阅读说明：本技术 一种提取分离纯化神秘果素的方法 (Method for extracting, separating and purifying miraculin ) 是由 涂行浩 张秀梅 杜丽清 陈妹 邓旭 陈海芳 张明 马智玲 于 2020-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提取分离纯化神秘果素的方法,该方法主要利用磁性纳米颗粒对神秘果果实中含有的功能活性成分——神秘果素进行一步提取分离纯化。主要技术步骤为磁性纳米颗粒加入到神秘果素粗提液的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.0)中,在20℃下吸附24～72h后达到饱和,吸附饱和的磁性纳米颗粒加入磷酸盐缓冲液(pH＝4.5),于37℃脱附24h；经磁性分离得到脱附液,通过10～15kDa的超滤膜,取截留液,冷冻干燥得到纯度为90％以上的神秘果素粉末；该方法将提取分离与纯化一步完成,方法简单,条件温和,对神秘果素的活力影响较小,回收率较高。另外,吸附饱和的磁性纳米颗粒经洗脱分离出神秘果素后,经简单处理可用于下一次的吸附分离过程,多次重复利用基本不影响对神秘果素的分离效率。(The invention discloses a method for extracting, separating and purifying miraculin, which mainly utilizes magnetic nanoparticles to extract, separate and purify functional active ingredient, namely miraculin, contained in miraculin in one step. The main technical steps comprise that magnetic nanoparticles are added into a Tris-HCl buffer solution (pH 7.0) of a crude miraculin extract, the mixture is adsorbed at the temperature of 20 ℃ for 24-72 hours and then is saturated, phosphate buffer solution (pH 4.5) is added into the magnetic nanoparticles with the saturated adsorption, and the mixture is desorbed at the temperature of 37 ℃ for 24 hours; carrying out magnetic separation to obtain desorption solution, passing through a 10-15 kDa ultrafiltration membrane, taking trapped fluid, and carrying out freeze drying to obtain miraculin powder with the purity of more than 90%; the method completes extraction, separation and purification in one step, and has the advantages of simple process, mild conditions, little influence on the activity of miraculin, and high recovery rate. In addition, after the miraculin is separated from the magnetic nanoparticles with saturated adsorption through elution, the magnetic nanoparticles can be used for the next adsorption separation process through simple treatment, and the separation efficiency of the miraculin is basically not influenced through repeated utilization for many times.)

一种提取分离纯化神秘果素的方法

技术领域

本发明涉及食品深加工技术领域，尤其涉及一种提取分离纯化神秘果素的方法。

背景技术

神秘果(SynsepalumdulcificumDaniell)属于山榄科神秘果属，是原产于西非的一种热带植物，具有很高的观赏价值，是一种稀有的热带优稀水果。自从20世纪60年代引入中国之后，在海南、云南、广东、广西以及福建等省市区小面积种植。科学实验分析表明，神秘果含有一种变味蛋白，又称神秘果素，成分为一种糖蛋白，具有很强的增甜作用，据报道0.1mg的神秘果素即可产生持久的增甜作用，这种蛋白本身并不甜，也不能改变食物本身的酸味，但它能对舌头上的味蕾感受器发生作用，从而改变味觉。当食用神秘果之后，神秘果素会分布在舌头上的味蕾细胞上，舌头上的味蕾感受器的功能暂时被神秘果素扰乱了，对酸味敏感的味蕾感受器暂时被麻痹以及抑制，而对甜味敏感的味蕾感受器却兴奋与活跃起来，使人感觉到增甜作用。

由于神秘果素的特殊功能性质，许多学者早在20世纪60年代就开始了其活性成分的提取工作。常用的方法有透析法、离心分离法、溶剂沉淀法和色谱法等。透析法虽然简单，但回收量太低。由于神秘果素不溶于水，有人利用这一特点，用离心法获得神秘果素。但这种方法难以得到大量的神秘果素，而且提取物杂质太多，Inglett等利用这种方法从14颗神秘果中得到了0.31g含有活性成分的粗提物。有机溶剂沉淀能够浓缩活性成分，从而提高提取物中神秘果素的含量，但这种方法需要用多种有机溶剂反复萃取，过程非常繁琐，Inglett等还利用这种方法从20g冻干果肉中提取到5g浓缩物，证实为神秘果素粗提物。Kurihara和Beidler首次利用离子交换色谱分离得到神秘果素，并表明它是一种碱性糖蛋白，他们用该方法得到了100mg/kg的神秘果素。也有人将几种方法联用，来提高提取物中神秘果素的纯度和含量，例如Theerasilp等成功地联用多种方法从20g冻干果肉中得到36mg神秘果素，回收率为75％，纯度较理想。Narendra根据神秘果素中含有多聚组氨酸残基(易与镍发生强结合)的结构特性，建立了用ImmobilizedMetal-AffinityChromatography镍柱一步提取的方法，该色谱分离方法获得的神秘果素纯度大于95％，但该法得率较低，且成本较高，仅限于实验分析分离纯化。国内赵谋明等高压脉冲电场辅助高效提取神秘果素，并采用膜通量为10kDa的超滤膜对神秘果素粗提液进行脱盐、浓缩，冷冻干燥处理，得到神秘果素产品，一方面该提取方法成本会较高，另外对其纯度并没有进行检测；据报道天然粗神秘果素的分子量为25kDa左右肽的二聚体，仅仅依靠超滤膜通量进行提纯，其纯度可能并不十分理想。

磁性纳米粒子吸附技术是一种集目标产物分离和纯化为一体的新型生物分离技术，具有集成化优势，可以作为经济、高效、适合规模化生产的蛋白质纯化方法。采用该技术代替传统粗提与纯化方法，可以直接从细胞破壁液中捕获目标产物，克服传统分离纯化过程的缺点，简化操作步骤，缩短操作时间，降低纯化成本。磁性纳米颗粒可以利用神秘果素中糖蛋白/糖肽中糖基片段上的顺式邻二醇结构来进行定向富集，其最关键的相互作用为硼酸配基与顺式邻二醇发生酯化反应。在碱性条件下，硼酸基团与神秘果素糖基片段中的顺式邻二醇发生酯化反应，生成环状二酯，将神秘果素富集到固相载体上；在一定酸性缓冲液条件下，反应逆向进行，环状二酯发生水解，释放出神秘果素。目前用于定向分离富集植物糖蛋白的纳米磁珠已商业化，并且可以反复利用多次，成本得到有效控制，可用于大批量样本的神秘果素分离纯化。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种利用磁性纳米颗粒提取分离纯化神秘果素的方法，该方法工艺简单，提取时间较短，产品纯度较高，磁性纳米颗粒可反复多次使用，安全可靠，可规模化生产。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种利用磁性纳米颗粒提取分离纯化神秘果素的方法，主要包括以下步骤：

(1)原料预处理：将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，用无菌水清洗干净，冷风机处理沥干水分，放入低于-20℃冰箱冻藏或者液氮速冻；

(2)粗蛋白提取：将冻藏的神秘果果实超声解冻，分离果肉后放入搅拌机内，分离果肉，加入10～20倍的纯水，使用均质机高速剪切均质，高速离心后弃上清液，取沉淀物加入10～20倍的pH值为6.5～7.5缓冲液进行二次均质，并在一定温度条件下提取一段时间，然后将上清液膜过滤，截留得到澄清的含有神秘果素的糖蛋白粗提液；

(3)提取纯化：取磁性纳米颗粒分散到pH值为6.8～7.2缓冲液中直至平衡，然后按1g：(50～150)mL比例添加到浓缩后的神秘果素粗提溶液中，温和混合(管旋转器)后在室温下孵育，然后用磁分离器分离吸附了神秘果素的磁性颗粒；

(4)磁珠解离：吸附了神秘果素的磁性颗粒，使用pH值为4.0～5.0酸性缓冲溶液使其洗脱解离，将试管置于磁分离器上，等待30s，即可从上清液中解离回收磁性纳米颗粒；将上清液转移至新管中，即为纯化后的神秘果素溶液；

(5)冷冻干燥：将纯化后的神秘果素溶液，通过一定分子量的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘果素粉末产品。

步骤(1)所述的神秘果采摘至预处理之间的时间经过优化控制在4小时内，以保持神秘果素良好的功能活性；

步骤(2)所述的从-20℃冻藏中拿出的神秘果果实需在取出后10分钟内加入搅拌机内搅拌；搅拌后的混合物在温度为4℃，离心力为8000×g～12000×g的条件下，离心分离20～30min；提取温度为15～25℃，提取时间15～30min，以维持提取过程在较温和条件下；

步骤(2)所述的缓冲溶液经过优选为NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或磷酸盐缓冲液的一种或多种，pH值范围为6.5～7.5，获得神秘果糖蛋白的粗提液；

步骤(2)所述的纯水优化后的加入量为果肉的10～20倍，缓冲液的加入量为沉淀物的10～20倍，该比例可尽可能将神秘果糖蛋白提取完全；

步骤(3)所述的磁性纳米颗粒经过优选为含有炔基、硼酸基或具有类似功能基团的纳米磁珠；所述的缓冲溶液经过优选为Tris-HCl缓冲液，缓冲液与神秘果素粗提液的比例优选为1g：(50～150)mL，pH值范围优选为6.8～7.2。

步骤(3)所述中所述含盐的缓冲液优选为pH值为6.8～7.2的Tris-HCl缓冲液；所述孵育时间优选为30～60min；

步骤(4)所述的酸性缓冲液pH值优选为4.0～5.0酸性缓冲溶液，可提高神秘果素得率；

步骤(5)所述的超滤膜的分子量优选为10～15kDa，可提高神秘果素纯度。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明公开的高效提取神秘果素方法，工艺简单，提取时间较短，产品纯度较高，磁性纳米颗粒可反复多次使用，安全可靠，可规模化生产。

附图说明

图1为磁性纳米颗粒结构；

图2为磁性纳米颗粒提取神秘果素原理；

图3为磁性纳米颗粒提取神秘果素流程图；

图4神秘果素的分子量约为22～23kDa。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净沥干水分，放入冰箱-20℃冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量3倍的4℃无菌水，搅拌至果肉与核脱离，整个过程在10min内完成。分离果肉后，加入10倍的纯水，使用均质机高速剪切均质，高速离心后弃上清液，取沉淀物加入10倍的pH6.5的PBS缓冲液二次均质，并在20℃条件下提取30min，然后将上清液膜过滤，截留得到澄清的神秘果素粗提液。取磁性纳米颗粒分散到pH值为7.0Tris-HCl缓冲液中直至平衡，然后按1g：100mL比例添加到浓缩后的神秘果素粗提溶液中。温和混合(管旋转器)后在室温下孵育50min，吸附了神秘果素的磁性颗粒，使用pH值为4.5酸性缓冲溶液使其洗脱解离，将试管置于磁分离器上，等待30s，即可从上清液中解离回收磁性纳米颗粒。将上清液转移至新管中，即为纯化后的神秘果素溶液。纯化后的神秘果素溶液通过10kDa的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘果素产品。

实施例2

将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净沥干水分，放入冰箱-30℃冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量5倍的4℃无菌水，搅拌至果肉与核脱离，整个过程在10min内完成。分离果肉后，加入15倍的纯水，使用均质机高速剪切均质，高速离心后弃上清液，取沉淀物加入10倍的0.5MNaCl缓冲液二次均质，并在20℃条件下提取20min，然后将上清液膜过滤，截留得到澄清的神秘果素粗提液。取磁性纳米颗粒分散到pH值为7.2Tris-HCl缓冲液中直至平衡，然后按1g：150mL比例添加到浓缩后的神秘果素粗提溶液中。温和混合(管旋转器)后在室温下孵育40min，吸附了神秘果素的磁性颗粒，使用pH值为4.5酸性缓冲溶液使其洗脱解离，将试管置于磁分离器上，等待30s，即可从上清液中解离回收磁性纳米颗粒。将上清液转移至新管中，即为纯化后的神秘果素溶液。纯化后的神秘果素溶液通过15kDa的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘果素产品。

实施例3

将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净沥干水分，放入冰箱-20℃冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量3倍的4℃无菌水，搅拌至果肉与核脱离，整个过程在10min内完成。分离果肉后，加入20倍的纯水，使用均质机高速剪切均质，高速离心后弃上清液，取沉淀物加入15倍的pH6.5的PBS缓冲液二次均质，并在20℃条件下提取20min，然后将上清液膜过滤，截留得到澄清的神秘果素粗提液。取磁性纳米颗粒分散到pH值为7.0Tris-HCl缓冲液中直至平衡，然后按1g：100mL比例添加到浓缩后的神秘果素粗提溶液中。温和混合(管旋转器)后在室温下孵育30min，将实例2解析得到的磁性颗粒继续用于本例中吸附神秘果素，使用pH值为4.0酸性缓冲溶液使其洗脱解离，将试管置于磁分离器上，等待30s，即可从上清液中解离回收磁性纳米颗粒。将上清液转移至新管中，即为纯化后的神秘果素溶液。纯化后的神秘果素溶液通过15kDa的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘果素产品。

实施例4

将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净沥干水分，放入冰箱-20℃冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量3倍的4℃无菌水，搅拌至果肉与核脱离，整个过程在10min内完成。分离果肉后，加入20倍的纯水，使用均质机高速剪切均质，高速离心后弃上清液，取沉淀物加入15倍的pH6.5的PBS缓冲液二次均质，并在20℃条件下提取20min，然后将上清液膜过滤，截留得到澄清的神秘果素粗提液。取磁性纳米颗粒分散到pH值为7.0Tris-HCl缓冲液中直至平衡，然后按1g：100mL比例添加到浓缩后的神秘果素粗提溶液中。温和混合(管旋转器)后在室温下孵育30min，将实例3解析得到的磁性颗粒继续用于本例中吸附神秘果素，使用pH值为4.0酸性缓冲溶液使其洗脱解离，将试管置于磁分离器上，等待30s，即可从上清液中解离回收磁性纳米颗粒。将上清液转移至新管中，即为纯化后的神秘果素溶液。纯化后的神秘果素溶液通过15kDa的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘果素产品。

品质测定

1、测试方法

神秘果素纯度测定：利用神秘果素标准品配置标准溶液，采用反相高效液相色谱法进行外标法检测，流动相为15％～70％的乙腈水并加入0.1％三氟乙酸，线性梯度洗脱，神秘果素标准品在100μg/mL～1000μg/mL浓度范围内制作标准曲线，紫外检测器在280nm处检测神秘果素的纯度。

神秘果分子量测定：利用SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳实验，分离胶浓度12.0％，电泳样品用5X蛋白上样缓冲液沸水处理5min，上样量60μL，电泳条件135V、50min，考马斯亮蓝染色，结果见图4所示。

感官评价方法：采用滋味稀释分析法对分离纯化神秘果素冻干样的引起甜味阈值进行感官评价。将神秘果素冷冻干燥物准确溶于纯净水中，配成1％的浓度，然后进行1：1(体积比)的逐步稀释，样品的逐步稀释的溶液按照浓度增加的顺序呈给经过训练的评员，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定。当某个稀释水平的溶液与2个空白(纯净水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，那么称这时的样品浓度为可识别的阈值。每个评定组的阈值采用各个评员评定结果的平均值。

神秘果素引起甜味感觉的感官评价步骤如下：

(1)2～3ml 0.1M柠檬酸含于口腔内，确定其酸味；

(2)吐掉柠檬酸，纯净水漱口3次；

(3)将2.5ml神秘果素提取物含于口中1分钟；

(4)吐掉神秘果素提取物，纯水漱口3次；

(5)2～3ml 0.1M柠檬酸含在口腔内，确认产生的甜味。

2、测试结果

表1实例1-4分析检测结果对比

由表1可以看出，本发明实施例1～4所提供的神秘果素产品品质指标检测结果，在纯度数值方面基本上都达到了95.0％以上，基本相当；实施例1～4感官阈值均在120ppm以下，与相关研究报道一致；另外实施例1～4中神秘果素分子量在22～25kDa，也与前人研究的结果一致。证明本方法制备的神秘果素产品纯度较高，另外实例3和实例4中将吸附饱和的磁性纳米颗粒经洗脱分离出神秘果素后，经简单处理继续用于下一次的吸附分离过程，从表1结果看纳米磁珠多次重复利用基本不影响对神秘果素的分离效率，且纯度依然维持在较高水平，说明该制备方法稳定性良好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。