乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用 (Acetaminoglucosohydrolase mutant and application thereof ) 是由 陈振明 贺瑾 王志国 郑晨妮 方亚煊 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用,通过对现有的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶进行定点突变得到的一种酶活明显提高的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶,所述N-乙酰氨基葡萄糖水解酶可以高效的水解N-乙酰氨基葡萄糖,显著提高酶转化过程中氨基葡萄糖的产生效率,从而在提高酶水解法的工业价值的同时还能减少环境污染。(The invention discloses an N-acetylglucosamine hydrolase mutant and application thereof, wherein the N-acetylglucosamine hydrolase with obviously improved enzyme activity is obtained by carrying out site-directed mutagenesis on the existing N-acetylglucosamine hydrolase, and the N-acetylglucosamine hydrolase can efficiently hydrolyze N-acetylglucosamine, thereby obviously improving the generation efficiency of the glucosamine in the enzyme conversion process, improving the industrial value of the enzymatic hydrolysis method and reducing the environmental pollution.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用。
背景技术
氨基葡萄糖(glucosamine，GlcN)化学式是C6H13O5N，俗称氨基糖，又称氨基葡糖、葡萄糖胺或葡糖胺，简称氨糖，是葡萄糖环2号位的羟基被氨基取代后的产物，在水及亲水性溶剂中溶解度高，主要以氨基葡萄糖盐酸盐(Glucosamine Hydrochloride)、氨基葡萄糖硫酸盐(Glucosamine sulfate)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的形式存在；氨基葡萄糖的天然形式—氨基葡萄糖6-磷酸酯是所有氨基葡糖的生化前体。
氨基葡萄糖主要应用在医药、食品和保健品行业，用途广泛。在医药行业中，外源性的补充氨基葡萄糖类化合物有助于人体多形细胞合成氨基多糖与糖蛋白，刺激软骨细胞再生帮助修复受损的软骨组织，阻断关节炎的病理过程、减缓骨关节炎患者疼痛、改善关节功能。此外，氨基葡萄糖还具有免疫调节、抗肿瘤和清除自由基的作用。在食品工业中，由于氨基葡萄糖盐酸盐对在食品工业中常见的细菌、霉菌和酵母菌均有明显的抑制作用，且对人体没有毒害作用，故其作为天然食品防腐剂有很好的市场前景。
目前对氨基葡萄糖的生物合成途径研究表明，在微生物中，氨基葡萄糖会强烈抑制合成途径中的关键酶glmS的活性，且若在胞内大量积累对细胞有毒害作用，而N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的性质较稳定，对代谢过程无抑制作用。因此工程菌发酵法生产氨基葡萄糖时，往往将N-乙酰氨基葡萄糖作为发酵目标产物，进而通过胞外脱乙酰水解得到氨基葡萄糖。
目前均通过酸水解的方法对N-乙酰氨基葡萄糖进行胞外水解，但这种方法会产生环境污染的问题，酶催化长期以来一直被认为是最绿色的化学合成技术之一，然而目前尚无成熟的N-乙酰氨基葡萄糖酶水解工艺。仅有零星的报导，并且都不是以酶水解工艺的开发为出发点，水解酶的活性也不高。因此挖掘出较高活性的N-乙酰氨基葡萄糖水酶具有重要的工业应用价值和潜力。
发明内容
本发明提供一种乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用，旨在改善现有的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶活性不高，酶转化过程中生产氨基葡萄糖的效率较低的问题。
为改善上述问题，第一方面，本发明提供一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，所述酶的氨基酸序列是对应于SEQ ID NO.1的氨基酸序列的第169位天冬酰胺被丝氨酸取代。
在一个实施方式中，所述酶是如下蛋白质：
a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；
b)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
其中，如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：
与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有水解酶活性的蛋白质。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子为第一方面中所述N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的编码基因。
其中，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性且编码所述蛋白质的DNA分子；
3)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质的氨基酸序列及上述1)或2)所述条件的DNA分子。
第三方面，本发明提供了含有第二方面所述核酸分子的表达载体。
其中，所述表达载体可以为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
第四方面，本发明提供了含有第三方面所述表达载体或者含有第二方面所述核酸分子的宿主细胞。
其中，所述宿主细胞可以选自大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母或黑曲霉；优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。
第五方面，本发明还提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的制备方法，包括：通过培养第四方面所述的宿主细胞得到所述N-乙酰氨基葡萄糖水解酶。
第六方面，本发明还提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的制备方法，包括如下步骤：用第一方面所述的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶水解N-乙酰氨基葡萄糖，得到氨基葡萄糖。
有益效果：本发明提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，具有水解N-乙酰氨基葡萄糖能力，与现有的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶相比，具有更高的催化活性，可以高效地水解N-乙酰氨基葡萄糖，显著提高酶转化过程中氨基葡萄糖的产生效率，从而在提高酶水解法的工业价值的同时还能减少环境污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶pET-28a(+)-Tk-169S核酸电泳检测结果；
图2是本发明实施例提供的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶pET-28a(+)-Tk-169S表达的氨基酸测序比对图；
图3是本发明实施例提供的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的蛋白电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
定义与说明：
本发明中氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。
在本发明中，关于氨基酸位置或残基的术语“取代”是指在特定位置处的氨基酸已被其他的氨基酸代替。取代可以是保守的或非保守的。
本文所用的术语“核酸分子”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，核酸分子可以是包括如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。在本发明的具体的实施方式中，所述核酸分子可以是与编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的DNA相似性至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的DNA分子。本发明的核酸分子还包括SEQ ID NO.3所示的多核苷酸经密码子优化的核酸分子，可以采用本领域已知的密码子优化方法，例如简并密码子的替换。
本文所用的术语“表达载体”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，表达载体可以是可方便地经由重组DNA程序并且引起多核苷酸表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线状或环状质粒。载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了抗生素抗性或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。
本文所用的术语“宿主细胞”是含有本发明所述核酸分子或表达载体的细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中含有本发明所述的核酸分子或表达载体且能够生产氨基酸的细胞。例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、假单胞菌属、类芽孢杆菌属。
真核宿主细胞可为哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞，包括但不限于：丝状真菌(曲霉、毛霉、根霉、青霉等)、酵母(毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母等)。
本文所用的术语“对应于”用于确定氨基酸序列或核苷酸序列中突变氨基酸或突变碱基的具***置。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1所示任一氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:1所示任一氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO1所示任一氨基酸序列的第40位就可能是第46位。序列的对比可以经人工对比，也可以经序列对比软件或在线序列对比网站完成。
本文所用的术语“相似性”指与天然核苷酸序列的序列相似性，例如，相似性包括与本发明SEQ ID NO.2所示第1-270位所示的的氨基酸序列组成的蛋白质核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高相似性的核苷酸序列。相似性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的相似性可以用百分比(％)表示，其可以用评价相关序列之间的相似性。
本文中“乙酰氨基葡萄糖水解酶”与“N-乙酰氨基葡萄糖水解酶(N-acetylchitobiose deacetylase)”具有相同的含义，所述被N-乙酰氨基葡萄糖水解酶水解的N-乙酰氨基葡萄糖的乙酰基连接在N原子上。本文所述的“水解”即为对N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰的过程。
实施例：
感受态细胞：大肠杆菌JM109(DE3)为申请人实验室保藏。
载体：pET-28a(+)为申请人实验室保藏。
工具酶及试剂盒：KOD plus聚合酶，Mg2+，dNTP，DpnⅠ内切酶，PNK激酶，T4DNA连接酶、Ligation high等购自东洋纺；质粒提取试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海捷瑞；琼脂糖，卡那霉素，聚丙烯酰胺，IPTG，SDS购自大连宝生物工程，核酸Marker，蛋白Marker等购自上海生工。常用试剂异丙醇，乙酸乙酯，环己烷，色谱试剂等购自上海百灵威。
实施例1、N-乙酰氨基葡萄糖水解酶(GlcNAc)表达载体的构建。
本发明实施例从Thermococcus kodakaraensis KOD1基因组DNA中克隆出脱乙酰基因TK-dac(野生型)，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，以pET28a(+)为载体，连接到pET-28a(+)表达质粒上构建重组表达质粒，命名为：pET28a(+)-TK-dac。
本发明选用的表达载体为pET28a(+)-TK-dac。设计正向引物N169S-F：5’-AGCTTCAACCGCTCTGACCTGA-3’(SEQ ID NO.5)，和反向引物N169-R：5’-CGGCAGGCCAGCGAAAGAAAC-3’(SEQ ID NO.6)，由南京金斯瑞科技有限公司合成。以pET28a(+)-TK-dac为模板，于引物上引入突变点，进行PCR扩增；采用DpnⅠ消化酶识别并裂解pET28a(+)-TK-dac；用PNK激酶将PCR产物磷酸化，同时使用连接酶连接，使DNA片段自身环化，获得N169S定点突变的重组质粒，突变后的质粒即为含有突变位点的质粒，命名为pET-28a(+)-Tk-169S；将连接完整的含有突变位点的重组质粒，转化到大肠杆菌感受态细胞内。进行PCR扩增。将PCR产物进行核酸电泳检测验证。
其中，PCR反应体系的组成如表1所示。
PCR扩增为反向PCR扩增，具体的扩增条件为：98℃预热1min；94℃变性15s；55℃退火15s；68℃延伸3min30s，循环18次；68℃终延伸5min，最后4℃保存。
表1：PCR反应体系组成(50μL)
成分
体积
模板DNA
1μL
dNTPs(2mM)
5μL
Mg<sup>2+</sup>(25mM)
3μL
10×反应缓冲液reaction buffering
5μL
正向引物PrimerⅠ(10mM)
1.5μL
反向引物PrimerⅡ(10mM)
1.5μL
KOD-Pluse(1U/μL)
1μL
ddH<sup>2</sup>O
32μL
总体积
50μL
如图1所示，为pET-28a(+)-Tk-169S核酸电泳检测结果。将PCR扩增后的突变位点的质粒，进行琼脂糖凝胶电泳检测验证连接后的突变位点的质粒大小为6173bp，与预计的突变位点的质粒大小吻合。
实施例2、N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的表达及SDS-PAGE分析。
将实施例1中的质粒pET28a(+)-TK-dac和pET-28a(+)-Tk-169S转化至大肠杆菌JM109(DE3)中表达，从而获得pET28a(+)-TK-dac菌株和pET-28a(+)-Tk-169S菌株。具体的转化方法为：
取出100μL感受态大肠杆菌JM109(DE3)，分别加入实施例1中的质粒pET28a(+)-TK-dac和pET-28a(+)-Tk-169S，混匀后于冰上放置30min；将感受态于42℃水浴锅中热激45s后，移至冰上，放置2-3min后加入900μL无菌SOB培养基，于37℃，200rpm恒温摇床中培养1h；将菌液12,000rpm离心1min，弃掉大部分上清，剩余约200μL重悬均匀后全部涂布到含Kan抗性的LB固体平板上，37℃过夜培养。待长出菌落后进行验证。
利用上述pET28a(+)-TK-dac菌株和pET-28a(+)-Tk-169S菌株进行N-乙酰水解酶的诱导表达，SDS-PAGE分析酶的表达情况。具体方法为：
挑取培养的菌落，接种于含卡那霉素抗性的5mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm的恒温摇床中过夜培养后，接种500μL的菌液于50mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基中；于37℃，200rpm的恒温摇床培养菌液，至菌液OD600为0.6-0.8；IPTG诱导表达，获得可溶性目的蛋白；诱导完成后的低温高速离心弃去上清，以5mL的25mM、pH 8.0的Tris-HCl将菌体沉淀重新悬浮后于冰水浴中超声破碎(工作条件：功率120W，工作7秒，停7秒，总时间15分钟)；破碎后离心收集含有可溶性目的蛋白的上清液，用于SDS-PAGE检测。
如图2所示，为pET-28a(+)-Tk-169S表达的氨基酸的测序比对图。将pET-28a(+)-Tk-169S表达的氨基酸进行测序，经测序结果表明：SEQ ID NO.1的氨基酸序列的第169位天冬酰胺被丝氨酸取代，即成功的进行了N169S突变。
pET-28a(+)-Tk-169S、空白质粒pET-28a(+)以及pET28a(+)-TK-dac经过大肠杆菌JM109(DE3)转化和IPTG诱导后生成的蛋白，菌体超声破碎后进行SDS-PAGE分析，如图3所示，从左至右分别表示pET-28a(+)-TK-DAC上清，pET-28a(+)-TK-DAC沉淀，pET-28a(+)-TK-169S上清，pET-28a(+)-TK-169S沉淀，空白质粒pET-28a(+)上清，Marker。检测结果发现，空质粒无明显条带，pET-28a(+)-Tk-169S组和pET28a(+)-TK-dac组在30KDa左右有明显的蛋白条带，与N-乙酰氨基葡萄糖水解酶理论相对分子质量(30.3KDa)一致，且pET-28a(+)-Tk-169S菌株的目的蛋白表达量明显高于pET28a(+)-TK-dac菌株。
实施例3、N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的酶活测定
利用碱滴定法测定N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的活性，将pET-28a(+)-Tk-169S转化菌株表达的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶命名为突变酶N169S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；将pET28a(+)-TK-dac菌株表达的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶命名为野生酶TK-DAC，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。从表2和表3中可以看出，突变酶N169S活约为野生酶TK-DAC活的7倍，可见SEQ ID NO.1所示的野生酶TK-DAC经第169位氨基酸残基突变后酶活相比于野生酶TK-DAC明显提高，提高约7倍左右。
表2：碱滴定法测定N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的酶活的条件
物质
体积
25mM Tris-HCl(pH8.0)
19mL
温度
37℃
酶液
1mL
1mM Co<sup>2+</sup>
200mL
GlcNAc
0.2g
表3：酶活检测结果
诱导条件
菌株
酶活U/mL
1‰IPTG，25℃
pET28a(+)-TK-dac
0.11
1‰IPTG，25℃
pET-28a(+)-Tk-169S
0.78
实施例4、高效液相色谱分析N-乙酰氨基葡萄糖水解酶转化率的测定
N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的转化率测定采用的是高效液相色谱法，检测条件为：色谱柱：C18Column，5μm 100A(0.46cm×25cm)；流动相:乙腈/纯水＝33/67(v/v)，流速：1.0mL/min，柱温：35℃，检测波长：λ＝254nm。通过检测底物乙酰氨基葡萄糖和产物氨基葡萄糖的变化，分别判断突变酶N169S和野生酶TK-DAC是否催化乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰反应。
采用衍生化处理法处理N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，参阅表4和表5，分别为高效液相色谱检测反应体系和衍生化反应体系。
具体的处理方法为：将N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖各6.66％的混合溶于0.2MPBS(pH8.0)中，取300μL加入到700μL的2％的HCl中，得到样品1，置于4℃冰箱中备用；在加入粗酶液之前，立刻取50μL的反应液，取样后加入950μL的2％的HCl，取300μL加入到700μL的2％的HCl中，得到样品2，置于4℃冰箱中备用；在加入粗酶液之后，在45℃下反应1h后，取50μL的反应液，取样后用950μL的2％的HCl终止反应，取300μL加入到700μL的2％的HCl中，得到样品3，置于4℃冰箱中备用；将样品1、样品2以及样品3于25℃衍生化5min，加入140μL的终止液(乙酸:乙腈＝1:4)，用高效液相色谱仪检测。
表4：高效液相色谱检测反应体系(20mL)
物质
体积
0.2M PBS(pH8.0)
9.8mL
酶液
10mL
1mM Co<sup>2+</sup>
200mL
GlcNAc
1.33g(6.66％)
表5：衍生化反应体系
物质
体积
样品1/样品2/样品3
100μL
0.1M Na<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>(pH8.0)
200μL
芴甲氧羰酰氯FmocChloride(5‰)
300μL
实验结果参阅表6和表7，可以看出，经过高效液相检测转化率，初步筛选的结果表明当野生酶TK-DAC的N169位氨基酸突变为S时，高效液相检测出的产物峰均显著高于野生酶TK-DAC，野生酶TK-DAC在5h能够转化64.4％的N-乙酰氨基葡萄糖，突变酶N169S的转化率为80.1％，转化率提高了15.5％。
经过分析转化率显示的结果，对于底物N-乙酰氨基葡萄糖，口袋通道入口处的169位氨基酸处，丝氨酸比天冬酰胺更有利于底物顺利进入催化口袋。
表6：野生酶TK-DAC
时间
峰面积(取样50ul)
转化率
0h
1703
0％
1.0h
841.4
50.6％
2.0h
710.2
58.3％
3.0h
625.2
63.3％
4.0h
618.6
63.7％
5.0h
603.2
64.6％
表7：突变酶N169S
时间
峰面积(取样50ul)
转化率
0h
1703
0％
1.0h
566.8
66.7％
2.0h
459.3
73.1％
3.0h
352.4
79.3％
4.0h
347.2
79.6％
5.0h
339.8
80.1％
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用
<130> 20200708
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 267
<212> PRT
<213> Thermococcus kodakaraensis KOD1
<400> 1
Met Val Phe Glu Glu Phe Asn Asn Phe Asp Glu Ala Phe Ser Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ser Lys Leu Asp Phe Lys Ile Asn Glu Pro Phe Asn Asp Val Lys
20 25 30
Lys Val Leu Cys Ile Glu Pro His Pro Asp Asp Cys Ala Ile Gly Leu
35 40 45
Gly Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Asp Ser Gly Ile Asp Val Val Tyr
50 55 60
Leu Leu Leu Thr Asp Gly Ser Met Gly Thr Thr Asp Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Gly His Glu Leu Ala Leu Arg Arg Leu Glu Glu Glu Lys Arg Ser Ala
85 90 95
Glu Ile Leu Gly Val Lys Lys Ile His Ala Leu Asp Phe Gly Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Pro Tyr Thr Arg Glu Val Arg Lys Glu Ile Val Thr Val Ile
115 120 125
Arg Lys Glu Arg Pro Gly Ile Val Leu Met Pro Asp Pro Trp Leu Pro
130 135 140
Tyr Glu Gly His Pro Asp His Arg His Ala Gly Phe Leu Gly Ile Glu
145 150 155 160
Ala Val Ser Phe Ala Gly Leu Pro Asn Phe Asn Arg Ser Asp Leu Ile
165 170 175
Ala Gly Leu Asp Pro His Ser Ile Gln Ala Val Gly Phe Tyr Tyr Thr
180 185 190
His Lys Pro Asn Tyr Phe Val Asp Ile Ser Asp Val Met Glu Val Lys
195 200 205
Leu Arg Ala Val Arg Thr His Glu Ser Gln Phe Pro Glu Asp Val Trp
210 215 220
Glu Leu Trp Glu Pro Tyr Leu Arg Thr Ile Ala Leu Tyr Tyr Gly Lys
225 230 235 240
Met Ser Gly His Arg Tyr Ala Glu Gly Ile Arg Phe Val Pro Gly Ile
245 250 255
Phe Leu His Ile Cys Pro Phe Ala His Val Ile
260 265
<210> 2
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Val Phe Glu Glu Phe Asn Asn Phe Asp Glu Ala Phe Ser Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ser Lys Leu Asp Phe Lys Ile Asn Glu Pro Phe Asn Asp Val Lys
20 25 30
Lys Val Leu Cys Ile Glu Pro His Pro Asp Asp Cys Ala Ile Gly Leu
35 40 45
Gly Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Asp Ser Gly Ile Asp Val Val Tyr
50 55 60
Leu Leu Leu Thr Asp Gly Ser Met Gly Thr Thr Asp Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Gly His Glu Leu Ala Leu Arg Arg Leu Glu Glu Glu Lys Arg Ser Ala
85 90 95
Glu Ile Leu Gly Val Lys Lys Ile His Ala Leu Asp Phe Gly Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Pro Tyr Thr Arg Glu Val Arg Lys Glu Ile Val Thr Val Ile
115 120 125
Arg Lys Glu Arg Pro Gly Ile Val Leu Met Pro Asp Pro Trp Leu Pro
130 135 140
Tyr Glu Gly His Pro Asp His Arg His Ala Gly Phe Leu Gly Ile Glu
145 150 155 160
Ala Val Ser Phe Ala Gly Leu Pro Ser Phe Asn Arg Ser Asp Leu Ile
165 170 175
Ala Gly Leu Asp Pro His Ser Ile Gln Ala Val Gly Phe Tyr Tyr Thr
180 185 190
His Lys Pro Asn Tyr Phe Val Asp Ile Ser Asp Val Met Glu Val Lys
195 200 205
Leu Arg Ala Val Arg Thr His Glu Ser Gln Phe Pro Glu Asp Val Trp
210 215 220
Glu Leu Trp Glu Pro Tyr Leu Arg Thr Ile Ala Leu Tyr Tyr Gly Lys
225 230 235 240
Met Ser Gly His Arg Tyr Ala Glu Gly Ile Arg Phe Val Pro Gly Ile
245 250 255
Phe Leu His Ile Cys Pro Phe Ala His Val Ile
260 265
<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtgtttg aggagttcaa caattttgac gaagctttct ctgctctgct gagcaaactc 60
gacttcaaga tcaacgagcc ctttaatgac gtgaaaaaag tcctctgcat agagccgcat 120
ccggacgact gtgccatcgg actcggcggc acgataaaga agctcaccga ttcgggaata 180
gatgtcgtct atctcctcct cacagacggc tcaatgggaa caaccgatgg agaagtctcc 240
gggcacgagc tggcccttag gagacttgag gaagagaaga gaagcgccga gatccttgga 300
gttaagaaga tacatgccct tgactttggc gacacggagc ttccctacac gcgggaggtc 360
agaaaggaga tagttaccgt gataagaaag gaaaggcccg ggatcgtttt gatgccagac 420
ccgtggcttc cctacgaggg ccaccctgat cacaggcatg caggttttct cggaattgaa 480
gctgtcagct tcgcgggcct tccgagcttc aaccgctccg acttaatcgc gggtcttgac 540
ccccacagca tacaggccgt tggcttctac tacacccaca aacccaacta cttcgttgat 600
ataagtgatg tcatggaggt taagctcagg gccgttagga cacacgagag ccagttcccg 660
gaggatgtgt gggagctttg ggagccctac ttgagaacga tagctttgta ctatggaaaa 720
atgagtggac acaggtatgc agaaggaata aggttcgttc ctggcatctt cctgcacata 780
tgtccgttcg cgcacgttat ctga 804
<210> 4
<211> 804
<212> DNA
<213> Thermococcus kodakaraensis KOD1
<400> 4
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gacttcaaga tcaacgagcc ctttaatgac gtgaaaaaag tcctctgcat agagccgcat 120
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gttaagaaga tacatgccct tgactttggc gacacggagc ttccctacac gcgggaggtc 360
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ccgtggcttc cctacgaggg ccaccctgat cacaggcatg caggttttct cggaattgaa 480
gctgtcagct tcgcgggcct tccgaacttc aaccgctccg acttaatcgc gggtcttgac 540
ccccacagca tacaggccgt tggcttctac tacacccaca aacccaacta cttcgttgat 600
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gaggatgtgt gggagctttg ggagccctac ttgagaacga tagctttgta ctatggaaaa 720
atgagtggac acaggtatgc agaaggaata aggttcgttc ctggcatctt cctgcacata 780
tgtccgttcg cgcacgttat ctga 804
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agcttcaacc gctctgacct ga 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggcaggcca gcgaaagaaa c 21
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