阅读说明：本技术 基于crispr技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其应用 (Signal amplification magnetic bead technology system for nucleic acid detection based on CRISPR technology and application thereof ) 是由 郑敦武 于 2020-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种报告磁珠,所述报告磁珠包括磁珠、核苷酸和高催化活性的酶相链接。本发明还公开了基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统,本发明还公开报告磁珠的构建方法以及应用。本发明通过引入报告磁珠,将信号放大磁珠技术系统的灵敏度从aM(1000-10000 copies/mL)浓度级别提高到zM(1-10 copies/mL)浓度级别。(The invention discloses a report magnetic bead, which comprises a magnetic bead, nucleotide and enzyme with high catalytic activity. The invention also discloses a signal amplification magnetic bead technology system for nucleic acid detection based on the CRISPR technology, and a construction method and application of the report magnetic bead. The invention improves the sensitivity of a signal amplification magnetic bead technical system from aM (1000-10000copies/mL) concentration level to zM (1-10copies/mL) concentration level by introducing the report magnetic bead.)

基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其应用。

背景技术

CRISPR核酸检测技术可以用于植物、动物、微生物、病毒等来源的DNA或RNA分子的检测。目前用于CRISPR核酸检测的蛋白有Cas13a、Cas12a、Cas14、Cas12b、Cas13b、Csm6等具有旁路核酸切割活性的Cas蛋白。

Cas13a蛋白分子：识别特异性的单链RNA分子，激活旁路核酸切割活性，非特异性地切割任意单链RNA分子。

crRNA核酸分子可以和Cas13a蛋白分子结合，形成crRNA-Cas13a复合体。当crRNA核酸分子与目标RNA分子匹配时，Cas13a会对目标RNA进行特异性切割，并因此而激活Cas13a的旁路核酸切割活性，对所遇到的任意单链RNA分子进行高效的非特异性切割。一个目标RNA分子可以激活一个Cas13a蛋白，激活后的Cas13a蛋白可以切割大量的任意单链RNA分子。利用Cas13a蛋白的这个特点可以用于特异性的检测某一段RNA序列。针对目标RNA分子，设计特异性结合的crRNA。反应体系中加入待检测的RNA分子，特异性的crRNA分子，Cas13a蛋白分子，以及报告RNA分子。常用的一种报告RNA分子是一段寡核苷酸：一端附有一个荧光基团(HEX)，另一端有一个淬灭基团(BHQ1)。由于淬灭作用，一个完整的报告RNA分子不会发出荧光。当待检测的RNA分子与crRNA-Cas13a匹配时，crRNA-Cas13a才会对待检测的RNA分子进行特异性切割，并激活Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性(旁路核酸切割活性)，进而切割报告RNA分子，使荧光基团摆脱了淬灭基团的作用，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出是否有目标RNA分子的存在。假如体系中不存在目标RNA分子时，报告分子的荧光基因不会亮。只有当体系中存在目标RNA分子，Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性(旁路核酸切割活性)被激活，荧光素摆脱了淬灭基团的作用，才能发出荧光信号。其检测灵敏度可以达到nM(10^-9M)浓度级别。

为了提高检测灵敏度，需要在进行Cas13a反应前先将待检测分子进行核酸扩增，常用的核酸扩增的方法有：RPA扩增、LAMP扩增、PCR扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2等。经过扩增富集后的待检测分子再进行Cas13a反应，其检测灵敏度可以达到aM(10^-18M)浓度级别，也就是1000-10000copies/mL。

Cas13a蛋白可以用于检测RNA分子，也可以用检测DNA分子。如果待检测分子是DNA，DNA分子经过RPA扩增富集得到大量的双链DNA分子。如果待检测分子是RNA，RNA经过逆转录成为cDNA后再经过RPA扩增(RT-RPA)富集得到大量的双链DNA分子。经过RPA扩增或者RT-RPA扩增后，待检测分子得到大量富集，变成双链DNA分子，这是第一轮信号放大。双链DNA分子经过体外转录(如：T7转录)变成单链RNA分子。当单链RNA分子与crRNA-Cas13a匹配时，crRNA-Cas13a对RNA分子进行特异性切割，并激活Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性(旁路核酸切割活性)，进而切割报告RNA分子，使荧光基团摆脱了淬灭基团的作用，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出是否有目标分子的存在。一个Cas13a分子可以切割大量的报告RNA分子，这是第二轮信号放大。通过两轮的信号放大(核酸扩增+Cas13a切割)，检测灵敏度可以达到aM(10^-18M)浓度级别，也就是1000-10000copies/mL。

其流程为：

待检测DNA分子＞＞＞核酸扩增＞＞＞体外转录＞＞＞Cas13a切割报告RNA分子＞＞＞释放荧光；或者待检测RNA分子＞＞＞逆转录＞核酸扩增＞＞＞体外转录＞＞＞Cas13a切割报告RNA分子＞＞＞释放荧光

Cas12a蛋白分子：识别特异性的单链DNA分子或者双链DNA，激活旁路核酸切割活性，非特异性地切割任意单链DNA分子；

Cas12a系统与Cas13a系统的区别是：Cas12a特异性识别的是单链DNA分子或者是双链DNA分子；非特异性切割的是单链DNA分子。因而Cas12a体系中的报告分子需要换成单链DNA分子。

crRNA核酸分子可以和Cas12a蛋白分子结合，形成crRNA-Cas12a复合体。当crRNA核酸分子与目标DNA分子(单链DNA或者双链DNA)匹配时，Cas12a会对目标DNA(单链DNA或者双链DNA)进行特异性切割，并因此而激活Cas12a的旁路核酸切割活性，对所遇到的任意单链DNA分子进行高效的非特异性切割。一个目标DNA分子可以激活一个Cas12a蛋白，激活后的Cas12a蛋白可以切割大量的任意单链DNA分子。因而Cas12a体系中的报告分子需要换成单链DNA分子，报告DNA分子的一端附有一个荧光素，另一端有一个淬灭剂，其作用原理与Cas13a类似。

由于Cas12a可以识别双链DNA分子，因此，RPA扩增后可以直接用于Cas12a切割反应，不需要进行体外转录。

其流程为：待检测DNA分子＞＞＞核酸扩增(如RPA扩增)＞＞＞Cas12a切割报告DNA分子＞＞＞释放荧光；或者待检测RNA分子＞＞＞逆转录＞核酸扩增(如RPA扩增)＞＞＞Cas12a切割报告DNA分子＞＞＞释放荧光。

Cas14蛋白分子：识别特异性的单链DNA，激活旁路核酸切割活性，非特异性地切割任意单链DNA分子。Cas14系统与Cas13a系统的区别是：Cas14特异性识别的是单链DNA分子；非特异性切割的是单链DNA分子。Cas14体系中的报告分子是单链DNA分子。

crRNA核酸分子可以和Cas14蛋白分子结合，形成crRNA-Cas14复合体。当crRNA核酸分子与目标单链DNA分子匹配时，Cas14会对目标单链DNA分子进行特异性切割，并因此而激活Cas14的旁路核酸切割活性，对所遇到的任意单链DNA分子进行高效的非特异性切割。一个目标单链DNA分子可以激活一个Cas14蛋白，激活后的Cas14蛋白可以切割大量的任意单链DNA分子。Cas14体系中的报告分子为单链DNA分子，报告DNA分子的一端附有一个荧光素，另一端有一个淬灭剂，其作用原理与Cas13a类似。

由于Cas14识别的是单链DNA分子，因此，RPA扩增后的双链DNA需要进行单链化处理(例如可以采用T7外切酶降解法获得单链DNA)后，再进行Cas14切割反应。

其流程为：待检测DNA分子＞＞＞核酸扩增(如RPA扩增)＞＞＞单链化处理＞＞＞Cas14切割报告DNA分子＞＞＞释放荧光；或者待检测RNA分子＞＞＞逆转录＞核酸扩增(如RPA扩增)＞＞＞单链化处理＞＞＞Cas14切割报告DNA分子＞＞＞释放荧光。

Cas12b、Cas13b、Csm6与上述的Cas蛋白原理相似，不再叙述；但无论是Cas13a、Cas12a、Cas14、Cas12b、Cas13b还是Csm6，其对核酸的检测灵敏度只能达到aM(10^-18M)浓度级别(也就是1000-10000copies/mL)，当待检测分子浓度低于1000copies/mL时，很容易发生漏检的情况造成假阴性。很多临床检测需要达到zM(10^-21M)浓度级别(也就是1-10copies/mL)的灵敏度才能满足要求。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提高现有基于CRISPR技术的特异性核酸检测的灵敏度，将灵敏度从aM(1000-10000copies/mL)浓度级别提高到zM(1-10copies/mL)浓度级别。为了实现本发明的目的，本发明在原有的核酸扩增和Cas蛋白非特异性任意切割的两轮信号放大基础上引入催化酶作为第三级信号放大系统，因此，本发明提供了基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统。本发明还提供了利用上述系统识别目的核苷酸分子方法，从各种来源样品中检测目的核苷酸序列分子，并构建起各种检测试剂盒及方法。本发明的细胞检测技术实现高灵敏度检测，可进行大量样品和含量极低的核酸分子进行检测，灵敏度高。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种报告磁珠，所述报告磁珠包括磁珠、核苷酸和高催化活性的酶相连接。

其中，所述核苷酸为单链DNA、双链DNA或单链RNA中的一种或几种。

其中，所述核苷酸为生物素连接的ssDNA。

其中，所述ssDNA分子的两端分别用地高辛和生物素标记。

其中，所述高催化活性的酶包括但不仅限于β-Gal酶，β-Gal酶也可以置换成HRP(辣根过氧化物酶)，从而通过肉眼观察颜色变化即可判断样品中是否含有目标分子，摆脱对荧光测量仪器的依赖，用于社区的快速筛查。β-Gal酶也可以置换成AP(碱性磷酸酶)等其它磷酸酶、羧酸酯水解酶、糖苷水解酶、蛋白酶；β-Gal酶也可以置换成酪氨酸酶、单胺氧化酶、硝基还原酶(NTR)及硫氧还蛋白还原酶等氧化还原酶；β-Gal酶也可以置换成γ-谷氨酰转移酶(GGT)等转移酶。

其中，用链霉亲和素标记β-Gal酶(β-半乳糖苷酶)，通过链霉亲和素-生物素的相互作用，将β-Gal酶偶联到单链DNA(或RNA)分子的另一端，游离端。

本发明内容还包括所述的报告磁珠的构建方法，包括以下步骤：将磁珠与核苷酸通过共价键方式链接得到核苷酸-磁珠，通过链霉亲和素和生物素将高催化活性的酶和核苷酸-磁珠链接。

本发明内容还包括基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统，所述信号放大磁珠技术系统包含所述的报告磁珠。

本发明内容还包括所述的报告磁珠或所述的信号放大磁珠技术系统在制备核酸检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明内容还包括一种核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的报告磁珠或所述的信号放大磁珠技术系统。

本发明内容还包括一种基于CRISPR技术的超高灵敏度核酸检测方法，包括以下步骤：

1)将病毒液进行热灭活和裂解，释放病毒的RNA分子，使用纳米核酸磁珠提取病毒悬液中RNA分子，将提取磁珠加入RT-PRA等温扩增的反应体系中，对靶分子进行RT-RPA扩增，获得第一级的信号扩大；

2)将第一级的信号扩大获得的DNA分子使用原来的纳米磁珠进行第二次提取，并将DNA分子加入具备旁切割活性的CRISPR蛋白特异性识别切割病毒靶DNA分子，并激活具备旁切割活性的CRISPR蛋白的非特异切割活性，启动第二级的信号放大；

3)在反应体系中加入所述的报告磁珠，在具备旁切割活性的CRISPR蛋白的非特异切割活性切断ssDNA释放游离的高催化活性的酶到体系上清中，使用磁铁吸附所有的磁珠，取出含有游离高催化活性的酶的上清加入荧光底物反应，使用酶标仪进行读数检测，得出检测结果。

其中，所述具备旁切割活性的CRISPR蛋白为Cas13a、Cas12a、Cas14、Cas12b、Cas13b、Csm6中的一种或几种。

本发明不仅限于在Cas12a上的使用，Cas13a、Cas14、Cas12b、Cas13b、Csm6等具有旁路核酸切割活性的Cas蛋白同样适用；同样亦适用于动物、植物、微生物等的核酸检测。

其中，所述酶催化底物包括但不仅限于底物FDG[Fluorescein di-beta-D-galactopyranoside]，CAS#：17817-20-8，FDG比放射性标记检测还要敏感100-1000倍，可以被用于单酶分子的检测，是一种高敏感的β-半乳糖苷酶的荧光底物。底物反应是：先FDG转化为FMG(反应效率1.9μmole min^-1mg^-1)在有FMG转化为荧光信号(反应效率22.7μmole min^-1mg^-1)。

当Cas蛋白对单链DNA(或RNA)分子产生切割后，β-Gal酶从磁珠上脱落下来。收集上清液中的β-Gal酶并转移到含有β-Gal荧光探针的反应液中，一个β-Gal酶分子可以催化产生2000-3000个荧光分子。使得检测信号得到第三级放大，实现zM(1-10copies/mL)浓度级别的检测灵敏度。(第一级放大核酸扩增；第二级扩大Cas蛋白对DNA(或RNA)分子的切割放大；第三级放大通过β-Gal酶分子对分子底物的酶作用。

本发明的信号放大磁珠技术系统中，通过在磁珠表面通过固定化将核苷酸固定于磁珠表面，且所述核苷酸一端固定在磁珠表面一端固定有高催化活性的酶，具有旁切割活性的CRISPR蛋白与gRNA分子或crRNA分子结合成为一个具备特异性识别特定序列并可以被特定核苷酸分子激活旁切割活性的蛋白核酸复合物。该蛋白核酸复合物可以对磁珠表面固定的核苷酸序列进行非特异的切割，并将高活性的酶释放到溶液体系中，而未释放的酶可以通过磁珠去除，最后通过加入荧光底物对释放到溶液中的酶进行检测，从而实现对目的核苷酸序列的检测。

作为优选地，本发明的“三级信号放大”是指：第一级放大RPA等温扩增；第二级扩大Cas12a对ssDNA分子的切割放大；第三级放大通过β-半乳糖苷酶分子对荧光探针分子的酶作用。本发明使用Cas12a，可以识别和非特异切割单链“DNA”分子，一个是DNA分子更稳定，同时可以针对不同的病毒或者靶分子，设计不同的crRNA就可以不同检测的特异性问题。本发明的CRISPR分子诊断技术具有“高特异性”，只要存在一个或以上碱基的错配就不能引起Cas蛋白的切割反应，而“高灵敏度”的解决则是本发明创新性的引进的“三级信号放大”方法：RT-RPA等温扩增、Cas12a非特异切割活性、“β-半乳糖苷酶：FDG荧光探针”，此步骤的信号比放射性标记技术要敏感100-1000倍。

本发明最后一级的β-半乳糖苷酶信号检测比之前其他CRISPR核酸检测单位使用的“荧光-DNA-淬灭基团”法，要多出一级酶促反应的分子信号放大，而β-半乳糖苷酶催化底物的能力比Cas12a切割效率要高很多。

整个反应中涉及的纳米磁珠核酸提取技术成熟，易于自动化操作，相关的磁珠提取自动化设备价格低廉，如果批次量少也可以手工操作，也非常简单，只需要有磁力棒即可。而使用了第一次提取病毒的RNA分子，将可以使所有的病毒核酸都被充分利用；第二次提取的RT-RPA等温扩增的DNA分子，可以保证所有的特异激活分子被完全收集，提高检测灵敏度。

而后续使用报告磁珠：磁珠-核酸DNA-β-半乳糖苷酶，由于Cas12a的非特异切割，可以释放大量的游离β-半乳糖苷酶，同时由于有磁珠的帮助我们可以把反应体系控制在20μL-200μL，从而将磁珠上面切割DNA释放的β-半乳糖苷酶浓度大幅提高，在加入反应底物FDG，经过孵育就可以直接使用酶标仪进行读数，将其灵敏度提高到zM(5-50copies/mL)级别。

作为优选地，本发明还公开了一种基于CRISPR技术的超高灵敏度核酸检测方法，包括以下步骤：

1)将病毒液进行热灭活和裂解，释放病毒的RNA分子，使用纳米核酸磁珠提取病毒悬液中RNA分子，将提取磁珠加入RT-PRA等温扩增的反应体系中，对靶分子进行RT-RPA扩增，获得第一级的信号扩大；

2)将第一级的信号扩大获得的DNA分子使用原来的纳米磁珠进行第二次提取，并将DNA分子加入Cas12a特异性识别切割病毒靶DNA分子，并激活Cas12a的非特异切割活性，启动第二级的信号放大；一个特异切割激活的Cas12a分子可以非特异切割10^8-9个核酸分子。经过两轮信号放大，此阶段检测灵敏度可以达到1-10aM级别；

3)在反应体系中加入携带报告“ssDNA-β-半乳糖苷酶”报告磁珠，在Cas12a的非特异切割活性切断ssDNA释放游离的β-半乳糖苷酶到体系上清中，使用磁铁吸附所有的磁珠，取出含有游离β-半乳糖苷酶的上清加入底物反应，使用酶标仪进行读数检测，得出检测结果。

由于Cas12a的非特异切割，可以释放出β-半乳糖苷酶，同时由于有磁珠的帮助我们可以把反应体系控制在20μL-200μL，从而将磁珠上面切割DNA释放的β-半乳糖苷酶浓度大幅提高，再加入反应底物FDG荧光探针，一个β-半乳糖苷酶可以催化10^3～4个FDG释放出荧光，经过孵育就可以直接使用酶标仪进行读数，其信号经过第三级扩大，这个时候一个RNA病毒分子已经将扩大可检测的荧光信号分子为：10^19～21，其灵敏度可以达到1～10zM级别。这个时候一个RNA病毒分子已经将扩大可检测的荧光信号分子为：10^19-21，其灵敏度可以达到1～10zM级别。

第一级放大中，除了所述的RT-RPA等温扩增，还可以采用其它核酸扩增方式，包含但不仅限于：LAMP扩增、PCR扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2等。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明在核酸扩增和Cas蛋白非特异性任意切割的两轮信号放大基础上引入第三级信号放大系统(报告磁珠)，将灵敏度从aM(1000-10000copies/mL)浓度级别提高到zM(1-10copies/mL)浓度级别。

附图说明

图1、传统报告分子的结构；

图2、以基于Cas12a系统所构建的冠状病毒RNA检测方法示意图；

图3本发明工作原理示意图；

图4本发明的放大系统的工作原理示意图；

图5本发明报告磁珠的作用原理示意图；

图6本发明的信号放大磁珠技术系统的的检测过程示意图；

图7本发明实施例1的实验结果图；

图8本发明实施例2的实验结果图；

图9本发明实施例3的实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

假病毒：假病毒(pseudovirus)又称“伪病毒”，是一类嵌合型病毒颗粒，是在一种复制缺陷型病毒(病毒载体)的表面上表达另一种病毒的重组糖蛋白的嵌合病毒颗粒，可用作核酸检测对照样品。如COVID-19研究所用假病毒是将SARS-CoV-2特定核酸序列包装到逆转录病毒或噬菌体内，构建一个蛋白质包裹RNA的结构，RNA提取效果理论上和原病毒一致。本发明所有核苷酸序列的合成是由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。报告磁珠的合成是由海狸生物科技有限公司完成。

实施例1：

以基于Cas12a的信号放大磁珠技术系统所构建的冠状病毒RNA检测方法为例说明具体技术方案：

1、检测样品：假病毒(对照品)

产品名称：COVID-19-pseudovirus(2019-nCOV假病毒)

产品编号：11900ES08(上海翊圣生物科技有限公司)

规格：5×1mL

靶值＝1×10⁸copies/mL

2、待检测序列：

GGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATC

3、等温扩增引物合成

RPA-F引物：GGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC

RPA-R引物：GATGTCAAAAGCCCTGTATACGACATCAGTAC

4、crRNA的设计并合成

设计并合成得到crRNA序列：AGACGGGCTGCACTTACACCG，

5、报告磁珠的设计与制备

5.1报告DNA的设计并合成设计并合成报告DNA分子1：5′-/HEX/AATGGCAAATGGCA/BHQ1/-3′(对照组，用来检测现有CRISPR核酸检测技术(两级信号放大)的效果)

设计并合成报告DNA分子2：5′-/氨基/AATGGCAAATGGCA/3Bio_SA_β-Gal/-3′

5.2报告磁珠的设计与制备

将报告DNA分子2共价结合到磁珠上，得到报告磁珠：

磁珠(羧基)-/5’氨基/AATGGCAAATGGCA/3’Bio_SA_β-Gal(实验组，用来检测本发明改良的CRISPR核酸检测技术(三级信号放大)的效果)

6、LbCas12a蛋白

质粒：pMBP-LbCas12a；

来源：Chen et al Science.2018Apr 27；360(6387)：436-439.

7、假病毒RNA提取

7.1将假病毒进行梯度稀释，分别稀释成以下6个浓度梯度：

500000copies/mL(800aM)；50000copies/mL(80aM)；5000copies/mL(8aM)；500copies/mL(800zM)；50copies/mL(80zM)；5copies/mL(8zM)

7.2经过上述7.1得到的6个浓度梯度的假病毒样品，分别取1mL进行核酸提取；每个浓度梯度分别进行两份平行实验，共获得6个浓度假病毒的12份核酸样品。

核酸提取试剂盒：病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)

品牌：海狸生物

货号：70406-20

8、等温扩增(RT-RPA)

RPA试剂盒：TwistAmp Basic RT

品牌：TwistDx

货号：TABSRT01KIT

将经过上述7.2提取得到的6个浓度假病毒的12份RNA分别进行等温扩增(RT-RPA)，

反应体系：总反应体积100μL；RPA-F引物0.48μM；RPA-R引物0.48μM；1×rehydration buffer；4mM醋酸镁；RPA Mix以及经过7.2步骤提取的病毒RNA。

反应温度：37℃。

反应时间：10min。

9、将上述步骤8获得的6个浓度假病毒的12份等温扩增产物进行浓缩纯化，浓缩纯化试剂：扩增产物纯化试剂(磁珠法)

品牌：海狸生物

货号：PCR-5G

10、Cas12a切割反应

将上述步骤9获得的6个浓度假病毒的12份纯化产物分成对照组和实验组两组。

对照组：

反应体系：经过步骤9得到的6个浓度假病毒的纯化产物；0.5μM pMBP-LbCas12a；1uM crRNA；1μM报告DNA分子1；总反应体积50μL。

反应温度：37℃。

反应时间：30min。

实验组：

反应体系：经过步骤9得到的6个浓度假病毒的纯化产物；0.5μM LbCas12a；1μMcrRNA；报告磁珠(含1μM报告DNA分子2)；总反应体积50μL。

反应温度：37℃。

反应时间：30min。

11、测定对照组的荧光信号

将对照组的50μL反应液加入到96孔板中，用酶标仪检测荧光信号(激发光535nm，发射光556nm)

12、收集实验组的上清

Cas12a的非特异切割活性切断磁珠上的报告DNA分子2，并释放出游离的β-半乳糖苷酶到体系上清中，使用磁力棒吸附所有的磁珠，取出含有游离β-半乳糖苷酶的上清。

13、取出实验组上清进行酶促反应

反应体系：100mM磷酸钠；1mM MgCl₂；50mMβ-巯基乙醇；3mg/mL FDG；50μL上述步骤12的上清；总反应体系100μL。

反应温度：室温

反应时间：15min

14、测定实验组的荧光信号

将实验组的上述步骤13的100μL反应液加入到96孔板中，用酶标仪检测荧光信号(激发光485nm，发射光530nm)

15、实验结果(如图7)

1)、采用二级信号放大系统，检测下限为5000copies/mL，5000copies/mL浓度以下的样品几乎采集不到荧光信号。

2)、采用三级信号放大系统，检测下限可以达到5copies/mL；与原有的二级信号放大技术相比(5000copies/mL)，检测灵敏度提高了1000倍。灵敏度从aM级别提高到了zM级别。

3)、在高浓度样品中，荧光信号值都趋近饱和，因而，二级信号放大系统和三级信号放大系统所采集到的荧光信号值差距不是很大。但随着样品浓度的降低，两种信号放大系统所采集到的荧光信号值差距越来越大。

实施例2：

以基于Cas13a的信号放大磁珠技术系统所构建的沙门氏菌DNA检测方法为例说明具体技术方案：

1、检测样品：沙门氏菌标准质粒(对照品)

沙门氏菌标准质粒制备过程：选取沙门氏菌inv A基因(GenBank：KJ718885.1)作为特异性检测片段，将大小为287bp的inv A基因片段连接到pMD19-T载体中，构建标准品质粒。

规格：10×1mL

靶值＝5×10¹⁰copies/mL

2、待检测序列：

TGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGGTATTGACGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGAGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAA

3、等温扩增引物的设计与合成

RPA-F引物：TTCGGGCAATTCGGTATTGACGATAGCC

RPA-R引物：TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGCTGG

4、crRNA的设计与合成

设计并合成crRNA：TTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTAT

5、报告磁珠的设计与制备

5.1报告RNA的设计与合成

设计并合成报告RNA分子1：5′-/HEX/AAUGGCAAAUGGCA/BHQ1/-3′(对照组，用来检测现有CRISPR核酸检测技术(两级信号放大)的效果)

设计并合成报告RNA分子2：5′-/氨基/AAUGGCAAAUGGCA/3Bio_SA_β-Gal/-3′

5.2报告磁珠的设计与制备将报告RNA分子2共价结合到磁珠上，得到报告磁珠：

磁珠(羧基)-/5’氨基/AAUGGCAAAUGGCA/3’Bio_SA_β-Gal(实验组，用来检测本发明改良的CRISPR核酸检测技术(三级信号放大)的效果)

6、LwaCas13a蛋白

品牌：上海惠诚生物

货号：KX-E-003；

规格：500pmol/100μL.

7、沙门氏菌标准质粒稀释

将沙门氏菌标准质粒进行梯度稀释，分别稀释成以下6个浓度梯度，每个浓度梯度分别保留两份样品进行平行实验：

100000copies/mL(160aM)；10000copies/mL(16aM)；1000copies/mL(1.6aM)；100copies/mL(160zM)；10copies/mL(16zM)；1copies/mL(1.6zM)

8、等温扩增(RPA)

RPA试剂盒：TwistAmp Basic

品牌：TwistDx

货号：TABAS03KIT

将经过上述步骤7得到的6个浓度沙门氏菌标准质粒的12份DNA分别进行等温扩增(RPA)；

反应体系：总反应体积100μL；RPA-F引物0.48μM；RPA-R引物0.48μM；1×rehydration buffer；4mM醋酸镁；RPA Mix以及经过步骤7获得的沙门氏菌标准质粒样品。

反应温度：37℃。

反应时间：10min。

9、将上述步骤8获得的6个浓度沙门氏菌标准质粒的12份等温扩增产物进行浓缩纯化，

浓缩纯化试剂：扩增产物纯化试剂(磁珠法)

品牌：海狸生物

货号：PCR-5G

10、Cas13a切割反应

将上述步骤9获得的6个浓度沙门氏菌标准质粒的12份纯化产物分成对照组和实验组两组。

对照组：

反应体系：经过步骤9得到的6个浓度沙门氏菌标准质粒的纯化产物；0.5μMLwaCas13a；1μM crRNA；1μM报告RNA分子1；总反应体积50μL。

反应温度：37℃。

反应时间：30min。

实验组：

反应体系：经过步骤9得到的6个浓度沙门氏菌标准质粒的纯化产物；0.5μMLwaCas13a；1μM crRNA；报告磁珠(含1μM报告RNA分子2)；总反应体积50μL。

反应温度：37℃。

反应时间：30min。

11、测定对照组的荧光信号

将对照组的50μL反应液加入到96孔板中，用酶标仪检测荧光信号(激发光535nm，发射光556nm)

12、收集实验组的上清

Cas13a的非特异切割活性切断磁珠上的报告RNA分子2，并释放出游离的β-半乳糖苷酶到体系上清中，使用磁力棒吸附所有的磁珠，取出含有游离β-半乳糖苷酶的上清。

13、取出实验组上清进行酶促反应

反应体系：100mM磷酸钠；1mM MgCl₂；50mMβ-巯基乙醇；3mg/mL FDG；50μL上述步骤12的上清；总反应体系100uL。

反应温度：室温

反应时间：15min

14、测定实验组的荧光信号

将实验组的上述步骤13的100uL反应液加入到96孔板中，用酶标仪检测荧光信号(激发光485nm，发射光530nm)

15、实验结果(如图8)

1)、采用二级信号放大系统，检测下限为1000copies/mL，1000copies/mL浓度以下的样品几乎采集不到荧光信号。

2)、采用三级信号放大系统，检测下限可以达到1copies/mL；与原有的二级信号放大技术相比(1000copies/mL)，检测灵敏度提高了1000倍。灵敏度从aM级别提高到了zM级别。

3)、在高浓度样品中，荧光信号值都趋近饱和，因而，二级信号放大系统和三级信号放大系统所采集到的荧光信号值差距不是很大。但随着样品浓度的降低，两种信号放大系统所采集到的荧光信号值差距越来越大。

实施例3

以基于Cas12a的信号放大磁珠技术系统所构建的疫区水样中是否含有曼氏血吸虫的检测方法为例说明具体技术方案：

1、待检测样品分别为：已确认被曼氏血吸虫微量污染的水样(A)、已确认被曼氏血吸虫中度污染的水样(B)、已确认不含有曼氏血吸虫的水样(C)、曼氏血吸虫样品(D)

2、待测样品的DNA提取：提取得到A、B、C、D四种DNA样品；

3、待检测序列

CCTTCGGGCATTGCTGAGTGTGGTCGGTTTGTTACTAGCTTCGGCTGGTCGGCTGATGGCTTGGTTTTGTCACGTCGGCGGTTGCGTGTGTGGTTTGCATTGGGCCAATAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACGATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTTTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGTGTTACGAAACCCAAAGGCGAAGTGAAGGTAAAGGTTCGGCTTGTCCGGACTAAGGT

4、等温扩增引物的设计与合成

RPA-F引物：CCTTCGGGCATTGCTGAGTGTGGTCGG

RPA-R引物：CTTCACTTCGCCTTTGGGTTTCGTAACAC

crRNA的设计与合成

设计并合成crRNA：TTGAAACACGGACCAAGGAG

5、报告磁珠制备

5.1报告DNA的设计与合成

设计并合成报告DNA分子1：5′-/HEX/AATGGCAAATGGCA/BHQ1/-3′(对照组，用来检测现有CRISPR核酸检测技术(两级信号放大)的效果)

设计并合成报告DNA分子2：5′-/氨基/AATGGCAAATGGCA/3Bio_SA_β-Gal/-3′

5.2报告磁珠的设计与制备

将报告DNA分子2共价结合到磁珠上，得到报告磁珠：

磁珠(羧基)-/5’氨基/AATGGCAAATGGCA/3’Bio_SA_β-Gal(实验组，用来检测本发明改良的CRISPR核酸检测技术(三级信号放大)的效果)

6、AsCas12a蛋白

品牌：美格生物

货号：C001S；

规格：100pmol/50μL

7、等温扩增(RPA)

RPA试剂盒：TwistAmp Basic

品牌：TwistDx

货号：TABAS03KIT

将步骤2得到的A、B、C、D四种DNA样品分别进行等温扩增(RPA)，反应体系：总反应体积100μL；RPA-F引物0.48μM；RPA-R引物0.48μM；1×rehydration buffer；4mM醋酸镁；RPAMix以及经过步骤7获得的沙门氏菌标准质粒样品。

反应温度：37℃。

反应时间：10min。

8、将上述步骤7获得的等温扩增产物进行浓缩纯化，

浓缩纯化试剂：扩增产物纯化试剂(磁珠法)

品牌：海狸生物

货号：PCR-5G

9、Cas12a切割反应

将上述步骤8获得的纯化产物进行Cas12a切割反应

反应体系：经过步骤8得到的纯化产物；50-100nMAsCas12a；10-50nM crRNA；40nM报告DNA分子1；总反应体积50uL。

反应温度：37℃。

反应时间：30min。

10、收集反应体系的上清

Cas12a的非特异切割活性切断磁珠上的报告DNA分子2，并释放出游离的β-半乳糖苷酶到体系上清中，使用磁力棒吸附所有的磁珠，取出含有游离β-半乳糖苷酶的上清。

11、取出上清进行酶促反应

反应体系：100mM磷酸钠；1mM MgCl₂；50mMβ-巯基乙醇；3mg/mL FDG；50μL上述步骤10的上清；总反应体系100uL。

反应温度：室温

反应时间：15min

12、测定荧光信号

将实验组的上述步骤11的100μL反应液加入到96孔板中，用酶标仪检测荧光信号(激发光485nm，发射光530nm)

13、实验结果(如图9)

1)采用二级信号放大系统，不能检测出水样中的曼氏血吸虫微量污染。

2)采用三级信号放大系统，可以有效的检测出水样中的曼氏血吸虫微量污染。

3)样品中DNA浓度较高时，两种系统的荧光信号值差异不明显。

序列表

<110> 苏州顶点生物医药有限公司

<120> 基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 155

<212> DNA

<213> 2019-nCOV假病毒(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttatggct gtagttgtga tcaactccgc gaacccatgc ttcagtcagc tgatgcacaa 60

tcgtttttaa acgggtttgc ggtgtaagtg cagcccgtct tacaccgtgc ggcacaggca 120

ctagtactga tgtcgtatac agggcttttg acatc 155

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-F引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttatggct gtagttgtga tcaactccgc 30

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> RPA-R 引物(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgtcaaaa gccctgtata cgacatcagt ac 32

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> crRNA序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agacgggctg cacttacacc g 21

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> DNA分子(Artificial Sequence)

<400> 5

aatggcaaat ggca 14

<210> 6

<211> 287

<212> DNA

<213> 沙门氏菌inv A基因(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgaaatta tcgccacgtt cgggcaattc ggtattgacg atagcctggc ggtgggtttt 60

gttgtcttct ctattgtcac cgtggtccag tttatcgtta ttaccaaagg ttcagaacgc 120

gtcgcggaag tcgcggcccg attttctctg gatggtatgc ccggtaaaca gatgagtatt 180

gatgccgatt tgaaggccgg tattattgat gcggatgccg cgcgcgaacg gcgaagcgta 240

ctggaaagag aaagccagct ttacggttcc tttgacggtg cgatgaa 287

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcgggcaat tcggtattga cgatagcc 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgcaccgtc aaaggaaccg taaagctgg 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgatgccga tttgaaggcc ggtattat 28

<210> 10

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aauggcaaau ggca 14

<210> 11

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccgggcagc gaggggcggg acagccggcg gcggcgaggc gggcacgcgg cgggcggggg 60

gcagggccaa agcggggagg gagacgacca ccgacccgcg aaacacggac caaggagaac 120

aggcgcgagc aggggacgaa acccaaaggc gaaggaagga aaggcggcgc cggacaagg 179

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttcgggca ttgctgagtg tggtcgg 27

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttcacttcg cctttgggtt tcgtaacac 29

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgaaacacg gaccaaggag 20

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aatggcaaat ggca 14