一种新型N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测试剂
阅读说明：本技术 一种新型N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测试剂 (Novel N-acetyl-beta-D glucosaminidase detection reagent ) 是由 谢清华 刘云海 胡晓飞 李久恩 董雯 于 2020-11-09 设计创作，主要内容包括：一种用于检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的试剂,所述检测试剂由R1和R2组成。所述试剂R1为：缓冲液,VRA-NAG,BSA,氯化镁,EDTA·2Na,Trixon-X100,SDS,亚硫酸钠,聚乙二醇6000,乙二醇,葡萄糖,β环糊精,冠18醚,防腐剂；试剂R2中含有缓冲液,吐温20,尿素,BSA,防腐剂。本发明首次使用镁离子作为底物螯合剂,镁离子与具有环状结构的VRA-NAG螯和形成六原子环的螯合物,增强了试剂的稳定性。(A reagent for detecting N-acetyl- β -D glucosaminidase, the detection reagent consisting of R1 and R2. The reagent R1 is: buffer solution, VRA-NAG, BSA, magnesium chloride, EDTA-2 Na, Trixon-X100, SDS, sodium sulfite, polyethylene glycol 6000, ethylene glycol, glucose, beta cyclodextrin, crown 18 ether and preservative; the reagent R2 contains buffer solution, Tween 20, urea, BSA and preservative. The invention uses magnesium ions as substrate chelating agent for the first time, and the magnesium ions are chelated with VRA-NAG with a ring structure to form a chelate of a hexaatomic ring, thereby enhancing the stability of the reagent.)
技术领域
本发明涉及一种新型N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测试剂。
背景技术
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase，NAG)，又称尿酶，是分子量为140kD的一种存在于细胞溶酶体内的酸性水解酶，在人体内主要存在于肾的近曲小管上皮细胞中。研究表明，NAG对肾小管损伤的反应非常灵敏，比其他尿中低分子蛋白更迅速、直接地反应肾小管活动性损伤的程度和病情变化，但在健康人尿中含量甚微。此外，用尿作标本，又是一种无创伤性检查，符合当代医学检验方法的潮流，适合于日常检验和连续动态分析。由此可见，通过测定尿中NAG的活性，对糖尿病，各种肾实质疾患，药物及重金属肾中毒，尿路感染(肾盂肾炎)，移植肾排斥反应，高血压及自身免疫性疾病等原因造成的肾小管损伤早期检测具有重要的临床应用价值。
目前，NAG活性检测方法有放免分析法、荧光分析法和可见分光光度法等。其中放免分析法和荧光分析法所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不适用于临床大流量的自动化分析；而在已报道的分光光度法中，均存在底物溶解性差或试剂稳定性欠佳等问题，难以满足临床检验要求。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种稳定性好、灵敏度高、无需复溶直接使用的检测试剂及检测方法。
一种N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，所述检测试剂是由试剂R1和试剂R2两个试剂组成，
所述试剂R1包括以下浓度的组分:
所述试剂R2包括以下浓度的组分：
作为优选，所述底物为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷(VRA-NAG)。
进一步的，所述的BSA是牛血清白蛋白，SDS是十二烷基硫酸钠，EDTA·2Na是乙二胺四乙酸二钠。
作为优选，所述防腐剂为叠氮钠、NaN3、对羟基苯甲酸甲酯中的一种。
进一步的，所述的尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其中R1缓冲液为15～30℃，pH为4.0～6.0的柠檬酸缓冲液。
进一步的，所述的尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其试剂R2中缓冲液为15～30℃，pH为11.0～12.0的碳酸盐缓冲液。
进一步的，所述的尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测试剂来检测尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测方法，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为505nm。
进一步的，试剂R1和试剂R2的比例为3:1。
本发明的基本原理如下：
尿液中的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶在酸性环境下将试剂中的5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷(VRA-NAG)催化水解为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵(VRA)，接着VRA在强碱性环境下变构产生荧光，溶液呈现紫红色，并在505nm的波长处有吸收峰，通过检测505nm波长处吸光度的变化可以确定N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的活性。
注：VRA-NAG：5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷，分子量545。
NAG：N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶
VRA：5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵
本发明的有益效果：
1)采用新的5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷(VRA-NAG)为反应底物，既解决了试剂色原干扰大的问题又显著增强了底物的溶解性和试剂准确度；
2)本发明首次使用镁离子作为底物螯合剂，镁离子与具有环状结构的VRA-NAG螯和形成六原子环的螯合物，增强了试剂的稳定性；
3)试剂的准确度和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便，符合临床批量检测需求。
附图说明
图1为本发明的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测试剂中实施例1的相关性曲线图；
图2为本发明的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测试剂中实施例2的相关性曲线图；
图3为本发明的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测试剂中实施例3的相关性曲线图；
图4为本发明的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测试剂中实施例1-3与对比例的有效期稳定性曲线图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。
实施例1：
本实施例的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的检测试剂，包含试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1的成分和含量如下：
试剂R2的成分和含量如下：
本检测试剂的使用方法：
本实施例描述的尿液N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂，应使用具有双试剂功能的全自动生化分析仪进行检测，如日立7180全自动分析仪、日立7080全自动分析仪以及迈瑞800等，利用终点法进行测定，设定检测主波长为505nm。将检测试剂R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘放置好双蒸水、校准品、质控品和待测样本，操作如表1：
表1实施例1试剂检测方法
计算公式：尿液N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶浓度(U/L)＝(样本ΔA÷校准品ΔA)×校准品浓度。
实施例2：
本实施例的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的检测试剂，包含试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1的成分和含量如下：
试剂R2的成分和含量如下：
使用方法与检测方法同实施例1。
实施例3：
本实施例的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的检测试剂，包含试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1的成分和含量如下：
试剂R2的成分和含量如下：
使用方法与检测方法同实施例1。
实施例4：
干扰性实验：取新鲜混合尿液，分成2等份，然后将每等份再分成6等份，加入不同的干扰物质，使其浓度在尿液中达到表2的要求。然后分别用实施例所得试剂，与市场常见并认可的尿液N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂作为对照组同时对比测定尿液中NAG的含量，对照试剂组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。
相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100％。
表2实施例试剂抗干扰性能比较
由表2可以看出，实施例1-3的检测试剂在葡萄糖≤20mmol/L、胆红素≤40mg/dL、血红蛋白≤200mg/dL、甘油三酯≤500mg/dL以及抗坏血酸≤50mg/dL时对测试结果没有明显干扰。而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明通过采用新型底物5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)]-饶丹宁-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷(VRA-NAG)为反应底物，并使用镁离子作为底物螯合剂，可以有效加强检测试剂的抗干扰能力，避免如葡萄糖、胆红素和抗坏血酸等干扰，实施例组的试剂抗干扰性能显著提高，远远优于对照试剂。
实施例5：
相关性实验：利用实施例所述试剂配方配制检测试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂盒进行对照检测，各实施例组分别检测了40个临床尿液样本，检测结果如表3所示。并获得各实施例与对照组的相关性曲线(如图1所示)，通过检测结果显示，实施例1与对照组的相关系数为0.9979，实施例2与对照组的相关系数为0.9949，实施例3与对照组的相关系数为0.9962，各实施例组试剂与对照组试剂40个样本的相对偏差均≤10％，说明了实施例1-3组与对照组有极大的相关性。
表3实施例试剂与市场常见并得到认可的尿液N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂盒对比检测结果
实施例6：
试剂的稳定性对比试验：对实施例1-3中的试剂，每组实施例分别均匀分装13组，每组的装量：试剂R1为18mL，试剂R2为6mL；并且取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂盒作对照。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测NAG质控品(靶值为25.8μmol/L)，检测结果如图2所示，实施例1-3试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂盒更加稳定。
通过验证，本试剂与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，并且抗干扰性能好，是一种更加稳定、良好的N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂。