具体实施方式

以下对本公开的描述仅旨在说明本公开的各种实施方式。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本公开范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，这些等效实施方式将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。

I.定义

应理解，以上一般描述和以下详细描述都仅是示范性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本申请中，除非另外具体陈述，否则单数的使用包括复数。在本公开中，除非明确指示仅指代替代方案或替代方案是互斥的，否则术语“或”用于意指“和/或”。如本文所用，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。此外，术语“包括”以及如“包括了”和“包括着”等其它形式的使用不具限制性。此外，除非另外具体陈述，否则例如“要素”或“组分”等术语涵盖包含一个单位的要素和组分以及包含超过一个亚单位的要素和组分。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。

如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个指代物。

如本文所用，术语“凋亡”是指多细胞生物体中发生的程序性细胞死亡的形式。凋亡是受高度调控和控制的过程，其可当细胞感测到细胞压力时通过内在路径，或归因于来自其它细胞的信号通过外在路径引发。在凋亡过程期间，细胞经历一系列特征性变化，包括起泡、细胞收缩、核碎裂、染色质凝聚、染色体DNA碎裂和整体mRNA降解。

如本文所用，术语“癌症”是指涉及异常细胞生长的任何疾病，并且包括影响体内任何组织、器官或细胞的疾病的所有阶段和所有形式。所述术语包括所有已知的癌症和赘生性病况(不论以恶性、良性、软组织为特征，还是以实体为特征)，以及所有阶段和等级的癌症，包括转移前和转移后癌症。一般来说，癌症可以根据所述癌症所处或起源的组织或器官以及癌组织和细胞的形态进行分类。如本文所用，癌症类型包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、儿童期小脑或大脑基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑癌、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏家族肿瘤(Ewingfamily of tumors)、尤文氏肉瘤、胃(gastric/stomach)癌、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、皮肤癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、阴道癌、视路和下丘脑神经胶质瘤。

如本文所用，“细胞”可以是原核或真核细胞。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如哺乳动物细胞或人细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞(例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红血细胞(例如网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞以及树突状细胞)；来自内分泌系统或器官的细胞(例如甲状腺细胞(例如甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺细胞(例如嗜铬细胞)和松果体细胞(例如松果腺细胞))；来自神经系统或器官的细胞(例如成神经胶质细胞(例如星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星形细胞、伯特歇尔细胞(boettcher cell)和脑垂体细胞(例如促性腺细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、促生长激素细胞和促乳素细胞))；来自呼吸系统或器官的细胞(例如肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞(clara cell)、杯状细胞和肺泡巨噬细胞)；来自循环系统或器官的细胞(例如心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞(例如胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞和肝脏细胞(例如肝细胞和库普弗细胞(Kupffer cell))；来自体被系统或器官的细胞(例如骨骼细胞(例如成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、齿细胞(例如成牙骨质细胞和成釉细胞)、软骨细胞(例如成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如毛细胞、角化细胞和黑色素细胞(痣细胞))、肌肉细胞(例如肌细胞)、脂肪细胞、纤维母细胞和腱细胞)；来自泌尿系统或器官的细胞(例如足细胞、肾小球旁细胞、肾小球内系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞和致密斑细胞)；以及来自生殖系统或器官的细胞(例如精子、塞特利氏细胞(Sertoli cell)、莱氏细胞(leydig cell)、卵子、卵母细胞)。细胞可以是正常的健康细胞；或病变或不健康的细胞(例如癌细胞)。细胞进一步包括哺乳动物合子或干细胞，其包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。干细胞是一种能够经历细胞分裂周期，同时维持未分化状态并分化成专门细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞和单能干细胞，其中的任何一种都可以由体细胞诱导。干细胞还可以包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔形目细胞，例如兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类动物细胞，例如人细胞。

如本文所用，术语“化疗”是指使用一或多种抗癌药物的癌症治疗。抗癌药物包括但不限于阿瓦斯汀(Avastin)、贝伐单抗(Bevacizumab)、开普拓(Camptosar)(盐酸伊立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、西妥昔单抗(Cetuximab)、赛兰扎(Cyramza)、乐沙定(Eloxatin)(奥沙利铂(Oxaliplatin))、爱必妥(Erbitux)、5-FU(氟尿嘧啶)、福思乐(Fusilev)(甲酰四氢叶酸钙)、伊匹单抗(Ipilimumab)、可瑞达(Keytruda)、朗斯弗(Lonsurf)(曲氟尿苷和替吡嘧啶盐酸盐)、纳武单抗(Nivolumab)(欧狄沃(Opdivo))、帕尼单抗(Panitumumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、雷莫芦单抗(Ramucitrumab)、瑞格非尼(Regorafenib)、拜万戈(Stivarga)、阿柏西普(Ziv-Aflibercept)。

如本文所用，术语“类器官”是指体外三维培养物，其类似于小型化并简化的器官并且显示实际的显微解剖结构。类器官通过自我更新和分化衍生自来自组织的一个或几个细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

如本文所用，术语「放疗」是指使用电离辐射来控制或杀死恶性细胞的疗法。放疗通常通过直线加速器递送。如果多种类型的癌症位于身体的一个区域，则可使用放疗来治疗所述癌症。放疗也可用作辅助疗法的一部分，以预防去除原发恶性肿瘤的手术之后的肿瘤复发。放疗可与化疗协同作用，并且在敏感癌症的化疗之前、期间和之后使用。

如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方式中，受试者是人。受试者可以是患者，其是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可患有或易患疾病或病症，但可能或可能不显示疾病或病症的症状。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗疾病或病况的药物的剂量或浓度。举例来说，关于本文所公开的小分子化合物治疗由化疗或放疗诱导的GI损伤的用途，治疗有效量是能够预防或改善由化疗或放疗诱导的GI损伤的化合物的剂量或浓度。

如本文所用，病况的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或结束与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况或其某一组合。

II.治疗诱导的胃肠损伤

胃肠(GI)上皮是更新最快的成体组织，并且由组织特异性干细胞维持。治疗诱导的GI副作用是化疗和腹部放疗的主要剂量限制因素，并且可降低癌症患者和存活者的生活质量。举例来说，据报道，常用于治疗结直肠癌的5-氟尿嘧啶(5-FU)在50％的患者中引起化疗诱导的腹泻。尽管放射和大部分化疗剂损害多个组织和器官系统，但通常与5-FU组合用于治疗结直肠癌患者的盐酸伊立替康(CPT-11)引起选择性GI损伤，超过50％的患者中出现严重腹泻和恶心。这种急性毒性由以下引起：高浓度的SN-38，即CPT-11的活性代谢物在肠中积累，以及无毒性SN-38葡萄糖苷酸由肠道细菌转化回SN-38，接着肠再吸收。SN-38为拓扑异构酶I，即DNA复制和RNA转录两者中的关键酶的抑制剂，并且引起增殖细胞中的复制压力和DNA损伤。抗腹泻药品可帮助缓解CPT-11诱导的腹泻，但对减少长期GI功能障碍的效果有限。目前不存在美国FDA批准的预防或治疗CPT-11诱导的GI损伤或并发症的药剂。

化疗或放射诱导的急性肠病的特征在于在治疗期间或治疗不久之后损失增殖隐窝细胞、上皮屏障损坏和炎症。在许多患者中，迟发性肠病可在疗法之后数月或更晚发生，并且特征为与上皮和间质隔室中病理变化相关的肠功能障碍，如血管硬化和进行性肠壁纤维化。新出现的证据表明慢性肠损伤可能是早期毒性的结果。由化疗药物，如CPT-11和5-FU引起的肠毒性与小鼠和人的快速隐窝凋亡相关。小肠上皮细胞是更新最快的成体组织，并且位于隐窝底部的肠干细胞(ISC)驱动损伤后的更新和再生。ISC包括隐窝底部的柱状细胞(CBC)，和相对于隐窝底部处于4位的一些细胞(+4细胞)。含富亮氨酸重复序列的G蛋白(异源三聚鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)偶联受体5表达(LGR5+)CBC的基因消融在健康小鼠中良好耐受，但强烈加剧放射诱导的肠损伤，不过潜在机制仍未知。

DNA损伤之后的p53激活导致组织和靶标特异性后果，如肿瘤抑制或急性毒性。p53激活是高剂量放射后控制肠再生的一把双刃剑。一方面，p53依赖性PUMA诱导是大部分放射诱导的凋亡以及肠和造血干细胞和祖细胞的急性损失的原因，并且PUMA缺乏或下调保护免于放射诱导的致死性和淋巴瘤生成。然而，p21和可能的其它靶标的p53依赖性诱导通过防止DNA损伤积累、复制压力和延迟的非凋亡细胞死亡，对于有成效的肠再生至关重要，并且p53/p21缺乏加剧肠损伤。p53在化疗诱导的GI损伤中的作用未得到充分理解。p53抑制剂匹夫林(pifithrin)-α在大鼠中在前几个小时内减少CPT-11诱导的肠凋亡，但不影响延迟的细胞死亡或粘膜炎发作。

III.治疗化合物

如本文所公开，诸位发明人出人意料地发现，通过一组小分子化合物对Puma的药理学抑制而非p53缺乏提供针对由单次和重复暴露于CPT-11诱导的GI损伤的强效保护，但不损害CPT-11的体内抗肿瘤活性。这种保护与选择性保存LGR5⁺干细胞、干细胞微环境(niche)和基因组完整性相关。

在某些实施方式中，小分子化合物选自下组：

在某些实施方式中，上述化合物是氘代的。如本文所用，“氘代化合物”是指氢原子中的一个或多个已由氘同位素置换的化合物。应理解，取决于合成中使用的化学材料的来源，在合成的化合物中存在天然同位素丰度的一些变化。因此，化合物的制剂将固有地含有少量氘代化合物。天然丰富的稳定氢和碳同位素的浓度与本文所描述的氘代化合物的稳定同位素取代程度相比是小的和不重要的。在本文所描述的氘代化合物中，当特定位置指定为具有氘时，应理解，在所述位置处氘的丰度显著大于氘的天然丰度(其为0.015％)。指定为具有氘的位置典型地具有至少3000(45％氘并入)的最小同位素富集系数，例如至少3500(52.5％氘并入)、至少4000(60％氘并入)、至少4500(67.5％氘并入)、至少5000(75％氘)、至少5500(82.5％氘并入)、至少6000(90％氘并入)、至少6333.3(95％氘并入)、至少6466.7(97％氘并入)、至少6600(99％氘并入)或至少6633.3(99.5％氘并入)。

在某些实施方式中，本文所公开的氘代化合物具有以下结构：

其中“D”是指氘。

本文所描述的小分子化合物的合成可由普通技术的合成化学家使用本领域已知的方法容易地实现。此类方法可利用对应的氘代和任选地其它含同位素的试剂和/或中间体以合成本文中描述的化合物，或诉诸本领域中已知的用于将同位素原子引入化学结构中的标准合成方案来进行。

IV.配制和施用

本公开提供用于预防或治疗由治疗诱导的GI损伤的药物组合物。此类组合物包含预防或治疗有效量的本文所公开的化合物和药学上可接受的载剂。在一个具体实施方式中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其它公认的药典中列出用于动物，更特别是人。此类药物载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是特定的载剂。生理盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。其它合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

如果需要，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释配制物等形式。口服配制物可包括标准载剂，如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物试剂的实施例描述于“雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”中。此类组合物将含有预防或治疗有效量的所述化合物以及合适量的载剂，以便提供向患者适当施用的形式。配制物应适合施用模式，施用模式可以是口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或通过机械通气递送。

如本文所描述，本公开的化合物可配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过皮内、静脉内、肌肉内、皮下、瘤内或甚至腹膜内途径注射。或者，化合物可通过局部途径直接施用于粘膜，例如通过滴鼻剂、吸入或通过雾化器。药学上可接受的盐包括酸盐和用无机酸或有机酸形成的盐，无机酸例如盐酸或磷酸，有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。用游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱和有机碱，无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。

通常，本公开的组合物的成分单独地或以单位剂型混合在一起供应，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，在指示活性剂的数量的密封容器(如安瓿或药囊)中。在通过输液施用组合物的情况下，可利用含有无菌药物级的水或生理盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿注射用无菌水或生理盐水，使得可在施用之前混合成分。

本公开的组合物可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，所述阴离子如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子；和与阳离子形成的盐，所述阳离子如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子。

本文所公开的化合物或药物组合物可以治疗有效量向受试者施用，以使预防或治疗由治疗诱导的损伤。在某些实施方式中，治疗有效量为约0.001到约10mg/kg体重，其中组合物一天一次、一天两次、一天三次、一周一次、一周两次、一周三次或每两周一次施用。在某些实施方式中，有效量为约0.01mg/kg体重、0.1mg/kg体重、约0.5mg/kg体重、约1mg/kg体重、约1.5mg/kg体重、约2mg/kg体重、约2.5mg/kg体重、约3mg/kg体重、约3.5mg/kg体重、约4mg/kg体重、约4.5mg/kg体重、约5mg/kg体重、约5.5mg/kg体重或约6mg/kg体重。在某些实施方式中，组合物的单位剂量在约0.001mg到约10mg之间(例如约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg)。在某些实施方式中，有效量为0.01mg/kg体重、0.1mg/kg体重、0.5mg/kg体重或1mg/kg体重，其中组合物一天施用一次。在某些实施方式中，有效量为5mg/kg体重，其中组合物一周施用一次。

V.实施例

包括以下实施例以展现本发明的说明性实施方式。本领域的技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中操作良好的技术，并且仅应视为构成其实践的说明性模式。根据本公开，本领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1.材料和方法

化合物筛选和制备

使用ZINC 8.0数据库的计算机筛选和如先前所描述的计算机ADME/毒性概况(Mustata G.等人《医药化学当前论题(Curr Top Med Chem)》(2011)11:281-290，以引用的方式并入本文中)鉴别候选PUMA抑制剂结构和类似物。从商业供应商获得与PUMAi相关的化合物。

研究设计

这项研究的目标是确定PUMA和p53依赖性凋亡是否介导化疗诱导的肠干细胞损失和肠病，以及其基因和药理学抑制是否提供肠化学保护。使用非荷瘤和荷瘤小鼠、p53和Puma KO小鼠、小分子PUMAi和体外小鼠和人结肠类器官来测量PUMA抑制对肠损伤和再生的影响，以及化疗之后的肿瘤反应。使用公开的工作和检验效能计算确定样品大小。在数据采集期间，实验人员对处理组不知情。

小鼠和处理

所有动物实验程序由匹兹堡大学(University of Pittsburgh)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。在内部通过杂合子育种产生Puma+/+(WT)和Puma-/-(Puma KO)小鼠(52)。如所描述(52)，WT和Puma KO等位基因由从剪尾(tail snip)分离的基因组DNA进行基因分型。p53-/-(p53 KO)小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。已描述LGR5标记小鼠Lgr5-EGFP(Lgr5-EGFP-IRES-creERT2)(53)。所有品系处于C57BL/6背景中或已与其回交(backcross)超过10代(F10)。小鼠容纳于微型隔离笼，处于07:00到19:00时照明(12:12小时光/暗循环)的房间中，随意取水和食物。除非另外指示，否则通过腹膜内注射施用在生理盐水中的200mg/kgCPT-11(盐酸伊立替康；开普拓，辉瑞(Pfizer))(对于20g小鼠，200μl)。PUMAi由ChemBridge定制合成，根据HPLC/质谱(MS)最低纯度为95％，制备为二甲亚砜中的储备液(50mg/ml)，接着在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中新鲜稀释(2mg/ml)，并且以10mg/kg腹膜内给予(对于20g小鼠，200μl)。

对于肿瘤实验，将400万个LLC细胞[美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)]注射到WT和Puma KO小鼠的侧腹中，并且使其生长11天。接着每周用CPT-11(200mg/kg)处理小鼠三次，持续2周。在每次剂量CPT-11之前2小时和之后20小时通过腹膜内注射施用PUMAi(10mg/kg)或媒剂对照。在最终CPT-11处理之后4小时处死小鼠。

除非另外指示，否则CPT-11(盐酸伊立替康；开普拓，辉瑞)的处理为i.p.施用200mg/kg。除非另外指示，否则将PUMA抑制剂(PUMAi)制备为DMSO中的50mg/ml储备液，接着在PBS中新鲜稀释到2mg/ml，并且在化疗处理之前2小时以10mg/kg i.p.给予。对于存活实验，将小鼠用CPT-11处理连续三天。给予PUMAi4次，每次在化疗之前2小时以及最后一次化疗之后22小时。

对于肿瘤实验，每周用CPT-11处理小鼠三次，持续两周。接受PUMAi的小鼠在每次CPT-11剂量之前2小时和之后20小时进行处理。在最终CPT-11处理之后四小时处死小鼠(图13A)。肿瘤体积用卡尺测量并按体积＝(长度×宽度2)/2计算。小鼠为7-9周龄，并且使用大致相等数目的雄性和雌性动物。为了考虑起始体重的变化，图3和4中的值表示为在第一次CPT-11处理时相应小鼠体重的百分比。

5-氟尿嘧啶(5-FU)(APP Pharmaceuticals)处理施用200mg/kg i.p.。对于全身照射实验，在照射之前30分钟和之后30分钟给予PUMAi(10mg/kg)，接着每日给药持续四天。

组织处理和组织学分析

紧接在处死之后，取出约10cm空肠部分并且用冰冷生理盐水仔细冲洗。将组织纵向打开并且固定到泡沫板上，以便在10％福尔马林中固定过夜。接着将组织卷起成“瑞士卷(swiss roll)”并且包埋于石蜡中。对于肿瘤分析，取出侧腹肿瘤，测量，并且切成碎片以便福尔马林固定或在干冰/乙醇浴中速冻。将组织切片(5μm)脱蜡并且通过梯度乙醇复水。通过苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析。

通过测量来自每组至少三只不同动物的小肠的不同部位的40到50根绒毛确定平均绒毛高度，并且将其报告为平均值}SEM。使用～H&E图像和SPOT 5.1Advanced软件(Diagnostic Instruments Inc.)从隐窝顶部到绒毛尖端进行测量。

免疫组织化学和免疫荧光

将复水切片用3％过氧化氢处理(仅免疫化学)，接着在含1mM EDTA的煮沸0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复10min。根据制造商的说明书，用ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒(Chemicon International)通过TUNEL染色分析凋亡。

活性胱天蛋白酶3IHC。将切片脱蜡并且通过梯度乙醇复水。接着将复水切片用3％过氧化氢处理，接着在含1mM EDTA的煮沸0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复10分钟。在室温下使用20％山羊血清(英杰(Invitrogen))阻断非特异性抗体结合30分钟。将切片在加湿室中在4℃下与1:100稀释兔抗胱天蛋白酶-3(裂解，Asp 175)(9661；CellSignaling Technologies)一起培育过夜。接着将切片在室温下与生物素标记山羊抗兔二抗(#31822；Pierce)一起培育1小时，并且用ABC试剂盒和DAB(Vector Laboratories)显影。

LGR5(GFP)IF。将切片脱蜡并且通过梯度乙醇复水。通过在含1mM EDTA的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸10分钟来进行抗原修复。在室温下使用20％山羊血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在加湿室中在4℃下与1:50稀释小鼠抗GFP(sc-9996；Santa Cruz Biotechnology)一起培育过夜。接着将切片与AlexaFluor 488缀合山羊抗小鼠二抗(1:200；AA11001；英杰)一起在室温下培育1小时(58)。接着将切片在PBS中洗涤，并且用VectaShield+DAPI(Vector Labs)完成封片。

LGR5(GFP)/TUNEL IF。如上文所描述制备切片。在室温下使用20％山羊血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在加湿室中在4℃下与1:50稀释小鼠抗GFP(sc-9996；Santa Cruz Biotechnology)一起培育过夜。接着将切片与AlexaFluor 594缀合山羊抗小鼠二抗(1:200；AA11005；英杰)一起在室温下培育1小时。接着将切片在PBS中洗涤，并且根据制造商的说明书，用ApopTag荧光素原位凋亡检测试剂盒(Chemicon)进行TUNEL染色(37，46)。

MMP7 IF。如上文所描述制备切片。在室温下使用20％鸡血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在PBS中洗涤，并且在加湿室中在4℃下与1:100稀释山羊抗MMP7(AF2967；安迪生物公司(R&D Systems))一起培育过夜。接着将切片与AlexaFluor594缀合兔抗山羊二抗(1:200；AA11080；英杰)一起在室温下培育1小时。接着将切片在PBS中洗涤，并且用VectaShield+DAPI(Vector Labs)完成封片以便可视化。

LGR5(GFP)/MMP7 IF。如上文所描述制备切片。在室温下使用20％鸡血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。接着将切片如上文所描述针对GFP进行染色，接着如所描述针对MMP7进行染色。

PCNA IF。如上文所描述制备切片。在室温下使用20％山羊血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在加湿室中在4℃下与1:100稀释小鼠抗PCNA(sc-56；SantaCruz)一起培育过夜。接着将切片与AlexaFluor 594缀合山羊抗小鼠二抗(1:200；英杰)一起在室温下培育1小时。接着将切片在PBS中洗涤，并且用VectaShield+DAPI(Vector Labs)完成封片。

CD166 IF。如上文所描述制备切片。在室温下使用20％兔血清(Pierce)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在加湿室中在4℃下与山羊抗小鼠CD166抗体(1:100；AF1172；安迪生物公司)一起培育过夜。接着将切片与AlexaFluor 594兔抗山羊二抗(1:200；A11080；英杰)一起在室温下培育1小时，并且用VectaShield加DAPI复染(59)。

p53 BP1 IF：如上文所描述制备切片。在室温下使用20％山羊血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在加湿室中在4℃下与兔抗小鼠53BP1抗体(1:100；IHC-00001；Bethyl Laboratories)一起培育过夜。接着将切片与AlexaFluor 594山羊抗兔二抗(1:200；A11012；英杰)一起在室温下培育1小时，并且用VectaShield加DAPI复染。

嗜中性粒细胞IF。如上文所描述制备切片。在室温下使用20％山羊血清(英杰)阻断非特异性抗体结合30min。将切片在加湿室中在4℃下与大鼠抗小鼠Ly-6B.2(1:100；MCA771GT；AbD Serotec)一起培育过夜(56)。接着将切片与AlexaFluor-594山羊抗大鼠二抗(1:200；A11007；英杰)一起在室温下培育1小时，并且用VectaShield加DAPI复染。

PUMAi的LC-MS/MS定量

乙腈和水(均为HPLC级)购自飞世尔科技公司(Fisher Scientific)。甲酸和三氟乙酸购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。将PUMAi和[D5]-PUMAi内标的储备溶液在DMSO中以1mg/mL制备，在乙腈中稀释10倍，且接着存储在-80℃下。在分析当天，将溶液在乙腈中连续稀释(以10倍步长)，以获得0.01和0.001mg/mL的较低校准工作溶液。将这些校准工作溶液在小鼠血浆(Lampire Biological Laboratories,Inc.)中稀释以产生以下分析物浓度：10、30、50、100、300、500、1000、3000ng/mL。对于每个校准系列，还由50μLLampire血浆制备零(含有10ng/mL内标)和空白样品。将质量控制(QC)储备溶液稀释于Lampire小鼠血浆中，以产生以下QC样品：QC低(QCL)20ng/mL；QC中(QCM)200ng/mL和QC高(QCH)2500ng/mL。

为了提取PUMAi，我们将10μL内标溶液(1000ng/mL[D5]-PUMAi的乙腈溶液)添加到微量离心管中的50μL血浆样品中。添加250μL乙腈，并且将样品涡旋30s。将样品以12,000×g离心五分钟，并且将所得上清液在12×75mm玻璃管中在34℃下氮气下蒸发到干燥。将干燥残余物用100μL乙腈/水(v/v)复原，并且将10μL注射到LC-MS/MS系统中。

LC-MS/MS系统由安捷伦(Agilent)1100自动进样器和二元泵以及沃特世(Waters)Quattromicro串联质谱仪组成。用由A：乙腈/0.1％甲酸(v/v)和B：水/0.1％甲酸(v/v)组成的梯度流动相进行液相色谱。以0.3mL/min的流动速率泵送流动相，并且使用菲罗门(Phenomenex)Luna 3μm PFP(100a 150×2mm)柱实现分离。梯度流动相如下：0到5min，溶剂A为15％。接着将溶剂A在12min时线性增加到80％，并且维持在80％下直到16min。在16.1min时，将溶剂A减少到15％，并且维持在15％下直到22min。运作时间为22min。

质谱仪以ESI正模式使用MRM检测操作。质谱仪的参数如下：毛细管1.0kV，锥孔电压40V，去溶剂化温度400℃，去溶剂化气体流量550L/h，锥孔反吹气流量50L/h，LM和HM分辨率12，碰撞能量25V，并且气室皮拉尼(pirani)压力1.5*10^-3毫巴。监测的质量跃迁对于PUMAi为m/z 331>143，并且对于内标为345>157。

为了评定从血浆的回收，我们将外加1000ng/mL如上文所描述制备的PUMAi的对照血浆的面积与用PUMAi在水中的纯溶液获得的面积进行比较。在对照血浆中稀释到校准范围内后分析肠粘膜。通过从10cm空肠部分刮擦收集肠粘膜，并且将其存储在-80℃下直到使用。每个处理组使用三只小鼠。

原位杂交

根据制造商的说明书，用RNAscope 2.0BROWN试剂盒(Advanced CellDiagnostics)进行Olfm4的ISH。简单来说，将组织切片在下烘烤60min，接着在二甲苯中脱蜡，并且通过梯度乙醇复水。接着切片经历三个预处理步骤，探针杂交，六个扩增步骤，显影和复染。如先前所描述进行Puma的ISH。

蛋白质印迹法

将新鲜粘膜刮片或切碎的肿瘤组织在1ml冰冷PBS中洗涤，并且以400g沉淀。将沉淀再悬浮于700μl补充有蛋白酶抑制剂(cOmplete无EDTA微型，罗氏(Roche))的均质化缓冲液(0.25M蔗糖，10mM Hepes和1mM EGTA)中，并且在的杜恩斯(Dounce)匀浆器中用50次研杵冲击均质化。通过以16,000g离心清除之后，通过分光光度计(NanoDrop 2000，赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))确定上清液中的蛋白质浓度。

将蛋白质(30μg)使用NuPAGE系统(英杰)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且转移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P，密理博(Millipore))。显示代表性结果，且相似结果在至少三次独立实验中获得。所使用的抗体包括PUMA(ab9643，艾博抗(Abcam))、p53、p21、血凝素(HA)(sc-6243、sc-397和sc-805；Santa Cruz Biotechnology)、V5(R960-25，英杰)、微管蛋白(CP06，Oncogene Science)和肌动蛋白(A5541，西格玛-奥德里奇公司)。

定量实时聚合酶链反应

将来自10cm空肠的新鲜粘膜刮片在冷PBS中洗涤，在700μl RNA溶解缓冲液中再悬浮，并且在杜恩斯匀浆器中均质化。根据制造商的说明书，使用Quick-RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research)分离RNA。如所描述，在RNA分离之前使用细胞回收溶液(康宁(Corning))从基质胶(Matrigel)释放类器官。互补DNA由来自小鼠的2μg总RNA或来自结肠类器官的约100ng总RNA产生，并且使用SuperScript III反转录酶(英杰)和随机引物从每个处理组的三只小鼠或三个类器官培养物的孔合并。基因表达相对于Gapdh归一化。显示代表性结果，且相似结果在至少三次独立实验中获得。小鼠和人引物的细节见于表1和2中。

表1.用于实时反转录聚合酶链反应的小鼠特异性引物。

表2.用于实时反转录聚合酶链反应的人特异性引物。

细胞和处理

将HCT 116、DLD1、SW480和HT29人结肠癌细胞(ATCC)以及HCT 116p53 KO和PUMAKO在37℃和5％CO2下维持在麦考伊氏(McCoy′s)5A培养基(英杰)中，培养基补充有10％特级胎牛血清(HyClone)、青霉素(100U/m1)和链霉素(100μg/ml)(英杰)。将人胚肾293细胞(ATCC)维持在含相同补充剂的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)(英杰)中。对于处理，将细胞以约30％密度接种于12孔板中24小时，且接着用CPT(西格玛-奥德里奇公司)处理。将25μM PUMAi与CPT同时添加到细胞中。

凋亡的测量

处理之后，收集悬浮和贴壁细胞并且将其置于在含有3.7％甲醛、0.5％NP-40和赫斯特(Hoechst)33258(10μg/ml)(Molecular Probes)的PBS溶液中染色。通过凝聚和碎裂的细胞核的显微可视化评定凋亡，如先前所描述(Yu J.等人，《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U S A)》(2003)100:1931-36，以引用的方式并入本文中)。每次处理分析最少300个细胞，一式三份。显示代表性结果，且相似结果在至少三次独立实验中获得。

免疫沉淀

根据制造商的说明书，使用脂染胺(Lipofectamine)2000用先前所描述的表达加HA标签的PUMA(HA-PUMA)、加HA标签的非活性PUMA(ΔBH3)或加V5标签的Bcl-xL(V5-Bcl-xL)的质粒转染HEK293细胞。为了测试PUMAi，将含有HA-PUMA或HA-ΔBH3的293细胞裂解物与25μM PUMAi一起培育15min，接着与V5-Bcl-xL溶解物混合1小时，并且用抗HA抗体(sc-805，Santa Cruz Biotechnology)进行免疫沉淀。使用含有HA-BIM和V5-Mcl-1的裂解物，以相似方式测试BIM/Mcl-1相互作用。显示代表性结果，且相似结果在至少三次独立实验中获得。

组织中PUMAi的测量

PUMAi{1-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-3-(2-萘氧基)-2-丙醇二盐酸盐}由ChemBridge合成，根据HPLC-MS纯度为95％，并且内部同位素标准PUMAih7(D5，五个内部氢由氘置换)由Alsachim合成，根据HPLC-MS纯度接近100％。核磁共振证实同位素富集99.4％或更多。来自未处理的小鼠的合并血浆用作对照血浆。关于PUMAi的液相色谱-串联MS(LC-MS/MS)定量的详细方法见于补充材料和方法。

小鼠和人结肠类器官

WRN条件培养基的制备

将L-WRN细胞(CRL-3276)在补充有1×青霉素/链霉素(英杰)、0.5mg/mLG418(ant-gn-1，InvivoGen)、0.5mg/mL潮霉素B(10687010，英杰)和10％FBS(vol/vol)的DMEM(英杰)中培养直到汇合。接着用胰蛋白酶-EDTA(英杰)收集细胞，并且分到三个T75细胞培养瓶(莎斯特(Sarstedt))中补充有1×青霉素/链霉素和10％FBS(HyClone)(vol/vol)的DMEM中，直到细胞变得过度汇合。接着将细胞用5ml原代培养基(补充有1×青霉素/链霉素、2mM GlutaMAX(赛默飞世尔(ThermoFisher))、20％FBS[vol/vol]的Advanced DMEM/F12(英杰))冲洗，并且在相同培养基(15ml/瓶)中培养。每24小时，收集原代培养基(条件培养基)，并且将新鲜培养基添加到瓶中。将条件培养基在室温下2,000g离心5min，并且倾析上清液且以等分试样存储在-20℃下直到使用。

小鼠隐窝分离、类器官和处理

如先前所描述进行小鼠隐窝分离、类器官发育和传代，伴有轻微修改。简单来说，用于小鼠肠类器官的完全培养基如下略微修改：高级达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)/F12(12634-010，英杰)补充有100单位/毫升青霉素/0.1mg/ml链霉素(英杰)、2mMGlutaMAX(赛默飞世尔)、20％(vol/vol)FBS(S11150，ATLANTA Biologicals)和WRN条件培养基(50％，vol/vol)。将新鲜分离的隐窝用相同培养基加10μM Y-27632(Y0503西格玛(Sigma))和100μg/ml Primocin(ant-pm-1，InvivoGen)培养。对于CPT和PUMAi处理，将肠类器官传代并且再接种于24孔板中的25μL基质胶(356231，康宁)中，24小时后用CPT(0.5μM，C9911，西格玛-奥德里奇公司)和PUMAi(50μM)处理24小时。将含CPT的培养基用含PUMAi(50μM)的完全培养基置换。设置三个组(处理对照、仅CPT和CPT加PUMAi)。在CPT处理之后第6天，列举直径为100μm或更大的类器官。从至少三次独立实验获得相似结果，每次实验中有三个重复的孔。

人隐窝分离、类器官发育和处理

从UPMC Shadyside医院和UPMC Presbyterian医院的健康科学组织库(HealthScience Tissue Bank，HSTB)获得手术切除的肠组织。所有样品在匹兹堡大学伦理委员会(Ethics Committee)的知情同意和批准下获得。如先前所描述进行人正常结肠隐窝分离和类器官发育，伴有修改。用于正常人结肠类器官的完全培养基含有高级DMEM/F12(12634-010，英杰)，其补充有1×青霉素/链霉素(15140-122，英杰)、10mM HEPES(15630-106，英杰)、2mM GlutaMAX(英杰)、1×B27(17504-044，英杰)、1×N2(17502-048，英杰)、1mM N-乙酰半胱氨酸(A0737，西格玛)、10nM[leu-15]-胃泌素(G9145，西格玛)、10mM烟酰胺(N0636，西格玛)、10μM SB202190(S7067，西格玛)、50ng/ml重组鼠类EGF(315-09，派普泰克(Peprotech))、0.5μM A83-01(2939，Tocris Bioscience)、10nM PGE2(22-961-0，TocrisBioscience)和50％WRN条件培养基(vol/vol)。将新鲜分离的隐窝用相同培养基加10μM Y-27632和100μg/ml Primocin培养。在CPT处理之后第6天，列举直径为100μm或更大的类器官。从至少三次独立实验获得相似结果，每次实验中有三个重复的孔。

统计分析

用GraphPad Prism IV软件进行统计分析。通过单因素方差分析(ANOVA)和图基事后检验分析反应的多重比较，两个组之间的比较则通过双尾不配对t检验来进行。通过对数秩检验分析存活数据。如果偶然发生差异的机率小于5/100(P<0.05)，则差异视为显著。使用公开的工作和检验效能的组合计算确定样品大小。对于ANOVA，通过构建混合线性增长模型应用的双向析因设计来计算交互测试的检验效能，计算所需样本大小。估计通常每组5到10个将提供80％检验效能检测1.5SD的标准化交互。

实施例2.PUMA介导化疗诱导的隐窝凋亡和致死性

为了研究p53依赖性凋亡在化疗诱导的急性肠损伤中的潜在作用，诸位发明人用单次剂量伊立替康(200mg/kg；CPT-11)处理野生型(WT)、p53基因敲除(KO)和Puma KO小鼠。CPT-11在WT小鼠中诱导稳健的隐窝凋亡，正如通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)和活性胱天蛋白酶-3染色所量测，其在6小时达到峰值并且通过48小时逐渐减少。观察到隐窝基底处的干细胞(相对于隐窝底部处于1到3位的CBC)和+4到9细胞(相对于隐窝底部)两者中的凋亡，但凋亡未发生在p53 KO和Puma KO小鼠中(图1A和1B，以及图8A-8D)。CPT-11处理在WT而非p53 KO小鼠的肠粘膜中在6小时内诱导p53以及其靶标PUMA和p21(图1C和图8E)。Puma KO不显著影响p53或p21表达(图1C)。仅BH3蛋白BIM和NOXA不由CPT-11诱导或受Puma KO影响(图8F)。RNA原位杂交(ISH)证实Puma mRNA在未处理的WT小鼠的隐窝中不可被检测，并且在通过CPT-11处理在CBC和一些+4细胞中被强烈诱导(图1D)。CPT-11在小鼠中引起剂量依赖性致死性GI损伤(24)。为了确定C57BL/6J小鼠的敏感度，监测三个连续日剂量CPT-11后的存活。每天180、215和250mg/kg剂量分别引起30％、90％和100％致死率，并且所有死亡发生在第5天与第8天之间，为致死性GI损伤所特有(图9)。在WT小鼠90％致死性剂量(LD90)(每天215mg/kg，持续3天)下，所有Puma KO小鼠存活30天，而所有p53 KO小鼠在第6天与第9天之间死亡(图1E)。组织学分析证实在第5天时WT和p53 KO小鼠中的致死性GI损伤，显示隐窝严重损失和绒毛缩短，这种现象未发生在KO小鼠中(图1F)。与p53在肠从放射恢复中的双重作用(20)一致，我们的数据证明选择性抑制p53依赖性诱导PUMA和凋亡而非p21或其它功能引起肠化学保护。

实施例3.小分子PUMAi保护免于化疗诱导的隐窝凋亡和致死性

诸位发明人使用PUMA BH3结构域与BCL-2家族蛋白的关键相互作用的药效团模型、计算机化合物筛选和凋亡分析，鉴别多种潜在PUMAi。证实这些化合物中的一种(PUMAi)抑制PUMA/BCL-xL而非BIM/MCL-1的相互作用(图10A-10C)。在具有不同p53或PUMA基因型，包括p53 WT(HCT 116)、无效(p53 KO)、突变体(HT29、SW480和DLD1)或PUMA无效(PUMA KO)的结肠癌细胞系中，PUMAi不减少喜树碱(CPT)诱导的凋亡(图10D)。PUMA仅在p53 WTHCT116细胞，而非任何p53缺乏细胞系中由CPT处理诱导(图10E)。与小鼠肠粘膜(图1C和1D)以及正常人小肠和结肠中极低或不可检测的表达相比，HCT 116细胞中PUMA的基础量高得多。

为了检查PUMAi的体内功效，在单次剂量CPT-11(200mg/kg)之前2小时用媒剂或PUMAi(10mg/kg，经验剂量)处理WT小鼠，并且在CPT-11施用之后6和24小时分析隐窝凋亡。与过渡扩充(TA)、+4到9细胞相比，PUMAi减少的TUNEL和活性胱天蛋白酶-3染色优先处于CBC中(图2A和2B，以及图11A-11D)。PUMAi处理不进一步减少Puma KO小鼠中的隐窝凋亡(图11E)。接着开发高效液相色谱(HPLC)分析，以评定在三个时间点，即CPT-11施用(0小时)的-1.5、+1和+6小时的肠粘膜和血浆中的PUMAi分布(图11F)。与-1.5小时相比，PUMAi浓度在+1和+6小时在肠粘膜中分别保持在67％和30％，但在血浆中下降更快速(图2C)。CPT-11从血浆快速清除，半衰期大约36min。诸位发明人发现，CPT-11处理之后1小时给予的PUMAi仍有效减少凋亡，表明PUMAi不影响CPT-11转化或肠吸收(图2D)。

此外，PUMAi在三种不同剂量下降低CPT-11诱导的致死性(图2E以及图12A和12B)。在LD90下，PUMAi使存活率从10％改善到70％。组织学分析证实与WT小鼠相比，在PUMAi和Puma KO组中在第5天的GI损伤减少(图1F和2F)。PUMAi还提高9.5和15戈全身照射后小鼠的存活率(图12C和12D)，进一步支持靶向p53依赖性凋亡而非其它功能选择性降低治疗诱导的正常组织毒性的想法。

实施例4.PUMA抑制不降低CPT-11的抗肿瘤活性

为了确定PUMA抑制是否提供选择性肠化学保护，诸位发明人在具有免疫能力的WT和Puma KO小鼠中建立皮下路易斯肺癌(LLC)肿瘤。在肿瘤达到平均100mm3(第11天)之后，小鼠接受六次CPT-11(200mg/kg，腹膜内)给药，历时2周(图13A)。在WT和Puma KO宿主中，肿瘤植入和CPT-11反应不可区分(图3A和图13B)。相比之下，CPT-11诱导的体重减轻在PumaKO小鼠中减少(图3B)，与通过较高绒毛高度、隐窝数目和较低嗜中性粒细胞浸润显而易见的保留的肠结构和屏障相关(图3C-3G)。

接着在荷瘤小鼠中确定PUMAi的效果。在每次CPT-11剂量之前2小时和之后20小时给予PUMAi(10mg/kg)或媒剂。PUMAi组显示与媒剂组相比可比的肿瘤反应(图4A和图13B)，但对CPT-11诱导的体重减轻、肠损伤(图4B-4G)和致死性(表3)具有高度抗性。此外，基于每日检查，PUMAi或PUMA KO组在整个研究期间展现改善的梳毛和身体活动。所有三个CPT-11处理组中的LLC肿瘤显示对增殖或凋亡的相似影响(图13C和13D)，但缺乏对p53、PUMA或p21的诱导(图13E)，与突变p53一致。这些研究证明PUMA抑制减弱CPT-11诱导的肠毒性，但不减弱具有免疫能力的宿主中p53突变肿瘤的建立或治疗反应。

表3.LLC肿瘤实验中的处理相关致死性。

实施例5.靶向PUMA强效保护LGR5⁺干细胞和微环境免于化疗

关于ISC微环境在损伤诱导的再生中的作用知之甚少。诸位发明人测试CBC，而非化学敏感性更高的TA细胞的损失是否通过微环境“排空”发送“损伤”信号以激活其余干细胞。PUMAi提供测试此的药理学方式，因为其选择性阻断CPT-11诱导的CBC凋亡(图2B)。使用LGR5-EGFP(增强绿色荧光蛋白)报告基因小鼠，诸位发明人发现Puma KO或PUMAi分别减少CPT-11诱导的LGR5⁺细胞凋亡超过90％或70％(图5A和5B)。Puma KO还阻断由另一常用化疗药物5-FU诱导的LGR5⁺细胞凋亡(图14)。CD166是标记稳态ISC微环境的WNT靶标，包括隐窝底部的CBC和潘氏细胞。CPT-11处理在WT小鼠中诱导CD166+细胞从48到96小时的明显扩增，这由96小时的PUMAi处理完全抑制(图5C和5D)。这之前为早在6小时的WNT(Lgr5、CD44和Wnt3A)以及NOTCH(Olfm4、Math1、Hes1、Hes5和Dll1)反应基因的短暂但强烈激活，其在PumaKO和PUMAi处理的小鼠中在很大程度上受抑制(图15)。唯一例外是TA制造者CD44，其由PumaKO而非由PUMAi强烈抑制(图5E)。诸位发明人接着监测由53BP1灶引起的隐窝DNA损伤，其在6小时在Puma KO、PUMAi和对照组中相当。然而，在单次剂量CPT-11之后48小时，Puma KO和PUMAi组中的DNA损伤降低，并且在三次剂量CPT-11之后120小时降低更多(图5F和5G)。这些数据强有力地表明，化疗之后LGR5⁺细胞损失破坏微环境并且触发WNT和Notch信号传导和肠再生，并且阻断LGR5⁺细胞损失可能延迟代偿性增殖且改善DNA修复。

实施例6.LGR5⁺细胞是由PUMAi进行的肠化学保护中的关键靶标

诸位发明人进一步测试由LGR5⁺细胞损失触发的WNT和NOTCH激活将可能使剩余干细胞对重复暴露和干细胞耗竭敏感。六次剂量CPT-11处理之后，LGR5⁺隐窝细胞和LGR5⁺隐窝分率在WT小鼠中减少超过90％，与之相比，在Puma KO和PUMAi组中仅减少40％到60％(图6A和6B)。Olfm4 RNA ISH指示WT小鼠中Olfm4+隐窝下降93％，与之相比，在Puma KO和PUMAi组中分别下降8％和49％(图6C)。潘氏细胞是LGR5⁺细胞的微环境并且以MMP7表达为特点。重复CPT-11处理而非单一处理减少隐窝内的MMP7+细胞，伴随通过上皮散布显著错位，以及MMP7+和LGR5⁺细胞的紧密接触的几乎完全丧失，这在Puma KO和PUMAi组中得到抑制(图6D到6F)。总体来说，这些数据证明LGR5⁺细胞耗竭作为化疗诱导的肠毒性的底层关键机制，其可由PUMAi有效地靶向。

实施例7.PUMAi保护小鼠和人结肠类器官免于CPT诱导的损伤

为了确定PUMAi是否直接作用于隐窝细胞，诸位发明人使用先前用于展现放射诱导的PUMA依赖性LGR5⁺细胞凋亡的三维上皮类器官或肠样系统。CPT在小鼠结肠类器官中诱导生长抑制和胱天蛋白酶-3激活，这由PUMAi强烈阻断(图7A到7C)。PUMAi还抑制CPT诱导的WNT和NOTCH靶标(Lgr5、CD44和Olfm4)激活(图7D)。与Lgr5或Olfm4相比，对TA标记物CD44的抑制较不明显，类似于诸位发明人在体内观察的结果。

为了证明PUMAi的转化潜力，诸位发明人使用原代人结肠类器官。PUMAi增强类器官生长(图7E和7F)并且抑制CPT诱导的胱天蛋白酶-3激活(图7G)。PUMAi抑制CPT诱导的WNT和NOTCH靶标表达(图7H)，确立p53和PUMA依赖性LGR5⁺细胞损失触发上皮隔室内ISC相关路径的显著激活。

实施例8.抑制PUMA诱导的凋亡的额外化合物。

除PUMAi之外，使用ZINC 8.0数据库的计算机筛选和如先前所描述的计算机ADME/毒性概况(Mustata G.等人《医药化学当前论题》(2011)11:281-290，以引用的方式并入本文中)鉴别出展现对PUMA诱导的凋亡的抑制的若干化合物。诸位发明人还测试一组与PUMAi相关的化合物在结肠癌细胞系DLD1和HCT-116中减少PUMA诱导的凋亡的能力。下表中列出这些额外化合物的结构和凋亡抑制效果。

表4.化合物的结构和凋亡抑制

本文所公开或所要求的所有组合物和方法都可根据本公开在无过度实验的情况下作出和执行。虽然已经根据说明性实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以改变组合物和方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤的顺序。更具体地说，显而易见的是，在化学上和生理学上相关的某些药剂可以取代本文所描述的药剂，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改均视为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。