具体实施方式

本发明提供了citrusinine-II在制备影响人和动物对痒感知的试剂中的应用，所述citrusinine-II的结构式如式I所示：

本发明所述citrusinine-II优选为来源于柑橘亚科植物Atalantia monophylla的一种吖啶酮类生物碱。本发明对所述述citrusinine-II的来源并没有特殊限定，优选的根据Yannai等的方法提取：从泰国孔敬府Phuwieng区鉴定并收集A.monophylla的叶子，将叶子风干并粉碎成粉末，然后依次用己烷，EtOAc和MeOH萃取。真空蒸发试剂浸出液以获得己烷、EtOAc和MeOH的干燥提取物。功能筛选后，将EtOAc部分进行硅胶快速柱色谱(FCC)，并通过逐渐增加极性，用己烷，EtOAc和MeOH的梯度洗脱。每50ml收集一次洗脱液，并通过薄层色谱法(TLC)检测，得到10个馏分，称为F1-F10。用硅胶FCC纯化F7，得到F7.1-F7.4。通过Sephadex LH20凝胶过滤分离F7.2，用MeOH洗脱，得到citrusinine-II(Yannai，Shmuel.(2004)Dictionary of food compounds with CD-ROM:Additives,flavors,andingredients.Boca Raton:Chapman&Hall/CRC.)。在本发明所述应用中，所述citrusinine-II的纯度优选≥95％。

本发明提供了一种影响人和动物对痒感知的试剂，所述试剂的有效成分包括citrusinine-II，所述citrusinine-II的结构式如式I所示：

本发明所述citrusinine-II能够显著抑制不同物种TRPV3(Transientreceptorpotential vanilloid 3)配体门控型离子通道的2-氨基乙氧基二苯硼酸盐(2-APB)激活，而TRPV3作为人或动物皮肤表面与慢性瘙痒疾病密切相关的感受器被抑制，在一定时间内会钝化对瘙痒的感应，从而影响人和动物对痒的感知。具体的，本发明实施例中提供了小鼠模型实验，不论是急性瘙痒，还是慢性瘙痒，经过注射或涂抹所述citrusinine-II后，均可提高其对于瘙痒的抵抗力，因此可将其制备成影响或提高人和动物对痒感知的试剂。本发明所述citrusinine-II的来源和制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明所述citrusinine-II可特异性靶向受体TRPV3，所述TRPV3是一类温度敏感型非选择性阳离子通道，在皮肤角质化细胞中大量表达，特别是在毛囊上皮细胞的外根鞘和表皮基底层，正是由于TRPV3的特殊分布，TRPV3被发现与皮肤的多种生理和病理功能密切相关。本发明通过小鼠慢性瘙痒模型和急性瘙痒模型实验验证citrusinine-II对小鼠的缓解瘙痒效果。合成小鼠和人等物种TRPV3质粒，利用膜片钳技术验证citrusinine-II抑制哺乳动物TRPV3的2-APB激活，证实citrusinine-II在不同物种上应用的普适性。

本发明提供了一种止痒剂，所述止痒剂的有效成分包括citrusinine-II，所述citrusinine-II的结构式如式I所示：

本发明对所述止痒剂中有效成分的含量并没有特殊限定，优选还包括辅料，且对辅料的种类也没有特殊限定。本发明所述citrusinine-II的来源和制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明提供了一种止痛剂，所述止痛剂的有效成分包括citrusinine-II，所述citrusinine-II的结构式如式I所示：

本发明对所述止痛剂中有效成分的含量并没有特殊限定，优选还包括辅料，且对辅料的种类也没有特殊限定。本发明所述citrusinine-II的来源和制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明提供了一种止痒护肤品，所述护肤品的有效成分包括上述试剂或上述止痒剂。本发明对所述止痒护肤品的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规剂型即可。本发明所述止痒护肤品，优选通过外敷或者注射等方式应用于人类和动物缓解瘙痒、短期内克服急性和慢性瘙痒等。

本发明提供了citrusinine-II在制备抑制TRPV3离子通道的试剂中的应用，所述citrusinine-II的结构式如式I所示：

在本发明中，所述citrusinine-II可特异性靶向受体TRPV3，所述TRPV3是一类温度敏感型非选择性阳离子通道，在皮肤角质化细胞中大量表达，特别是在毛囊上皮细胞的外根鞘和表皮基底层，正是由于TRPV3的特殊分布，TRPV3被发现与皮肤的多种生理和病理功能密切相关，因此可将所述citrusinine-II用于制备抑制TRPV3离子通道的试剂。

本发明提供了一种TRPV3离子通道的抑制剂，所述抑制剂的有效成分包括citrusinine-II，所述citrusinine-II的结构式如式I所示：

本发明通过在HEK293T细胞系上过表达小鼠TRPV3受体(mTRPV3)，通过膜片钳技术发现，citrusinine-II的作用靶点是TRPV3受体，能够抑制TRPV3受体的2-APB激活；利用Rosetta分子建模软件对mTRPV3的分子结构进行模拟，并对mTRPV3序列进行嵌合体和点突变，发现突变位点Y564A能够影响citrusinine-II结合，因此所述化合物可抑制TRPV3通道。本发明对所述抑制剂的剂型并没有特殊限定，且所述citrusinine-II的来源和制备方法等优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明提供了上述抑制剂在制备治疗TRPV3离子通道相关疾病的药物中的应用。

本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，且利用所述药物时，可注射可口服。本发明所述TRPV3离子通道相关疾病优选包括皮肤炎症或慢性瘙痒。

本发明提供了一种治疗TRPV3离子通道相关疾病的药物，所述药物的有效成分包括上述抑制剂。

下面结合实施例对本发明提供的citrusinine-II在制备影响人和动物对痒和痛感知的试剂中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

citrusinine-II与mTRPV3等瘙痒相关受体靶向作用的电生理实验

将mTRPV3、hTRPV3、ratTRPV3、TRPV1、TRPA1、TRPV4、TRPM8、Nav1.7、Nav1.8等质粒瞬转过表达在HEK293T细胞系上，以上质粒均由上海生工生物工程有限公司合成。所有HEK293T细胞系均用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基加入10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，37℃，5％的CO₂孵育培养。

倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用WPI 0.86mm薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(P-97，Shutter)上经5步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5～3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5～2.5MΩ。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为0mV，细胞稳定10min使用适宜的脉冲电压(80/-80mV)开始记录电流。药物使用BiolabRS200进行灌流，药物之间的切换速度为50ms。串联电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5～8MΩ的范围之内维持不变，系统串联电阻补偿一般在30～60％之间。实验数据用PatchMaster软件分析，数据的进一步分析使用Igor软件，n代表实验的数据个数。

通过电动微操系统将细胞慢慢提起至快速加药切换系统(RSC-200)的加药口下沿齐平。加药切换系统直接与放大器相连，所有实验数据通过放大器记录在计算机软件PatchMaster中。通过Patch Master和切换加药系统给予细胞刺激及加药处理，记录通道电流变化，检测不同药物对通道的活性。为保证实验数据的准确，整个记录过程都需要保值稳定的封接电阻和串联电阻。

TRPV3通道内外液：130mM NaCl，3mM HEPES，0.2mM EDTA，用NaOH调至pH为7.2。实验过程中使用的药物需用上述电极外液溶解配制。

钠离子通道内液：20mM NaCl、5mM EGTA、1mM MgCl₂、135mM CsF、10mM葡萄糖和10mM HEPES，用CsOH溶液将pH调至7.4。

钠离子通道外液：130mM NaCl、0.1mM NiCl₂、20mM TEA-Cl、1.8mM CaCl₂、5mM 4-AP、0.01mM戊酸丙胺的盐酸盐、5mM CsCl、1mM CdCl₂和10mM HEPES，用NaOH溶液将pH调至7.4。

结果如图1所示，citrusinine-II抑制mTRPV3通道的2-APB激活，且呈现浓度依赖关系；citrusinine-II与其他瘙痒相关受体(mTRPV3受体外)的靶向作用情况，均不能激活或抑制这些受体(图2)。

实施例2

mTRPV3的结构模拟及点突变实验

Ⅰ.mTRPV3结构模拟

mTRPV3的建模使用Rosetta分子建模软件版本2020.37构建。以开放状态(PDB:6DVW)小鼠TRPV3的低温显微镜结构为模板。使用Rosetta将其结构舒展，选取其中能量最低的模型作为最终结构模型与citrusinine-II进行分子对接。使用Rosetta中的Ligand-Docking计算方法进行化合物与TRPV3通道的分子对接运算，获得10000个化合物与通道的复合结构，利用基于细胞膜环境特异的能量函数对这些候选结构模型的能量进行打分，选取出其中结合能量最低的复合物结构模型作为最终citrusinine-II与TRPV3相互作用的结构模型(图3)。

Ⅱ.mTRPV3嵌合体

利用嵌合体实验探究mTRPV3影响citrusinine-II的靶向区域。以TRPV1为受体，TRPV3为供体，将TRPV3的部分氨基酸残基片段置换到TRPV1的同源位置。具体操作方法如下：

引物设计，将TRPV1受体通道质粒通过PCR反应线性化，在上游引物和下游引物的5’端加入与供体TRPV1同源的15bp碱基序列：

TRPV1引物(SEQ ID NO.1：5’-GAATACCTCGCCTGCCGAGGATTCCAGCAGATGGGC-3’和SEQID NO.2：5’-GGTGAGGATGACATAATAGGCCAGTAACAGGATGAT-3’)；

TRPV3引物(SEQ ID NO.3：5’-CTGTTACTGGCCTATTATGTCATCCTCACCTTCGTC-3’和SEQID NO.4：5’-CTGCTGGAATCCTCGGCAGGCGAGGTATTCTTTGTA-3’)；

向PCR产物中加入Dpn1限制性内切酶，将PCR产物剩余模板去除。

通过DNA纯化试剂盒获得线性化TRPV1受体通道质粒。

引物设计在上游引物和下游引物的5’端加入与受体TRPV1嵌入部位同源的15bp碱基序列，通过PCR反应进行扩增：

50μl体系：2μl模板DNA、19μl去离子水、25μl 2×PrimerStar Max、2μl 5’PCR引物和2μl 3’PCR引物。

PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸9min，30个循环；72℃延伸5min。

将扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，使用琼脂糖凝胶纯化试剂盒获得纯化的TRPV3供体嵌入DNA片段(SEQ ID NO.5)：

TATGTCATCCTCACCTTCGTCCTCCTCCTCAACATGCTCATTGCCCTGATGGGGGAGACGGTGGAGAACGTCTCCAAAGAAAGTGAGCGGATCTGGCGCTTGCAGAGAGCCAGGACCATCTTGGAGTTTGAGAAAATGTTACCAGAATGGCTGAGAAGCAGATTCCGCATGGGCGAGCTGTGCAAAGTAGCAGATGAGGACTTCCGGCTGTGTCTGCGGATCAACGAGGTGAAGTGGACGGAATGGAAAACACACGTGTCCTTCCTTAATGAAGACCCGGGACCCATAAGACGGACAGCAGATTTAAACAAGATTCAAGATTCTTCCAGGAGCAATAGCAAAACCACCCTCTATGCGTTTGATGAATTAGATGAATTCCCAGAAACGTCGGTGTAG。

使用同源重组酶将线性化TRPV1受体通道质粒和TRPV3供体嵌入DNA片段发生同源重组环化过程。连接条件如下：线性化TRPV1受体通道DNA片段50ng，线性化TRPV3供体入DNA片段150ng，Exnase II 2μL，加ddH2O至10μL，37℃连接30min。将连接产物转化至100μL Dh5α感受态细胞中，涂板过夜培养后挑单克隆菌落，摇菌扩增培养后测序验证。

Ⅲ.mTRPV3点突变

利用点突变实验探究mTRPV3影响citrusinine-II的靶向结合位点。

所有突变mTRPV3通道全部使用同源重组方法构建，使用赛百盛公司Fasta快速定点突变试剂盒获得。具体实验操作步骤如下：

向质粒引入单碱基定点突变，设计一对引物：

突变5’引物(SEQ ID NO.6)：

GGGCTGGGCGGCTATGCTCTACTACACGAGAGGCTTCC；

突变3’引物(SEQ ID NO.7)：

AGTAGAGCATAGCCGCCCAGCCCAGGGCCATGGCCAGC；

将质粒进行反向PCR扩增，将1μl模板DNA序列、8.5μl去离子水、2μl 2×Max缓冲液、0.5μl dNTP混合物、1μl 5’PCR引物、1μl 3’PCR引物以及0.5μl DNA聚合酶离心管进行反应。

在PCR仪中按以下程序扩增：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸9min，30个循环；72℃延伸5min。

重组反应：吸取2μl Dpnl消化产物，2μl CEⅡ缓冲液，1μl ExnaseⅡ和5μl去离子水，37℃恒温反应30min后，冰水浴冷却5min。将连接产物转化至100μLDH5α感受态细胞中，涂板过夜培养后挑单克隆菌落，摇菌扩增培养后测序验证。

检测citrusinine-II对所有点突变mTRPV3通道2-APB激活的抑制活性，并比较citrusinine-II在野生型和各点突变通道上的抑制速率，Y564位置的氨基酸突变显著减弱citrusinine-II对mTRPV3通道2-APB激活的抑制。

实施例3

citrusinine-II在哺乳动物上的普适性

根据NCBI上现有参考基因组，合成人、大鼠和小鼠的TRPV3受体序列，受体序列信息表1。所有合成的cDNA都克隆在pEGFPN1质粒载体中。将mTRPV3等质粒瞬转过表达在HEK293T细胞系上。所有HEK293T细胞系均用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基加入10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，37℃，5％的CO₂孵育培养。全细胞膜片钳记录表明citrusinine-II能抑制不同物种TRPV3受体的2-APB激活。citrusinine-II作为不同物种的抑制剂，可以作为潜在的TRPV3通道疾病的药物和止痒剂、止疼剂。

表1人、大鼠和小鼠的TRPV3受体序列信息

图4中显示citrusinine-II抑制不同物种TRPV3通道2-APB激活，且呈现浓度依赖关系。

实施例4

citrusinine-II的止痒活性

Ⅰ.citrusinine-II辅助小鼠缓解慢性瘙痒

AEW皮肤瘙痒模型：实验前三天，使用电动剃毛器将C57BL/6小鼠的右侧后颈部的毛发剔除。将浸泡过丙酮乙醚(1:1)混合液棉花球敷于小鼠右侧后颈部15s，立刻用浸泡于双蒸水中的棉花球敷于同一位置30s，每日早晚分别处理一次，连续处理5天，对照组使用双蒸水涂抹小鼠右侧后颈部，处理时间和频率与实验组相同。第6天将小鼠放置于透明的观察笼，将小鼠随机分为五组。实验前1小时，水处理组小鼠剃毛部位皮下注射50μL DMSO(0.05％)，AEW处理小鼠分别在剃毛部位皮下注射50μL DMSO(0.05％)、50μLcitrusinine-II(5μM)、50μL citrusinine-II(10μM)，观察并统计小鼠在1小时内小鼠的瘙痒次数，以及用红外相机记录小鼠一小时内的总的运动距离。小鼠的前爪或后爪离开地面抓右侧后颈部用药处理部位直至爪子放回地面算一次搔抓行为。

AEW模型组小鼠皮肤出现明显的干燥、起皮屑以及严重的瘙痒行为(图5中A-B)。对其处理部位的HE染色，皮肤病理观察显示AEW型组小鼠的皮肤出现角化过度、表皮增生以及炎症显著增加的皮肤病变症状，水处理组小鼠皮肤组织无明显变化(图5中C-D)

AEW模型组小鼠1h内瘙痒次数63.6(n＝5)次显著高于水处理组5.0±0.6(n＝5)次。给予AEW模型组小鼠5和10μM citrusinine-II治疗后小鼠瘙痒抓挠行为数量显著降低减少至42.0(n＝5)和17.6(n＝5)次，citrusinine-II化合物可以剂量依赖性地减少小鼠自发抓挠行为。以上动物实验结果表明，citrusinine-II通过直接抑制TRPV3通道来减轻小鼠皮肤干燥引起的慢性瘙痒(图6)。

Ⅱ.citrusinine-II辅助小鼠缓解急性瘙痒

组胺引起的急性瘙痒模型(VEH，图5中A)：实验前三天，使用电动剃毛器将C57BL/6小鼠的右侧后颈部的毛发剔除。实验前1小时，将小鼠随机分为六组，对照组小鼠在剃毛部位皮下注射50μL DMSO(0.05％)，实验组小鼠分别在剃毛部位皮下注射50μL citrusinine-II(5μM)、50μL citrusinine-II(10μM)，然后在相同位置对照组分别注射生理盐水和50μL组胺(100μM)，实验组均注射50μL组胺(100μM)。观察并统计小鼠在30min内小鼠的瘙痒次数，小鼠的前爪或后爪离开地面抓右侧后颈部用药处理部位直至爪子放回地面算一次搔抓行为。

组胺皮内注射后30分钟内自发抓痒次数增加至64.8(n＝6次)，而空白组为13.7(n＝6)次。相反，不同浓度的citrusinine-II可以剂量依赖性地抑制组胺诱导的瘙痒行为。5μM和10μM citrusinine-II处理组小鼠的抓挠行为次数减少至31.0(n＝6)和12.0(n＝6)。以上实验结果进一步证实，citrusinine-II通过抑制TRPV3通道减轻组胺诱导的小鼠急性瘙痒行为(图6)。

实施例4

citrusinine-II的止痛活性

I.citrusinine-II辅助小鼠缓解福尔马林诱导的疼痛：造模前，分别给与小鼠腹腔注射吗啡、citrusinine-II(5μmol/kg、10μmol/kg、50μmol/kg)以及生理盐水等药物，30分钟后，小鼠右后足底注射20μl 0.92％(v/v)的福尔马林溶液。观察并统计小鼠在30min内小鼠的舔足行为。

足底注射福尔马林可以导致小鼠产生2期疼痛反应，I期疼痛(0-5min),属于神经疼痛，II期疼痛(15-30min),属于慢性疼痛。生理盐水对照组小鼠I期疼痛舔足时间为76.8s，5μmol/kg、10μmol/kg citrusinine-II和50μmol/kg处理组小鼠的舔足行为时间分别减少了4.43％、12.76％和51.82％(图7中A，n＝5)。此外，在II期疼痛中，5μmol/kg、10μmol/kg citrusinine-II和50μmol/kg处理组小鼠的舔足行为时间分别减少了4.24％、22.90％和58.34％(图7中A，n＝5)。

II.citrusinine-II辅助小鼠缓解醋酸诱导的疼痛：造模前，分别给与小鼠腹腔注射吗啡、citrusinine-II(5μmol/kg、10μmol/kg、50μmol/kg)以及生理盐水等药物，30分钟后，小鼠腹腔注射200μl 0.8％(v/v)的醋酸溶液。观察并统计小鼠在30min内小鼠的扭体次数。

腹腔注射5μmol/kg、10μmol/kg citrusinine-II和50μmol/kg citrusinine-II能分别减少22.62、42.86和45.24％的小鼠扭体疼痛行为(图7中B,n＝5)。

III.citrusinine-II辅助小鼠缓解热刺激诱导的疼痛:造模前，分别给与小鼠腹腔注射吗啡、citrusinine-II(5μmol/kg、10μmol/kg、50μmol/kg)以及生理盐水等药物，30分钟后，使用智能热板仪检测小鼠热痛抬脚反应时间，同时使用红外光照测痛仪检测小鼠热痛甩尾反应阈值。

在热板实验中，生理盐水对照组小鼠热痛抬脚反应时间为5s，腹腔注射5μmol/kg、10μmol/kg citrusinine-II和50μmol/kg能将小鼠的热痛抬脚反应时间从5s分别提高到7.8、10.8和13.8s(图7中C,n＝5)，同时能将热刺激诱发甩尾的反应时间从3.8s别提高到5.2、9.2和14s(图7中D,n＝5)。

上述小鼠相关行为学实验表明，通过给动物涂抹或者注射生理浓度的citrusinine-II，可以帮助动物缓解瘙痒和疼痛。citrusinine-II增强了小鼠等物种对瘙痒和疼痛的抵抗力，可以作为资源开发成一种潜在的止痒剂、止痛剂或护肤品，应用于人类和其它动物缓解瘙痒和疼痛。其次，citrusinine-II靶向作用于受体TRPV3，可以应用于相关离子通道病的研究及其作为潜在治疗药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> citrusinine-II在制备影响人和动物对痒和痛感知的试剂中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaatacctcg cctgccgagg attccagcag atgggc 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgaggatg acataatagg ccagtaacag gatgat 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgttactgg cctattatgt catcctcacc ttcgtc 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgctggaat cctcggcagg cgaggtattc tttgta 36

<210> 5

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatgtcatcc tcaccttcgt cctcctcctc aacatgctca ttgccctgat gggggagacg 60

gtggagaacg tctccaaaga aagtgagcgg atctggcgct tgcagagagc caggaccatc 120

ttggagtttg agaaaatgtt accagaatgg ctgagaagca gattccgcat gggcgagctg 180

tgcaaagtag cagatgagga cttccggctg tgtctgcgga tcaacgaggt gaagtggacg 240

gaatggaaaa cacacgtgtc cttccttaat gaagacccgg gacccataag acggacagca 300

gatttaaaca agattcaaga ttcttccagg agcaatagca aaaccaccct ctatgcgttt 360

gatgaattag atgaattccc agaaacgtcg gtgtag 396

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggctgggcg gctatgctct actacacgag aggcttcc 38

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtagagcat agccgcccag cccagggcca tggccagc 38