注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用
阅读说明：本技术 注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用 (Application of salvianolate for injection in preparing antiviral drug ) 是由 刘叔文 杨婵 潘晓彦 许鑫锋 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用。本发明首次提出注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用,提供存在慢性基础疾病的新冠感染者新的治疗手段,该应用扩大了注射用丹参多酚酸盐的临床使用范围,且为病毒抑制,特别是在全球SARS-CoV-2流行的情况下,为治疗新冠病毒感染所致肺炎(COVID-19)提供新的药物。(The invention discloses an application of salvianolate for injection in preparing antiviral drugs. The invention firstly provides the application of the salvianolate for injection in preparing antiviral drugs, provides a new treatment means for new coronary infectors with chronic basic diseases, expands the clinical application range of the salvianolate for injection, and provides a new drug for virus inhibition, particularly for treating pneumonia (COVID-19) caused by new coronary virus infection under the condition of global SARS-CoV-2 epidemic.)
技术领域
本发明属于药学技术领域，具体涉及一种注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用。
背景技术
由SARS-CoV-2感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)因其极强传播率和超长的潜伏期，已经成为目前感染范围最广、防控难度最大的全球首要公共卫生威胁。SARS-CoV-2属于冠状病毒的β属，是一种线性单链RNA病毒(ssRNA)。其基因组序列全长约30kb，共包含10个基因。分别是：ORF1ab、ORF1ab、S、ORF3a、E、M、ORF6、ORF7a、ORF8、N、ORF10。SARS-CoV-2进入宿主细胞由跨膜刺突S糖蛋白(Spike protein，S)介导，其以三聚体的形式存在，每个单体由一个S1和一个S2亚基组成，S蛋白在宿主细胞蛋白酶的作用下裂解成S1和S2，其中S1与宿主细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合介导病毒的进入，S2亚基负责病毒和细胞膜融合。因此，S蛋白抑制剂可以阻止病毒进入宿主细胞，S1和S2亚基可作为抗病毒药物筛选的靶点。目前没有针对SARS-CoV-2的特效药，且无批准上市药物。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是长期应用于临床的活血化淤传统中药，其水溶性提取成分“注射用丹参多酚酸盐”于2005年5月取得了原料及制剂的新药证书，是中国科学院上海药物研究所历经13年研究开发出的中药二类新药，由上海绿谷制药有限公司生产。产品于2006年投产上市，功能主治冠心病稳定型心绞痛，分级为I、Ⅱ级，心绞痛症状表现为轻、中度，中医辨证为心血瘀阻证者。也适用于急性心梗经皮冠状动脉介入(PCI)术的病人，可以减少无再流，改善心肌微循环等。
“注射用丹参多酚酸盐”是以丹参乙酸镁为主要活性成分的多酚酸盐类，其中丹参乙酸镁含量高达80％，盐的药理活性优于酸，镁离子是其药效作用的重要物质基础，其余20％组分为紫草酸镁、迷迭香酸钠、丹参乙酸二钾、异丹参乙酸二钾、紫草酸二钾、丹参素钾，丹酚酸G镁。其生产过程中以丹参乙酸镁作为质量控制标准，运用指纹图谱技术对药材、原料药和制剂的质量进行全面的控制。同时制剂采用冻干粉技术，避免该类化合物的不稳定性，确保产品的质量标准显著高于同类传统丹参制剂。
中国专利号：CN.102058599已报道注射用丹参多酚酸盐的制备方法：50-95％(V/V)的乙醇提取丹参药材，提取三次，每次2小时，过滤提取液，回流条件下浓缩，得到浓缩液在50-60℃的相对密度为1.00-1.20，用水稀释浓缩液，在室温下的相对密度为0.92-1.12，聚二乙烯苯型大孔吸附树脂吸附，水洗以去除糖、蛋白质及无机盐，10％(V/V)以下乙醇洗脱非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，15-25％乙醇洗脱丹参乙酸盐，收集并浓缩洗脱液，90％乙醇沉淀，滤过，获得滤液，真空干燥获得成品。
注射用丹参多酚酸盐可通过钙通道阻滞改善微循环，抑制血栓素A2(TXA2)合成酶，抑制血小板的聚集，已被广泛应用于临床心脑血管系统疾病的治疗。此外，基于丹参多酚酸盐含大量酚羟基，具有清除自由基和强抗氧化作用，已被验证具有抗炎保肝效果。但迄今为止其在抗病毒领域未曾被研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的抗病毒的药物。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明一方面提供了一种注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用。
本发明另一方面提供了一种注射用丹参多酚酸盐和其他抗病毒药物联用在制备抗病毒的药物中的应用。
本发明再一方面提供了一种注射用丹参多酚酸盐在制备抑制病毒进入靶细胞的药物中的应用。
本发明再一方面提供了一种注射用丹参多酚酸盐和其他抗病毒药物联用在制备抑制病毒进入靶细胞的药物中的应用。
进一步地，所述注射用丹参多酚酸盐的组份包括丹参乙酸镁、迷迭香酸钠、紫草酸镁、紫草酸二钾、丹参素钾、丹参乙酸二钾、异丹参乙酸二钾、丹酚酸G镁，所述丹参乙酸镁的含量为80％；
所述丹参乙酸镁的结构式为：
所述迷迭香酸钠的结构式为：
所述紫草酸镁的结构式为：
所述紫草酸二钾的结构式为：
所述丹参素钾的结构式为：
所述丹参乙酸二钾的结构式为：
所述异丹参乙酸二钾的结构式为：
所述丹酚酸G镁的结构式为：
进一步地，所述病毒包括HIV-1或冠状病毒。
进一步地，所述冠状病毒包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV。
进一步地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提出注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用，提供存在慢性基础疾病的新冠感染者新的治疗手段，该应用扩大了注射用丹参多酚酸盐的使用范围，且为病毒抑制，特别是在全球SARS-CoV-2流行的情况下，为治疗新冠病毒感染所致肺炎(COVID-19)提供新的药物。
本发明注射用丹参多酚酸盐作为抗病毒药物，实验表明：在体外培养细胞Vero-E6感染模型上，注射用丹参多酚酸盐抗SARS-CoV-2活性的半数有效浓度EC50为36.07μg/ml；注射用丹参多酚酸盐用于抑制SARS-CoV-2的进入阶段，可抑制SARS-CoV-2 S假病毒活性，IC50为19.81μg/ml。此外有效浓度范围内未见其明显的细胞毒性。因此可用作抗SARS-CoV-2药物的制备，本发明具有较大临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)在不同浓度时抑制SARS-CoV-2的抑制率曲线图，其中横坐标代表注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照，注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)对SARS-CoV-2的抑制率，并根据抑制率计算求出注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)抑制SARS-CoV-2的半数有效浓度EC50值。
图2为本发明实施例2中注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)在不同浓度时抑制SARS-CoV-2 S蛋白假病毒进入靶细胞的抑制率曲线图，其中横坐标代表注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照，注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)抑制SARS-CoV-2 S蛋白假病毒进入的抑制率，并求得注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)抑制SARS-CoV-2 S蛋白假病毒进入的半数抑制浓度IC50值。
图3为本发明实施例3中注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)对靶细胞Vero-E6细胞的存活率曲线图，其中横坐标代表注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照、Vero-E6细胞在给予不同浓度注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)后的细胞存活百分比。
图4为本发明实施例3中注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)对靶细胞293T/ACE2细胞的存活率曲线图，其中横坐标代表注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照、293T/ACE2细胞在给予不同浓度注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)后的细胞存活百分比。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不限制于本发明。
以下实施例主要通过构建SARS-CoV-2活毒与SARS-CoV-2 S假病毒体外细胞感染模型，来评价注射用丹参多酚酸盐的抗SARS-CoV-2活性，并确证注射用丹参多酚酸盐具有抗SARS-CoV-2感染的能力，同时具有抑制SARS-CoV-2进入靶细胞的过程，提供一种注射用丹参多酚酸盐在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
本发明采用的Vero-E6、293T细胞购自美国ATCC，稳定过表达人源SARS-CoV-2受体蛋白ACE2的293T细胞由本单位构建保存。
本发明实施例中采用的细胞生长培养液组成为：DMEM基础培养基，其中添加总体积10％的胎牛血清和总体积1％的氨苄霉素/链霉素，培养液于4℃储存，使用前37℃水浴预热。
本发明实施例中采用的注射用丹参多酚酸盐是由上海绿谷制药有限公司生产，每瓶装100mg(含丹酚酸B镁80mg)。执行标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ09012005-2010Z，国药准字Z20050248。
本发明实施例中采用的SARS-CoV-2由武汉病毒研究所于感染者体内分离并扩增保存。
本发明实施例中假病毒包装质粒及其来源：假病毒包装骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-为南方医科大学鉴定保存，已公开的优化后的全长SARS-CoV-2 S蛋白核心质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke由上海复旦大学陆路教授惠赠。
本发明实施例中采用的荧光素酶检测试剂盒购自美国PROMEGA公司，包括荧光素酶底物及细胞裂解液。
本发明实施例中采用的Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Takara TB PremixEx TaqTMIITliRNaseH Plus均购自Takara。
药理实验部分
实施例1注射用丹参多酚酸盐体外抗SARS-CoV-2的活性检测
1、方法：
1)将对数生长期的Vero-E6细胞接种于48孔板，3*10^5个细胞/孔，37℃、5％CO2过夜培养。
2)药物预孵：采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基稀释药物。注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)初始浓度设置为300μg/ml(溶剂为DMSO)，三倍倍比稀释药物，每个浓度药物设置3个复孔，共7个药物梯度(300、100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41μg/ml)。设置溶剂二甲基亚砜(DMSO)作为对照，对照组采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基稀释，给予药物同体积的二甲基亚砜。去除细胞上清后1)中48孔板中的实验组每孔加入100μl稀释后的药物，对照组加入100μl稀释后的DMSO，置37℃孵育1h。。
3)病毒感染：48孔板每孔加入5μl SARS-CoV-2病毒稀释液(感染复数MOI＝0.05)，并置细胞于37℃继续孵育1h。
4)换液：充分去除感染物上清，细胞用200μl PBS洗一遍。重新在每孔加入200μl含对应浓度药物的培养基，继续于37℃中培养24h后收取150μl细胞培养上清待测。采用qRT-PCR测定上清中病毒的拷贝数，评价药物的抗SARS-CoV-2活毒的能力。
5)病毒RNA提取具体操作方法参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNAExtractionKit(Code No.9766)：
a)病毒的裂解：在150μl细胞培养上清中，加入50μl PBS(PH7.4)溶液补足至200μl。随后加入200μl的Buffer VGB、20μl的Proteinase K和1.0μl的Carrier RNA，充分混匀，于56℃水浴温浴10分钟充分裂解。向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。
b)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。
c)将500μl的Buffer RWA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
d)将700μl的Buffer RWB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。(Buffer RWB中已经加入了指定体积的100％乙醇)。沿Spin Column管壁四周加入BufferRWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
e)重复操作步骤d。
f)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。
g)将Spin Column安置于新的1.5ml RNase free collection tube上，在SpinColumn膜的中央处加入30μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟。12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。
6)病毒RNA逆转录具体操作方法(参照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser，Code No.RR047A)：
a)去除基因组DNA反应：按如下成分于冰上配制反应混合液
试剂
体积(μl)
5*gDNA Eraser Buffer
2.0
gDNA Eraser
1.0
Total RNA
3.0
RNase Free dH<sub>2</sub>O
4.0
Total volume
10.0
将样品置于42℃反应2min。
b)逆转录反应体系：冰上配置
试剂
体积(μl)
步骤1的反应液
10.0
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1.0
RT Primer Mix
1.0
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)
4.0
RNase Free dH<sub>2</sub>O
补齐至20.0
将样品置于37℃温育15min，然后置于85℃加热5sec。
7)采用qPCR检测病毒拷贝数：参照Takara TBPremix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus，Code No.RR820A)(采用标准曲线法：用已知拷贝数的RBD质粒做标准品，特异性引物靶向RBD)。按照如下成分于冰上配置反应液：
引物序列如下：
RBD上游引物(Forward Primer)：CAATGGTTTAACAGGCACAGG(SEQ ID NO：1)
RBD下游引物(Reverse Primer)：CTCAAGTGTCTGTGGATCACG(SEQ ID NO：1)
根据两步法PCR扩增标准程序，在ABI7500定量PCR仪上完成检测：
Stage 1：预变性、Reps：1个循环、95℃,30s；
Stage 2：PCR反应、Reps：40个循环、95℃,5s；
退火：60℃,30～34秒。
2、结果：如图1所示；
根据标准曲线，计算出每个样品的拷贝数。以DMSO组拷贝数作为参照，计算药物处理组抑制率。再根据不同浓度药物处理组抑制率，运用Prism8.0软件，拟合出药物抑制率曲线，并计算出注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)抗SARS-CoV-2活性的半数有效浓度EC50为36.07μg/ml。
实施例2注射用丹参多酚酸盐对SARS-CoV-2-S蛋白假病毒进入的抑制活性检测
1、方法：
1)SARS-CoV-2 S蛋白(pNL4-3.Luc.R-E-pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke)假病毒包装：
对数生长期的HEK-293T细胞4*10^5个/ml，2ml每孔均匀接种于6孔板中。37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时。转染前1小时更换新鲜培养基，分别采用100μl空白DMEM培养基配制质粒稀释液及转染试剂(PolyJet)稀释液，每孔配制比例如下(质粒DNA需采用去内毒素的提取试剂盒抽提)：
pNL4-3.Luc.R-E- 1000ng
pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke 500ng
PolyJet 6μl
具体配制方法如下：pNL4-3.Luc.R-E-质粒与pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke质粒同时加入到100μl空白DMEM培养基中混匀，PolyJet采用100μl空白DMEM培养基稀释混匀。将PolyJet稀释液加入质粒稀释液中并混匀，室温孵育15分钟，均匀的添加至HEK-293T细胞中，37℃培养48小时后收集上清病毒液，4000rpm离心10分钟，0.45μm无菌滤头过滤，即得到SARS-CoV-2假病毒。
2)假病毒抑制实验：
药物与假病毒作用：取对数生长期过表达SARS-CoV-2受体ACE2的293T细胞(293T/ACE2)，按1*104个/孔均匀铺于96孔细胞板中。37℃细胞培养箱中培养24小时。
注射用丹参多酚酸盐初始浓度设置为25μg/ml，给药前采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释7个浓度梯度(25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625μg/ml)，每孔60μl，每个浓度3个复孔，设置DMSO溶剂对照组。将60μl假病毒加入稀释后的药物中，混匀室温作用30分钟，取100μl/孔添加至ACE2/293T细胞中，37℃培养48小时。
检测：去除培养基，200μl/孔无菌PBS(PH7.4)洗涤细胞一次，每孔加入40μl 1X细胞裂解液，室温震荡裂解15分钟。转移30μl/孔裂解上清到96孔白色酶标板中，按照单荧光素酶检测试剂盒说明书加等体积稀释后的荧光素酶底物，立即进行酶标仪检测荧光值，根据荧光值大小，判断注射用丹参多酚酸盐抑制病毒吸附进入的活性。根据荧光值与药物浓度的对应关系计算抑制率，绘制曲线并计算注射用丹参多酚酸盐的半数抑制浓度IC50。
2、结果：如图2所示；
以DMSO溶剂组为对照，根据荧光值计算药物处理组的抑制率。再根据不同浓度药物处理组抑制率，运用Prism8.0软件，拟合出药物抑制率曲线，并计算出注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)抑制SARS-CoV-2 S蛋白假病毒进入靶细胞的的半数有效抑制浓度IC50为19.81μg/ml。
实施例3注射用丹参多酚酸盐的细胞毒性检测
1、方法：
1)细胞接种：
处于对数生长期的Vero-E6、293T/ACE2细胞，调整细胞密度至1*10^4个/孔，分别以100μL/孔接种于96孔板，37℃细胞培养箱中培养过夜。
2)药物浓度设计：
给药前用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释7个浓度梯度。
Vero-E6细胞：初始浓度设置为300μg/ml(300、100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41μg/ml)，取每孔100μL稀释后的药物分别加入1)中96孔板中的Vero-E6细胞中，每孔终体积200μL。每个药物浓度设置3个复孔。以DMSO溶剂处理组为空白对照。
293T-ACE2细胞：初始浓度设置为250μg/ml(250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906μg/ml)，取每孔100μL稀释后的药物分别加入1)中96孔板中的293T-ACE2细胞中，每孔终体积200μL。每个药物浓度设置3个复孔。以DMSO溶剂处理组为空白对照。
3)检测吸光度：
孵箱中培养48h后，每孔加入10μL CCK-8工作液，培养箱继续孵育3小时。酶标仪测定450nm处吸光度。
4)根据测得的OD值，分别计算与对照组相比，在各个浓度的药物的作用下，Vero-E6、293T-ACE2细胞的存活率。
2、结果：如图3、4所示；
注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)在300μg/ml及有效浓度范围内对Vero-E6细胞(图3)。注射用丹参多酚酸盐(ZDDY)在250μg/ml及有效浓度范围内对293T/ACE2细胞(图4)无明显毒性作用。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
中国科学院武汉病毒研究所
<120> 注射用丹参多酚酸盐在制备抗病毒的药物中的应用
<130> CP120010293C
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caatggttta acaggcacag g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcaagtgtc tgtggatcac g 21
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