阅读说明：本技术 一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法 (Method for constructing sepsis rat model with multiple organ dysfunction syndrome ) 是由 修光辉 李秀玲 凌斌 孙洁 刘萍 陈献忠 邓琼芳 于 2020-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法,本发明所述方法为：将脂多糖配制成相应浓度,对大鼠进行脂多糖静脉注射,按住大鼠,保持仰卧位,后肢内侧暴露向上,轻轻拔掉左后肢毛发,酒精棉球擦拭,按压腹股沟,使股静脉充盈；酒精棉球消毒后,1ml注射器平行缓慢进针,确定针尖在血管内后可推药,推药结束后,用干棉球按压注射点止血；止血完毕后常规饲养,定时观察并记录大鼠状态。本发明所述方法构建的动物模型脂多糖剂量低,死亡率仅为50％-70％,是研究脓毒症伴MODS模型的理想方法。(The invention discloses a method for constructing a rat model with sepsis and multiple organ dysfunction syndrome, which comprises the following steps: preparing lipopolysaccharide into corresponding concentration, performing intravenous injection on lipopolysaccharide on a rat, pressing the rat, keeping the rat in a supine position, exposing the inner side of hind limbs upwards, slightly pulling out hair of the left hind limbs, wiping the hair with an alcohol cotton ball, and pressing groin to fill femoral veins; after the alcohol cotton ball is sterilized, a 1ml syringe is inserted slowly in parallel, the medicine can be pushed after the needle point is determined to be in the blood vessel, and after the medicine pushing is finished, the injection point is pressed by a dry cotton ball to stop bleeding; after hemostasis is finished, the rat is raised regularly, and the state of the rat is observed and recorded regularly. The animal model constructed by the method has low lipopolysaccharide dosage and mortality rate of only 50-70 percent, and is an ideal method for researching the sepsis accompanied MODS model.)

一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法

技术领域

本发明涉及一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法，属于动物模型构建技术领域。

背景技术

脓毒症是临床上危重患者重要的致死原因之一，来自全身各个部位的感染均可诱发脓毒症；脓毒症时可出现多种病理生理改变，如细胞功能紊乱、炎性反应与抗炎反应失衡、机体代谢改变、微循环障碍等。若未及时有效地采取治疗措施，全身过度的炎性反应或器官局部缺血均可导致机体重要脏器受损，最终发展为多器官功能障碍综合征(MODS)，危及患者生命。

脓毒症作为ICU乃至整个医疗界的难题，对其研究已有数十年的历史，但其病死率依然居高不下，美国每年约有200000人死于脓毒症。脓毒症发展成为MODS无疑加大了治疗难度，后期病人往往死于多个脏器功能障碍甚至衰竭。因此，提高单纯的脓毒症患者或者已经伴有MODS患者的治愈率，也可在更大程度上挽救患者的生命。目前对脓毒症的研究多基于动物实验，建立脓毒症动物模型的方法主要包括三种：①注射脂多糖内毒素或酵母多糖；②注射细菌或病毒；③破坏内源性屏障，造成腹腔感染，如盲肠结扎-穿孔(CLP)模型。也有部分学者采用改良的“二次打击法”(失血+内毒素或失血+CLP)制作脓毒症动物模型，但此法复杂耗时，故应用较少。感染是以上动物模型发病的基本病因，符合临床上脓毒症患者的发病过程，均能较好地复制出脓毒症患者的发病机理，对脓毒症的研究具有重要的参考价值。脂多糖诱发的脓毒症往往伴有心、肝、肺、肾、小肠的损伤，甚至可多器官的损伤。Bruno等发现，脂多糖诱发的脓毒症，可出现心脏心排出量急剧下降，心肌功能障碍。Zhang等的研究显示，脂多糖静脉注射可成功诱发急性肝衰竭模型。多项研究表明，用内毒素脂多糖诱发出脓毒症伴MODS的大鼠模型是可行的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法，具体包括以下步骤：

(1)将脂多糖配制成相应浓度，对大鼠进行脂多糖静脉注射，按住大鼠，保持仰卧位，后肢内侧暴露向上，轻轻拔掉左后肢毛发，酒精棉球擦拭，按压腹股沟，使股静脉充盈；

(2)酒精棉球消毒后，1ml注射器平行缓慢进针，确定针尖在血管内后可推药，推药结束后，用干棉球按压注射点止血；止血完毕后常规饲养，定时观察并记录大鼠状态。

本发明所述脂多糖股静脉注射量为2mg/kg～3mg/kg。

本发明的有益效果：

本发明实施例采用不同给药方式、不同剂量的脂多糖制作脓毒症伴MODS的大鼠模型；对比各组动物死亡率、行为学、相应的生化指标、组织病理学改变，结果显示，本发明所述方案动物存活率相对较高，动物出现多个器官功能障碍，均符合所需模型要求，脂多糖剂量相对较少，成本低，为研究脓毒症伴MODS最佳造模方法。

附图说明

图1为假手术组与模型组的标本肉眼观察图；

图2假手术组与模型组肺脏病理切片HE染色；

图3假手术组与模型组肝脏病理切片HE染色；

图4假手术组与模型组肾脏病理切片HE染色；

图5假手术组与模型组小肠病理切片HE染色；

图6假手术组与模型组心脏病理切片HE染色。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

本实施例所用的实验材料：脂多糖(Sigma-L2880(O55:B5))；水合氯醛(Solarbio)；HITACHI-7171A自动生化分析仪(日本日立公司)；组织显微摄像图文系统(四川成都科技大学金盘公司)；BH-Z普通光学显微镜(OLYMPUS)；手术器械(上海手术器械厂)。

为了进一步说明本发明所述方法的优势，本实施例设计了9组实验，其中7组(A组、B组、C组、D组、E组、H组、I组)均作为对比试验。

具体分组过程为：清洁级健康SD大鼠180只，雌性，体重(220±10)g，随机数字法分为9组，每组20只。A组：假手术组，PBS股静脉注射2.5mL/kg；B组：轻度失血+脂多糖腹腔注射30mg/kg；C组:轻度失血+脂多糖股静脉注射5mg/kg；D组:脂多糖股静脉注射5mg/kg；E组:脂多糖股静脉注射4mg/kg；F组:脂多糖股静脉注射3mg/kg；G组:脂多糖股静脉注射2mg/kg；H组:脂多糖股静脉注射1mg/kg；I组:脂多糖股静脉注射0.5mg/kg。

本实施例的具体造模过程为：参照文献中的方法，在制备脓毒症模型的基础上进行改良，制备脓毒症伴MODS的大鼠模型。

(1)轻度失血复合脂多糖腹腔注射

抓住大鼠头部及背部皮肤，使其眼球暴露并充血，用折断的毛细吸管插入大鼠眼球静脉从；血液流出后，计数滴血滴数(预计25滴血等于1ml)，以每只大鼠失血10ml/kg的量造成大鼠轻度(15％左右)失血。一只200g的大鼠放血大概50滴，放血完毕，用棉签压迫眼球10-20s止血，并观察大鼠状态。将脂多糖配制成相应浓度，放血6h后即行腹腔脂多糖注射。抓住大鼠背部皮肤，暴露腹壁，保持头低的体位，以免穿刺时损伤重要脏器。在右下腹找一穿刺点，以穿刺点为中心，碘伏棉签消毒直径为2cm的周边区域。取1ml注射器，与皮肤成30°-45°的角破皮，有落空感后挑起针头，略平针尖，回抽无血无气泡及尿液后即可注射；注射完毕后，常规饲养，定时观察并记录大鼠状态。

(2)脂多糖静脉注射

按住大鼠，保持仰卧位，后肢内侧暴露向上。轻轻拔掉左后肢毛发，酒精棉球擦拭，按压腹股沟，使股静脉充盈；酒精棉球消毒后，1ml注射器平行缓慢进针，确定针尖在血管内后可推药，推药结束后，用干棉球按压注射点止血；止血完毕后常规饲养，定时观察并记录大鼠状态。

结果分析：

①观察记录各组造模后24h A-I组死亡情况，结果如表1所示

表1造模后24h A-I组死亡情况

注：与A组比较，^*P<0.05，与B组比较^#P<0.05，与I组比较^△P<0.05。

通过表1可以看出：A组大鼠正常活动，无死亡率，与A组比较，其余各组死亡率均较高，p<0.05，与B组比较，G、H、I三组的死亡率较低，p<0.05，差异有统计学意义，与I组比较，B-F组均较高，p<0.05，差异有统计学意义。

②对9组大鼠进行行为学比较：

A(假手术)组：大鼠精神正常，饮食正常，肛门区干洁，毛色正常。

B、C组：失血约15％时，大鼠活动能力减弱，表现为挣扎无力，肌肉松弛，行动缓慢，呼吸频率增加等，造模30min后即有大鼠出现精神萎靡不振、睁眼困难，1h后陆续有大鼠死亡，24h死亡率为80％，毛色黯淡，大便稀。

D、E组：造模后30min陆续有大鼠开始出现精神萎靡，行动迟缓，呈蜷缩痛苦状，2h后即有大鼠死亡，毛色黯淡，大便不成形，无血无脓，黄褐色。

F、G、H、I组：造模1h后左右陆续有大鼠出现精神萎靡，行动迟缓，呈蜷缩痛苦状，4h后有大鼠开始死亡，毛色黯淡，大便不成形，无血无脓，黄褐色。

③对9组大鼠进行血液检测

造模成功24h后，3.6％水合氯醛麻醉大鼠，待大鼠痛觉反应消失后仰卧位固定，于腹正中线剪开腹壁，但不要突破膈肌；钝性分离，暴露腹主动脉，取大鼠腹主动脉血，检测ALT、AST、BUN、Cr、CK-MB、LDH、WBC、PLT等指标。

血常规检验结果如表2所示：

表2造模后24h各组血常规检验结果(n＝5)

注：与A组比较，^*P<0.05，差异有统计学意义。

由表2可以看出与假手术组比较，WBC、PLT明显下降，B-H具有统计学意义(p<0.05)，I组没有统计学意义(p>0.05)；其中白细胞分类中N％比例升高，L％比例下降，B-H均具有统计学意义(p<0.05)，I组没有统计学意义(p>0.05)；M％比例升高，B-G均具有统计学意义(p<0.05)，H-I组没有统计学意义(p>0.05)。

血生化检验结果如表3所示：

表3造模后24h各组生物化学检验结果(n＝5)

注：与A组比较，^*P<0.05，差异有统计学意义。

由表3可以看出：

肝功：与假手术组比较，ALT均明显升高，B，C，D，F，G组有统计学意义(p<0.05)，E、H、I组无统计学意义(p>0.05)；AST均明显升高，B-F，H组有统计学意义(p<0.05)G、I组组无统计学意义(p>0.05)。

肾功：与假手术组比较，BUN均明显升高，B-D，F-H组有统计学意义(p<0.05)，E、I组无统计学意义(p>0.05)；Cr均明显升高，B-E,G-I组有统计学意义(p<0.05)，F组无统计学意义(p>0.05)。

心肌酶学：CK、CK-MB、LDH各均明显升高，除I组CK-MB的升高没有统计学意义(p>0.05)，其余组在各值中差异均有统计学意义(p<0.05)。

④形态学观察：

标本肉眼观：与假手术组(A组)比较，模型组(H组)造模24小时后各组织器官肉眼可那可见：不同程度的肠充血水肿，肝脏散在充血点，肝叶缺血，肾脏充血、淤血，肺、脾散在缺血灶；如图1所示，M为模型组，N为假手术组；图中A肝脏，B肾脏，C肺脏、D脾脏。

⑤HE染色

假手组(A组)比较，模型组(H组)造模24小时后，可见心肌间隙增宽，中性粒细胞浸润；肝细胞排列紊乱、水肿，肝窦内充血及大量炎性细胞浸润；肺泡及肺间质内有大量炎性细胞浸润，核深染，肺间质充血、水肿；肾脏可见细胞稍有紊乱，肾小球周围明显充血，肾组织中可见炎性细胞浸润；小肠可见充血、水肿，大量炎性细胞浸润，肠绒毛部分断裂。如图2～6所示，图2假手术组(A)与模型组(B)肺脏病理切片HE染色；图3假手术组(A)与模型组(B)肝脏病理切片HE染色；图4假手术组(A)与模型组(B)肾脏病理切片HE染色；图5假手术组(A)与模型组(B)小肠病理切片HE染色；图6假手术组(A)与模型组(B)心脏病理切片HE染色。

评价脓毒症动物模型成功与否有以下参考指标：①高排低阻的血液动力学状态及高代谢状态；②自然死亡率达50％-70％；③出现器官功能障碍及死亡的时间要滞后于造模时间6-12h。④伴发器官功能障碍。MODS是严重创伤(如休克、重症胰腺炎)、严重感染等原发病发生24h后，同时或先后发生两个或两个以上脏器功能障碍的临床综合征。构建脓毒症伴MODS的大鼠模型，需要同时满足以上多个条件。

本实施例采用不同给药方式、不同剂量的脂多糖制作脓毒症伴MODS的大鼠模型；对比各组动物死亡率、行为学、相应的生化指标、组织病理学改变，结果显示，本发明所述方案动物存活率相对较高，动物出现多个器官功能障碍，均符合所需模型要求，脂多糖剂量相对较少，成本低，为研究脓毒症伴MODS最佳造模方法。