阅读说明：本技术 一种大鼠血浆中芦荟苦素的lc-ms/ms测定方法 (LC-MS/MS determination method for aloesin in rat plasma ) 是由 谭银丰 李海龙 李友宾 王雪松 崔雪 于 2020-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种大鼠血浆中芦荟苦素的LC-MS/MS测定方法,包括以下步骤：(1)血浆的样品处理：取含芦荟苦素的待测血浆,加入含内标芦荟新苷D的甲醇溶液涡旋沉淀,离心,取上清液为待检测样品；(2)设定液相色谱条件为：采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱,流动相A为含0.1～1.0‰(v/v)甲酸水溶液,流动相B为甲醇；(3)设定质谱条件为：电喷雾离子源,负离子检测,喷雾电压4500V,喷雾温度为550℃,采用多反应离子监测扫描模式,用于芦荟苦素定量分析的离子对为m/z 393.1→272.9,内标化合物芦荟新苷D离子对m/z为555.3→144.9。本发明方法可更加快速、灵敏、准确地检测血浆中芦荟苦素。(The invention provides an LC-MS/MS determination method of aloesin in rat plasma, which comprises the following steps: (1) sample processing of plasma: adding aloesin-containing plasma to be detected into methanol solution containing internal standard aloinoside D, performing vortex precipitation, centrifuging, and collecting supernatant as sample to be detected; (2) setting the conditions of the liquid chromatogram as follows: gradient elution is carried out by adopting a mobile phase A and a mobile phase B, wherein the mobile phase A is an aqueous solution containing 0.1-1.0 thousandth (v/v) of formic acid, and the mobile phase B is methanol; (3) setting mass spectrum conditions as follows: electrospray ion source, negative ion detection, spray voltage 4500V, spray temperature 550 deg.C, and multiple reaction ion monitoring scanning mode, wherein the ion pair for quantitative analysis of aloesin is m/z 393.1 → 272.9, and the internal standard compound aloinoside D ion pair m/z is 555.3 → 144.9. The method can detect aloesin in blood plasma more quickly, sensitively and accurately.)

一种大鼠血浆中芦荟苦素的LC-MS/MS测定方法

技术领域

本发明涉及芦荟苦素技术领域，特别涉及一种大鼠血浆中芦荟苦素的LC-MS/MS测定方法。

背景技术

芦荟苦素是一种色酮苷类物质，在百合科芦荟属多种植物中均有存在，在芦荟Aloe barbadensis Miller中的含量约为3‰左右。芦荟是一种应用历史悠久的传统中药，用其叶的汁液浓缩干燥后入药，具有泻下通便，清肝泻火，杀虫疗疳之功效。相关研究显示，芦荟苦素是芦荟的重要活性物质之一。芦荟苦素可以抑制酪氨酸酶活性，阻止黑色素的合成，具有美白功效。芦荟苦素可以调节细胞炎症因子和生长因子释放，产生抗炎作用；诱导Smad和MAPK信号蛋白的激活，促进伤口愈合。芦荟苦素还可以激活WNT信号通路，下调Nortch信号通路，调节消化系统功能，改善结肠炎大鼠病理状态。

含芦荟苦素的芦荟提取物可以促进脂联素的分泌，调节实验动物糖脂代谢，有抗糖尿病作用。毒理学研究表明，芦荟苦素基本无毒副作用。然而，芦荟苦素的药代动力学研究很少，有关报道没有提供药代动力学参数，所用分析技术也已相对落后。本发明人力求建立一种更加快速、灵敏的芦荟苦素分析方法，并应用于药动学研究。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种大鼠血浆中芦荟苦素的LC-MS/MS测定方法，可更加快速、灵敏、准确地检测血浆中芦荟苦素，可更好地应用于药动学研究。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种大鼠血浆中芦荟苦素的LC-MS/MS测定方法，包括以下步骤：

(1)血浆的样品处理：取含芦荟苦素的待测血浆，加入含内标芦荟新苷D的甲醇溶液涡旋沉淀，离心，取上清液为待检测样品；

(2)设定液相色谱条件为：采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含0.1～1.0‰(v/v)甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序为：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0～0.50	95	5
0.51～3.00	95～5	5～95
			3.01～4.00	10	90
4.01～5.00	95	5

(3)设定质谱条件为：电喷雾离子源，负离子检测，喷雾电压4500V，喷雾温度为550℃；采用多反应离子监测扫描模式，用于芦荟苦素定量分析的离子对为m/z 393.1→272.9，内标化合物芦荟新苷D离子对m/z为555.3→144.9。

进一步的，步骤(1)中，所述含内标芦荟新苷D的甲醇溶液与血浆按体积比2-4：1进行混合。

进一步的，步骤(1)中，所述含内标芦荟新苷D的甲醇溶液的浓度为50ng/mL～100ng/mL。

进一步的，步骤(1)中，所述涡旋的转速为2000rpm，时间为10min；所述离心的条件：13 000rpm、4℃离心10min。

进一步的，步骤(2)中，采用填料为C18的色谱柱，为Synergi Hydro-Rp色谱柱、Luna Omega C18色谱柱、Kinetex Evo C18色谱柱中的一种，所述色谱柱的规格为2.10mm×50mm，填充剂粒径为2-5μm。

进一步的，色谱条件：柱温28～40℃，进样量1～10μL，流速0.40～0.60mL·min^-1。

进一步的，质谱条件：GS1为30-100psi，GS2为30-100psi，帘气为20-50psi，碰撞气为1-8psi。

进一步的，所述多反应离子监测的参数为：

	DP/V	CE/V	CXP/V	EP/V
					芦荟苦素	90	29	10	10
芦荟新苷D	115	41	11	10

。

进一步的，所述柱温为30℃，进样量为5μL，流速为0.50mL·min^-1。

进一步的，质谱条件：GS1为50psi，GS2为50psi，帘气为30psi，碰撞气为2psi。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明开发出一种大鼠血浆中芦荟苦素的LC-MS/MS测定方法，采用液相色谱-质谱/质谱仪联用，设定特定的梯度洗脱程序，结合一定的质谱条件，可快速、灵敏、准确地检测血浆中芦荟苦素，可更好地应用于药动学研究。

附图说明

图1芦荟苦素与芦荟新苷D的化学结构与MS/MS谱图。

图2芦荟苦素和内标芦荟新苷D的LC-MS/MS色谱图，

空白血浆样品(不加内标处理，A)、

标准曲线定量下限样品(芦荟苦素1ng·mL^-1，B)、

空白血浆样品(加内标处理，C)、口服给药8h后血浆样品(D)、静脉给药8h后血浆样品(E)。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1仪器、试药与实验动物

1.1仪器

Nexera XR UHPLC液相色谱仪(日本岛津公司)通过Turbo V离子源接口串联AB-SCIEX API 4000+串联四级杆质谱仪，Analyst软件控制数据采集和处理(美国AB公司)。5922型冷冻离心机(日本KUBOTA)，XS105DU十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，LabTower EDI15超纯水一体机(美国热电)，Vibrax圆周振荡器(德国艾卡)。AMS小动物麻醉机(北京吉安得尔科技有限公司，Gene&I)。

1.2试药与实验动物

芦荟苦素对照品由昊睿化学(上海)有限公司提供；芦荟新苷D(Aloeresin D)对照品由成都普菲德生物技术有限公司提供，批号：19072605。对照品纯度均≥98％。色谱级甲醇由德国默克公司提供。超纯水由LabTower EDI15超纯水机制备。异氟烷由北京吉安得尔科技有限公司提供。

清洁级SD雄性大鼠，体重243～300g(长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物合格证号：No.43006700017619，许可证号：SCXK(湘)2014-0011)；饲养条件：温度22±2℃，湿度40％～70％，12h明暗交替，自由进食、饮水。

2方法与结果

2.1色谱-质谱条件

采用Synergi Hydro-Rp(2.10mm×50mm,4μm,phenomenex)色谱柱，柱温30℃，流速0.50mL·min^-1,进样量5μL，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含0.1‰(v/v)甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序为：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0～0.50	95	5
0.51～3.00	95～5	5～95
			3.01～4.00	10	90
4.01～5.00	95	5

。

电喷雾离子源(ESI)，负离子检测，喷雾电压4500伏，GS1为50psi，GS2为50psi，帘气为30psi，喷雾温度为550℃，碰撞气为2psi。

多反应离子监测(MRM)，用于芦荟苦素定量分析的离子对为m/z 393.1→272.9(DP:-90,CE:-29,CXP:-10,EP:-10),内标化合物芦荟新苷D为555.3→144.9(DP:-115,CE:-41,CXP:-11,EP:-10)。

芦荟苦素与芦荟新苷D的化学结构与质谱图如下图1.

2.2溶液制备

精密称取芦荟苦素对照品适量，加甲醇配制成0.1mg·mL^-1的储备液。取芦荟新苷D对照品适量，精密称定，加甲醇配制成50ng·mL^-1内标溶液。配制好的溶液置4℃保存备用。

2.3血浆样品处理

取血浆50μL置离心管中，加入含内标芦荟新苷D 50ng·mL^-1的甲醇溶液150μL，2000rpm涡旋10min充分沉淀蛋白，13 000rpm(4℃)离心10min，取上清液置微量进样管中，进样5μL进行LC-MS/MS分析。

2.4方法学考察

按2020年版《中国药典》四部生物样品定量分析方法验证指导原则的要求，验证分析方法的有效性。

2.4.1专属性考察

取来源不同大鼠的空白血浆、空白血浆加芦荟苦素对照品、静脉给药后8h经眼眶静脉采集到的血浆样品、口服给药8h后血浆样品按“2.3”项下样品处理方法处理，按“2.1”项下条件进样分析，色谱图见图2。芦荟苦素、芦荟新苷D出峰时间分别为1.85、2.67min。

2.4.2线性关系考察

取空白血浆，加入0.1mg·mL^-1的芦荟苦素储备液配制成600、400、200、40、10、2、1ng·mL^-1系列浓度的标准曲线血浆样品，各取50μL经“2.3”项下方法处理后，进样5μL按“2.1”项下方法进行分析。以待测物与内标峰面积之比(Y)为纵坐标，待测物浓度(X)为横坐标，权重为1/X²，进行线性回归，得回归方程Y＝0.00617X+0.00113(r＝0.9945)。表明芦荟苦素在1～600ng·mL^-1范围内线性关系良好。

2.4.3残留效应

取标准曲线定量上限样品(600ng·mL-1)处理进样分析后，接着进样分析1个空白样品，考察分析芦荟苦素和内标芦荟新苷D在空白样品色谱图中的残留。结果，芦荟苦素残留的峰面积小于定量下限样品峰面积的20％，内标芦荟新苷D的残留峰面积小于质控样品内标峰面积的5％，残留效应符合要求。

2.4.4准确度与精密度

取空白血浆，加入0.1mg·mL^-1的芦荟苦素储备液配制成低、中、高三种浓度(3.0、50.0、500.0ng·mL^-1)的芦荟苦素质控样品和定量下限样品(1.0ng·mL^-1)，每个浓度设5个平行样，按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下方法进样分析。计算日内精密度和准确度，3d内测定3批样品，计算日间精密度。

结果日内精密度、日间精密度RSD均小于15％，重复性良好；准确度在96.96％～107.28％之间。具体结果见表1.

表1芦荟苦素定量分析精密度和准确度结果

2.4.5基质效应和提取回收率试验

按现有文献方法，采用提取后添加法评定基质效应，同时考察提取回收率。用3种不同溶剂分别配制高、中、低3种浓度(500ng·mL^-1、50ng·mL^-1、3ng·mL^-1)的芦荟苦素样品，每个浓度设5个平行样。

Set 1系列样品溶剂为甲醇；

Set2系列样品溶剂为来源于不同大鼠的空白血浆，经3倍体积甲醇沉淀蛋白后，离心分取的上清液；

Set 3系列样品溶剂为来源于不同大鼠的空白血浆。

各取以上样品50μL，按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下方法进样分析，得到峰面积为分别为A₁、A₂、A₃，基质因子MF＝A₂/A₁×100％；提取回收率RE＝A₃/A₂×100％。

芦荟苦素与内标芦荟新苷D的基质因子的比值为归一化的基质因子。结果见表2.

表2大鼠血浆中芦荟苦素的基质效应和提取回收率(Mean±SD,n＝5)

2.4.6稳定性考察

用空白血浆配制3种浓度(500ng·mL^-1、50ng·mL^-1、3ng·mL^-1)的芦荟苦素质控样品，考察下述情况下的稳定性。

(1)样品处理好后放置自动进样器中8h后进样分析；

(2)样品经3个冻融循环后再处理，进样分析；

(3)样品在室温下放置4h后再出来，进样分析；

(4)样品在-20℃下保存15d后再处理，进样分析。

结果各浓度样品测试的准确度在94.66％～109.60％之间，RSD均小于15％。稳定性考察合格。结果见表3.

表3血浆样品中芦荟苦素的稳定性

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，流动相A为1.0‰(v/v)甲酸水溶液。经检测，结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D峰形良好，无相互干扰，血浆中内源性物质对芦荟苦素和芦荟新苷D信号无明显影响。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，含内标芦荟新苷D的甲醇溶液的浓度为100ng/mL。经检测，结果显示芦荟新苷D峰高、峰面积增加约1倍，可以用于芦荟苦素的有效定量。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中，柱温40℃。经检测，结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D峰形良好，无相互干扰，血浆中内源性物质对芦荟苦素和芦荟新苷D信号无明显影响。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中，进样量10μL。经检测，结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D峰形良好，无相互干扰，血浆中内源性物质对芦荟苦素和芦荟新苷D信号无明显影响。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中，色谱柱为Luna Omega C18(2.10mm×50mm,4μm,phenomenex)。经检测，结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D峰形良好，无相互干扰，血浆中内源性物质对芦荟苦素和芦荟新苷D信号无明显影响。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中，色谱柱为Kinetex Evo C18(2.10mm×50mm,4μm,phenomenex)。经检测，结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D峰形良好，无相互干扰，血浆中内源性物质对芦荟苦素和芦荟新苷D信号无明显影响。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于，质谱条件中，GS1为100psi，GS2为100psi，帘气为50psi，碰撞气为8psi。经检测，结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D峰高略有降低，最低定量限样品的信噪比(S/N)≥10。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中，梯度洗脱程序为：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0～1.0	80	20
1.01～2.50	50	50
			2.51～3.50	20	80
4.01～5.00	90	10

经检测，结果显示芦荟苦素保留时间约1min，色谱峰出峰位置附近有较强的杂质峰干扰信号，使血浆中芦荟苦素的定量下限达不到1ng/mL.

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(3)中，设定质谱条件为：电喷雾离子源，负离子检测，喷雾电压5000V，喷雾温度为500℃；采用多反应离子监测扫描模式，用于芦荟苦素定量分析的离子对为m/z 393.1→272.9，内标化合物芦荟新苷D离子对m/z为555.25→511.2。结果显示芦荟苦素与芦荟新苷D信号强度比正离子模式下低2个数量级。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。