cggcagcgcg tcgcagctca ccttcatcaa ctacgccttc 1800
ggcaatatct accagaagaa tggcggctac gagtgcgcgg ccggcatcga caagctggaa 1860
tcgggcgcga ccaacccgag cgatccgtcc gccggcaccg gtggtgacgc ctgggccgac 1920
tacggccgca caccgggccg cctggtcgat ccgagcaagc cctacacctg ggaatcgccg 1980
ctggccggta acttcggcga gctgaagaac ctgaaggcca agtatcctca gctcaaggtg 2040
ctgatctcgc tgggcggctg gacttggtcg aagtggttct cggcagccag caagaccgac 2100
gcactgagga agcagttggt gagctcgtgc gtggacgtgt tcatcaaggg caacctgccg 2160
agctacagcg gtcgcggtgg tcctggttcg gccaagggcg tgttcgacgg catcgacatc 2220
gactgggaat acccgggcgt gatcggccag ccgtacaaca ccatcgacgc tgccgacaag 2280
cagaacttca cgctgctgct ggccgagttc cgccgccagc tcgacgcgct gaacgacggc 2340
cacaagctcc tgaccgtggc catcggctcg ggcaaggaca agatcgacca gaccgagccg 2400
gccaagtaca gccagtacct cgactggatc aacgtgatga cctacgactt ccacggtggt 2460
tgggaagcga ctggtccgac caacttccag tcgcacctgt acccggatcc ggccgatccg 2520
tcgcaaggca ccgcgcggac ctacaacgtc gacgatgcga tcaagaacat gatcgccgcc 2580
ggtacaccgg ccaagaagct ggtggtgggc gtgccgttct acggccgtgg ctggaccggt 2640
gtcgccgcag gtggcaataa cggtctgtac caggctgcga ctggcccggc ccgtggcacg 2700
tacgaagccg gcatcgagga ctacaaggta ctgaagaacg ccgccggtac cgtgtatgtc 2760
cacccggtga ccaagcagtc gtacaagtac gatggcacca actggtggtc gtacgatacg 2820
ccggccgtga tccaaaccaa gatcgactac gtgaagtcgc aaggcctggg tggcgtgttc 2880
agctggtcgc tcgatggcga ctccaacggc gaacttgcca aggtgctggg caacggccgc 2940
taa 2943
<210> 4
<211> 980
<212> PRT
<213> 氨基酸(Amino acid )
<400> 4
Met Leu Lys Gln Thr Arg Ala Pro Tyr Gly Ala Lys Pro Ala Phe Ala
1 5 10 15
Leu Lys Thr Leu Ser Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ser Ser Val Ala Ser
20 25 30
Ala Thr Glu Ile Ala Pro Tyr Phe Glu Met Trp Tyr Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Pro Ala Pro Thr Leu Ala Ser Ala Gln Gln Gln Leu Gly Leu
50 55 60
Lys Ser Val Thr Leu Ala Phe Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gln Cys Lys
65 70 75 80
Ile Ser Asn Asp Gly Gly Gly Asn Asp Leu Leu Asn Gly Ala Met Lys
85 90 95
Gly Asp Ile Ala Ser Phe Arg Gln Ala Gly Gly Arg Val Ile Met Ser
100 105 110
Phe Gly Gly Ala Ala Gly Thr Tyr Ile Glu Ala Val Cys Ser Val Asp
115 120 125
Gln Met Val Ser Leu Ile Glu Gly Met Ile Leu Asn His Gly Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Asp Phe Asp Val Glu Gly Gly Gln Leu Ser Asn Thr Gln Leu
145 150 155 160
Asn Asn Thr Arg Asn Ala Ala Leu Lys Ala Leu Gln Ala Lys Tyr Pro
165 170 175
Asp Leu Tyr Val Ser Phe Thr Leu Pro Val Leu Pro Ser Gly Leu Thr
180 185 190
Ser Pro Gly Val Ala Val Val Arg Ser Ala Ala Gln Ala Gly Val Arg
195 200 205
Val Asp Leu Val Asn Val Met Ala Met Asp Tyr Gly Ser Ser Ile Ser
210 215 220
Ser Gly Lys Lys Met Gly Asp Leu Ala Val Gln Ala Ala Gln Ser Leu
225 230 235 240
Phe Asn Gln Ile Lys Pro Ile Phe Pro Thr Lys Thr Asp Ala Glu Leu
245 250 255
Trp Ser Met Val Gly Val Thr Pro Met Ile Gly Gln Asn Asp Val Gln
260 265 270
Gly Glu Val Phe Thr Leu Ala Asp Ala Gln Thr Leu Thr Asp Phe Ala
275 280 285
Lys Gln Lys Gly Leu Gly Leu Ile Ala Trp Trp Ser Phe Gln Arg Asp
290 295 300
Arg Thr Gly Thr Gly Ser Tyr Gly Glu Tyr Ser Gln Val Asn Lys Ala
305 310 315 320
Asn Phe Asp Phe Tyr Asn Ile Phe Lys Ala Ala Gly Thr Pro Gly Ser
325 330 335
Ser Pro Thr Pro Ser Pro Val Thr Pro Thr Pro Val Thr Pro Val Pro
340 345 350
Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Thr Pro Val Ala Gly Gln Tyr Pro
355 360 365
Glu Trp Ser Ala Ser Gly Val Tyr Thr Gly Gly Gln Arg Val Thr Tyr
370 375 380
Gln Gly Ala Val Tyr Glu Ala Lys Trp Trp Thr Gln Gly Asp Asn Pro
385 390 395 400
Gly Gln Ser Gly Glu Trp Gly Val Trp Lys Lys Val Gly Gly Ala Pro
405 410 415
Ser Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala
420 425 430
Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala Pro
435 440 445
Val Thr Pro Val Pro Val Thr Pro Ala Pro Ser Gly Cys Tyr Ala Ala
450 455 460
Trp Ala Glu Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Gly Thr Gln Val Thr Tyr Asn
465 470 475 480
Asn Arg Asn Tyr Gln Ala Leu Val Ala His Thr Ala Tyr Ala Gly Thr
485 490 495
Gly Trp Asn Pro Ala Ala Ser Pro Thr Leu Trp Lys Asp Ile Gly Ala
500 505 510
Cys Ser Gly Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala
515 520 525
Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Val Pro
530 535 540
Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Ala Pro Val Thr Pro Val Pro Ala
545 550 555 560
Gly Asp Arg Val Val Gly Ser Tyr Phe Thr Gln Trp Gly Val Tyr Gly
565 570 575
Arg Gly Tyr Glu Val Ala Asp Val Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Gln
580 585 590
Leu Thr Phe Ile Asn Tyr Ala Phe Gly Asn Ile Tyr Gln Lys Asn Gly
595 600 605
Gly Tyr Glu Cys Ala Ala Gly Ile Asp Lys Leu Glu Ser Gly Ala Thr
610 615 620
Asn Pro Ser Asp Pro Ser Ala Gly Thr Gly Gly Asp Ala Trp Ala Asp
625 630 635 640
Tyr Gly Arg Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Pro Ser Lys Pro Tyr Thr
645 650 655
Trp Glu Ser Pro Leu Ala Gly Asn Phe Gly Glu Leu Lys Asn Leu Lys
660 665 670
Ala Lys Tyr Pro Gln Leu Lys Val Leu Ile Ser Leu Gly Gly Trp Thr
675 680 685
Trp Ser Lys Trp Phe Ser Ala Ala Ser Lys Thr Asp Ala Leu Arg Lys
690 695 700
Gln Leu Val Ser Ser Cys Val Asp Val Phe Ile Lys Gly Asn Leu Pro
705 710 715 720
Ser Tyr Ser Gly Arg Gly Gly Pro Gly Ser Ala Lys Gly Val Phe Asp
725 730 735
Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Val Ile Gly Gln Pro Tyr
740 745 750
Asn Thr Ile Asp Ala Ala Asp Lys Gln Asn Phe Thr Leu Leu Leu Ala
755 760 765
Glu Phe Arg Arg Gln Leu Asp Ala Leu Asn Asp Gly His Lys Leu Leu
770 775 780
Thr Val Ala Ile Gly Ser Gly Lys Asp Lys Ile Asp Gln Thr Glu Pro
785 790 795 800
Ala Lys Tyr Ser Gln Tyr Leu Asp Trp Ile Asn Val Met Thr Tyr Asp
805 810 815
Phe His Gly Gly Trp Glu Ala Thr Gly Pro Thr Asn Phe Gln Ser His
820 825 830
Leu Tyr Pro Asp Pro Ala Asp Pro Ser Gln Gly Thr Ala Arg Thr Tyr
835 840 845
Asn Val Asp Asp Ala Ile Lys Asn Met Ile Ala Ala Gly Thr Pro Ala
850 855 860
Lys Lys Leu Val Val Gly Val Pro Phe Tyr Gly Arg Gly Trp Thr Gly
865 870 875 880
Val Ala Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Tyr Gln Ala Ala Thr Gly Pro
885 890 895
Ala Arg Gly Thr Tyr Glu Ala Gly Ile Glu Asp Tyr Lys Val Leu Lys
900 905 910
Asn Ala Ala Gly Thr Val Tyr Val His Pro Val Thr Lys Gln Ser Tyr
915 920 925
Lys Tyr Asp Gly Thr Asn Trp Trp Ser Tyr Asp Thr Pro Ala Val Ile
930 935 940
Gln Thr Lys Ile Asp Tyr Val Lys Ser Gln Gly Leu Gly Gly Val Phe
945 950 955 960
Ser Trp Ser Leu Asp Gly Asp Ser Asn Gly Glu Leu Ala Lys Val Leu
965 970 975
Gly Asn Gly Arg
980