具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

一种核糖核酸酶非疾病诊断与治疗目的的检测方法，在待测核糖核酸酶和RNA酶抑制剂存在的条件下，在逆转录扩增体系中对RNA模板进行逆转录扩增，根据待测核糖核酸酶逆转录扩增Ct值确定待测核糖核酸酶的浓度。

本发明提供的核糖核酸酶非疾病诊断与治疗目的的检测方法，通过对RNA模板的定量实现待测核糖核酸酶的浓度检测。由于核糖核酸酶可以快速降解RNA，为了实现精准检测，发明人利用核糖核酸酶能够与RNA酶抑制剂形成1:1复合体的原理，在检测过程中对核糖核酸酶的活性进行部分抑制，延缓核糖核酸酶作用于RNA底物的速度，使之能够精确地检测核糖核酸酶的浓度，排除无活性酶被定量检测出来，避免假阳性和假阴性的出现。该检测方法可以实现检测核糖核酸酶的模块化，即只需要将待测核糖核酸酶放入检测体系中，即可实现检测。

该检测方法具有如下优势：(1)可实现高通量检测，可对较多量的样本进行检测，反应体积小，检测速度快(通常为1小时)，适宜实验室的常规质控；(2)可实现实时观测；(3)无放射性污染，安全性高；(4)广谱性强，可检测不同样本中，不同种类核糖核酸酶的残留活性；(5)可定量酶的含量或相对含量，可以以一个已知浓度的酶的含量水平标定未知样本的酶含量，也可以实现对不同样本中的核糖核酸酶的活性作出比较。

本领域技术人员公知的是核糖核酸酶作用于单链RNA时效率很快，例如，RNaseA，1μg RNA只需1ng RNaseA，在30min左右能全部消化完。为了延缓核糖核酸酶作用底物速度，本发明在检测体系中引入RNA酶抑制剂，能够排除无活性酶被定量出来，并且更好的控制酶反应速度，从而实现准确定量。可以理解的是，RNA酶抑制剂在逆转录扩增体系中的含量是可以按照实际需要调整的，只要能够实现逆转录反应的合理检测，反应出核糖核酸酶浓度就可以。

在优选地实施方式中，RNA模板中含有目的基因，逆转录扩增体系中包括检测目的基因的检测引物和检测探针。需要说明的是，本发明对检测引物和检测探针并没有特殊的限定，只要能够实现RNA模板中目的基因的逆转录扩增检测即可。

在优选地实施方式中，目的基因包括保守序列，优选为内参基因，进一步优选为GAPDH、β-Actin、β-tubulin、18sRNA、28sRNA、SDHA或HPRT1。需要说明的是，本发明中将目的基因优选为含有保守序列的模板，避免了现有技术中核糖核酸酶检测中需要设计特定底物的繁琐操作，降低了成本。此外，可以理解的是，RNA模板中包括目的基因即可，也就是说还可以含有其他物质，只要能够实现目的基因的特异性扩增即可，例如本发明实施例中给出的RNA模板为提取的哺乳动物细胞的总RNA。

在优选地实施方式中，目的基因为GAPDH。可以理解的是，检测模板中含有GAPDH基因的单链mRNA即可，也就是说，检测模板可以为纯GAPDH基因的单链mRNA，也可以含有其他物质，例如本发明实施例中给出的RNA模板为提取的哺乳动物细胞的总RNA。

在优选地实施方式中，GAPDH的检测引物和检测探针包括：

上游检测引物：5’-TGGAGAAACCTGCCAAGTATGATA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游检测引物：5’-CAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

检测探针：5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3’(SEQ ID NO.3)。

在优选地实施方式中，逆转录扩增体系中包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。逆转录酶可以为AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶等；DNA聚合酶可以为Hotstart DNApolymerase、Anstart DNA polymerase等；缓冲液可以为Tris-HCl等。

在优选地实施方式中，逆转录扩增体系中还包括镁离子、铵离子、钾离子和表面活性剂中的至少一种。逆转录扩增体系中例如可以但不限为包括镁离子，铵离子，钾离子和表面活性剂，镁离子和铵离子，或者，镁离子、铵离子、钾离子和表面活性剂等等；镁离子可以为MgSO₄、MgCl₂等，铵离子可以为(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl等，钾离子可以为KCl、K₂SO₄等，表面活性剂可以为tween-20等。

在优选地实施方式中，核糖核酸酶包括RNase A、RNase B或RNase C。

在优选地实施方式中，检测方法还包括制备标准曲线的步骤，将待测核糖核酸酶逆转录扩增Ct值与标准曲线比对，得到待测核糖核酸酶的浓度，其中，标准曲线包括核糖核酸酶标准品浓度与核糖核酸酶标准品逆转录扩增Ct值的对应关系，核糖核酸酶标准品逆转录扩增Ct值由逆转录扩增体系对RNA模板进行逆转录扩增检测得到。可以理解的是，可以利用已知浓度核糖核酸酶标准品制备标准曲线的方式，实现待测核糖核酸酶的准确定量检测，例如：利用合适量的RNA酶抑制剂，对不同梯度的已知浓度的核糖核酸酶标准品实现不完全抑制，在一定浓度的RNA模板下，核糖核酸酶对RNA呈现梯度降解，利用逆转录一步法实时荧光定量PCR进行检测，可实时监测剩余RNA模板的浓度，由底物浓度(即Ct值)与核糖核酸酶标准品浓度能够作出标曲，定量未知浓度的样品的浓度，可以理解的是，为了结果的准确，标准曲线的PCR反应液样本与待测核糖核酸酶检测的PCR反应液样本，以及二者的检测程序均应该是相同的。也就是说，本发明的检测方法可以实现：当标准曲线已知时，利用相同的逆转录反应体系，即可实现待测核糖核酸酶的模块化检测。

一种核糖核酸酶检测试剂盒，试剂盒包括RNA酶抑制剂。由于含有上述检测方法中的RNA酶抑制剂，实际检测采用本发明提供的检测方法，所以具有上述检测方法的优势，同时成本低，可以批量生产，应用场景广。

在优选地实施方式中，试剂盒还包括逆转录酶和DNA聚合酶；优选地，还包括dNTPs和缓冲液；进一步优选地，试剂盒还包括镁离子、铵离子、钾离子和表面活性剂中的至少一种；更进一步优选地，试剂盒还包括检测RNA模板的检测引物和检测探针。

在优选地实施方式中，试剂盒中的检测引物和检测探针为GAPDH的检测引物和检测探针，具体为：

上游检测引物：5’-TGGAGAAACCTGCCAAGTATGATA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游检测引物：5’-CAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

检测探针：5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3’(SEQ ID NO.3)；

在优选地实施方式中，试剂盒还包括核糖核酸酶标准品。

本发明提供上述检测方法或试剂盒在如下a)或b)中的应用：

a)非疾病诊断与治疗目的检测待测核糖核酸酶含量或相对含量；

b)非疾病诊断与治疗目的比较两个或多个待测核糖核酸酶样本的含量或相对含量。

本发明提供的检测方法或试剂盒例如可以但不限于如下的应用：定性检测目标样本中是否含有核糖核酸酶；通过制备标准曲线的形式间接定量核糖核酸酶含量；比较两个或两个以上样本之间核糖核酸酶含量的多少，等等。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1逆转录引物设计

选择一段保守序列RNA，具体为小鼠GAPDH基因的mRNA序列，设计检测引物：

检测上游引物：5’-TGGAGAAACCTGCCAAGTATGATA-3’(SEQ ID NO.1)；

检测下游引物：5’-CAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

检测探针：5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3’(SEQ ID NO.3)。

实施例2一种核糖核酸酶检测试剂盒

试剂盒包括如下组分，以50μl的PCR反应液样本为例：

(1)RNA酶抑制剂的终浓度使用量为17U；

(2)60mM Tris-HCl(pH8.2)，50mM KCl，12.5mM(NH₄)₂SO₄，3.3mM MgSO₄，0.01w/v％tween-20，终浓度为3U的Hostart Taq酶，80U的MMLV逆转录酶；

以及(3)实施例1中的检测引物：10μM上游检测引物，10μM下游检测引物和5μMTaqman检测探针。

实施例3标准曲线的制备

将商品化的RNase A用RNase A稀释液进行浓度梯度稀释，依次向实施例2中的PCR反应液样本里加入终浓度为30ng/μl、32ng/μl、35ng/μl、40ng/μl的RNaseA标准品，再加入单链RNA模板(提取的小鼠细胞总RNA)终浓度100ng，室温孵育5min，上荧光定量PCR仪进行逆转录一步法扩增检测。

反应程序为50℃，15min；95℃，10min；(94℃，15s；55℃，40s)×45。

通过实时荧光定量PCR仪监测，得到RNase A标准品各浓度的Ct值，根据已知浓度的RNase A标准品的扩增Ct值和浓度值(ng级)，以Ct值为横坐标，RNaseA浓度值为纵坐标制作线性标准曲线，RNase A标准品扩增曲线如图1所示，制备得到的标准曲线如图2所示。

实施例4待测核糖核酸酶的检测

待测样品1和待测样品2为基因工程重组RNaseA酶，均纯化自重组大肠杆菌，该菌株携带有来自牛胰腺的RNaseA基因。

将待测样品1和待测样品2分别采用实施例2中的试剂盒进行检测，检测的条件与实施例3中标准品的检测相同，将得到的待测样品1和待测样本2的Ct值分别代入标准曲线中，计算出RNaseA酶浓度值分别为待测样品1为28.86ng/μl，待测样品2为38.70ng/μl。待测样品1和待测样品2的扩增曲线如图3所示。

对比例无RNA酶抑制剂的检测

以30ng/μl的RNaseA标准品为例，参照实施例2中的试剂盒，但是PCR反应液样本中不含有RNA酶抑制剂，加入单链RNA模板终浓度100ng，反应程序为50℃，15min；95℃，10min；(94℃，15s；55℃，40s)×45，进行反应检测。

扩增结果如图4所示，可见，当体系中没有RNA酶抑制剂的加入时，30ng/μl的RNaseA标准品可以将100ng的RNA模板很快内切完，作用所需时间很短，而通常荧光定量PCR反应时间为1小时，如果不加RNA酶抑制剂，无法实现采用逆转录检测的方式对核糖核酸酶进行检测，想要准确标定出RNaseA的活性较难。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 菲鹏生物股份有限公司

广东菲鹏生物有限公司

<120> 核糖核酸酶的检测方法与试剂盒及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

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atcaagaagg tggtgaagca ggcat 25