一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法
阅读说明：本技术 一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法 (Method for detecting activity of exoglucanase of litters ) 是由 刘兵 李世杰 葛炎 李小丽 刘怡 孙辉 于 2020-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法,属于酶活检测技术领域。本发明提供的检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法包括：称取过筛的凋落物碎屑到离心过滤管中,加入培养缓冲液低温孵育,高速离心后将滤液混合并调节至一定体积；将待测酶液和灭活酶液分别加入黑色酶标板孔内,再加入荧光共轭纤维素二糖苷工作液,在避光条件下震荡孵育后,向各酶标孔加入Tris终止液；采用多功能酶标仪进行荧光检测；计算外切葡聚糖酶活性。本发明的优点为：优化了反应体系,反应酶液需求少,减少了其它酶活和人为操作干扰,灵敏度高,结果可靠,将反应体系置于酶标板内,避光震荡培养后添加终止液即可上机操作,批量获得结果数据,效率高。(The invention discloses a method for detecting the activity of exoglucanase of a litter, and belongs to the technical field of enzyme activity detection. The method for detecting the exoglucanase activity of the litter comprises the following steps: weighing the sieved litter fragments into a centrifugal filter tube, adding a culture buffer solution for low-temperature incubation, and mixing and adjusting the filtrate to a certain volume after high-speed centrifugation; respectively adding enzyme solution to be detected and inactivated enzyme solution into black enzyme label plate holes, adding fluorescent conjugated cellulose diglycoside working solution, performing shake incubation under the condition of keeping out of the sun, and adding Tris stop solution into each enzyme label hole; performing fluorescence detection by using a multifunctional microplate reader; the exoglucanase activity was calculated. The invention has the advantages that: the reaction system is optimized, the requirement of the reaction enzyme solution is low, the interference of other enzyme activities and manual operation is reduced, the sensitivity is high, the result is reliable, the reaction system is placed in an enzyme label plate, the reaction system can be operated on a computer by adding the stop solution after being subjected to light-proof oscillation culture, the result data can be obtained in batches, and the efficiency is high.)
技术领域
本发明属于酶活检测技术领域，更具体地说，涉及一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法。
背景技术
凋落物分解是森林土壤物质转化的基础，是植物和微生物养分的主要来源，在维持森林生态系统碳及养分循环中起重要作用。微生物是森林凋落物分解的主要贡献者，在凋落物降解的过程中，凋落物上定殖的微生物会分泌各种胞外酶，改变凋落物的组成结构，从而促进凋落物的降解。作为参与凋落物分解最为重要的生物活性物质，酶活性涉及各种生物化学过程，与凋落物的分解直接相关，在很大程度上反映了土壤C、N、P等养分循环状况，且因凋落物类型及环境条件的不同而异。研究凋落物中各种酶类活性在凋落物分解过程的活性动态，对了解森林凋落物分的微观生态过程具有重要意义。
外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)，即C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶，可以吸附作用于纤维素分子的结晶区，从纤维素线状分子的末端使其结构破坏，从而有利于内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶发挥降解作用。因此外切葡聚糖酶活性对于森林凋落物和土壤有机质的降解以及养分循环，乃至维持森林生态系统的生物化学循环和能量流动以及提升土壤肥力具有重要意义。由于外切葡聚糖酶活性对凋落物数量和组成以及土壤理化性质等环境因素的变化敏感，且是土壤微生物作用于土壤物质循环的直接媒介，可作为反映土壤微生物群落活性的指标之一。因此，提供一种操作迅速、灵敏度高、批量读取数据和结果精准的外切葡聚糖酶活性检测方法具有很重要的意义。
我国凋落物外切葡聚糖酶活性的测定是在土壤酶学活性测定方法基础上的改进，但对森林凋落物外切葡聚糖酶活性测定的研究存在着技术更新换代慢、方法粗放繁琐以及测定结果易受其他纤维素酶干扰等诸多问题。其中以微晶纤维素作底物的比色法，酶解产物用DNS试剂显色后比色测定，但反应本身是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用结果，并不能真实反映外切葡聚糖酶活力，且DNS显色试剂的配制时间、沸水浴中反应的激烈程度等进一步降低了结果的可靠性；以对-硝基酚纤维二糖苷为底物进行酶解的比色法虽操作简单，但需添加其它酶的抑制剂，且操作时间过长，需要酶液过多，增加应用中的不便。并且由于森林中原有凋落物构成复杂：可能有的表层凋落物没有或者很少有降解微生物定殖，微生物分泌胞外外切葡聚糖酶少，也有可能有的凋落物已经处于降解末期。这种复杂情况不利于多种样本之间进行比较研究酶活性及其变化差异，因此凋落物外切葡聚糖酶活性的检测比土壤酶活测定在前期也需要更多人工干预，使之标准化，以利于凋落物降解过程的研究。
综上，目前需要提供一种新的、标准化、快速便捷的凋落物外切葡聚糖酶活性的检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，包括如下步骤：
1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管中离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；
2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热，使酶灭活，成为灭活酶液；
3)配制梯度浓度的4-甲基伞形酮(MUB)荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；
4)酶标板的酶标孔中分别加入酶活待测液和灭活酶液，再分别加入含有4-MUB-β-D-纤维素二糖苷的荧光底物工作液进行反应，随后加入终止液终止反应；
5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；
6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；
7)计算酶活待测液的稀释因子；
8)计算酶活待测液的比酶活。
优选地，所述的检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，包括如下步骤：
1)将待测凋落物剪碎过2mm筛，每个样品称取3个0.15g分别加入3个离心过滤管中，分别加入600μL pH4.5的培养缓冲液，在4℃下孵育60min后，4℃下16000×g离心30min得到酶滤液后并混合，用培养缓冲液调节体积至4mL，制得酶活待测液；
2)从步骤1)制备的酶活待测液吸取1mL，在避光条件下85℃加热2h，冷却至室温，得到灭活酶液；
3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；
4)在黑色酶标板上，将33.3μL酶活待测液加入样品孔，再将33.3μL灭活酶液加入阴性对照孔；将600μM荧光底物工作液，即600μM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷溶液，按每孔66.7μL加入到所述样品孔和阴性对照孔中；在避光22℃的条件下160rpm震荡孵育反应30min后，迅速向所有样品孔和阴性对照孔中加入100μL pH10-11的1M Tris终止液终止反应；
5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；
6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；
7)计算待测样品的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)，200μL为100μL的反应液加100μL终止液体积，4mL为培养缓冲液调节混合酶滤液后的酶活待测液体积，33.3μL为100μL反应液中加入的酶活待测液体积，X为混合酶滤液的体积；
8)计算待测样品的比酶活：(A活-A阴)*D/(b*t*m)，比酶活单位为pmol/min/g，A活为样品酶活反应液的吸光值，A阴为样品对应灭活酶液的吸光值，D为稀释因子，b为标准曲线斜率，t为震荡孵育时间15min，m为3个离心过滤管凋落物的干重，单位为g。
优选地，步骤1)中所述培养缓冲液，其制备方法为：将6.05gTris、7.8g马来酸、7.0g柠檬酸或7.65g一水柠檬酸、3.12g硼酸，和244mL 1M氢氧化钠，用去离子水定容至500mL得到通用缓冲液原液，再将所述通用缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃贮存，作为培养缓冲液备用。
优选地，步骤3)具体为：称取8.8mg MUB溶入1mL乙二醇单甲醚中，再加入4mL无菌去离子水混合均匀，制成MUB母液；取20μL上步MUB母液用无菌去离子水稀释体积至20mL作为校准液，其浓度为10μM，避光4℃保存一周内备用；取适量MUB校准液用无菌去离子水依次稀释为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液；在黑色酶标板上，依次加入100μL浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，4次重复，再分别加入100μLpH10-11的1M Tris终止液后，采用多功能酶标仪进行荧光检测。
优选地，步骤4)中所述600μM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷溶液，其制备方法为：称取17.2mg 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷溶入2mL乙二醇单甲醚中，加入8mL无菌去离子水混合均匀，制备成5mM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷母液；取所述4-MUB-β-D-纤维素二糖苷母液按照3∶22的比例加入无菌去离子水进一步稀释成600μM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷工作液，-20℃冷冻贮存半年内备用。
优选地，步骤3)或步骤5)所述的多功能酶标仪，设置其激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为500ms。
优选地，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的枯枝或落叶，经过杀青和烘干后，放入尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝或落叶，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。
优选地，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的直径为5mm的枯枝，经过105℃杀青15min，80℃连续烘干48h后，称取7～10g放入300目10cm*8cm尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中，即在距离树主干1m用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。
与传统分析方法相比较，本发明方法的主要优点有：
1)提供了一种标准的检测土壤凋落物中外切葡聚糖酶活性的方法，采用4-甲基伞形酮(MUB)共轭纤维素二糖苷(4-MUB-β-D-纤维素二糖苷)作为酶解底物，通过外切葡聚糖酶酶解释放荧光，通过多功能酶标仪收集MUB荧光强度的变化计算出酶活性；
2)相比传统方法，本发明有着反应体系优化、反应酶液少、反应条件一致、灵敏度高、操作简单等优点，可批量操作大大提高了酶活测试效率；
3)采用微小孔径离心过滤管，大大降低了酶液中的干扰物质，也减少了其它酶活和人为操作干扰，灵敏度高，结果可靠；
4)将反应体系置于酶标板的孔内，避光震荡培养后添加终止液即可上机操作，短时间内批量获得结果数据，效率高效；
5)提供了待测凋落物的制备方法，使得影响凋落物酶活的主要因素，包括凋落物类型、环境条件和时间等都在控制之下，这样不同样品凋落物外切葡聚糖酶活性检测结果就具有了相互参考和比较的可能，有利于研究凋落物酶对森林凋落物分解的微观生态过程的影响作用。
附图说明
图1为用于检测凋落物外切葡聚糖酶活性的酶标板结构及加样示意图；S1为33.3μL样品1酶活待测液+66.7μL荧光共轭纤维素二糖苷工作液+100μL终止液，S2为33.3μL样品2酶活待测液+66.7μL荧光共轭纤维素二糖苷工作液+100μL终止液，依此类推；N1为33.3μL样品1灭活酶液+66.7μL荧光共轭纤维素二糖苷工作液+100μL终止液，N2为33.3μL样品2灭活酶液+66.7μL荧光共轭纤维素二糖苷工作液+100μL终止液，依此类推；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1：建立检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法
1、试剂配制：
1M氢氧化钠溶液：19.998g氢氧化钠，用去离子水定容至500mL配制，室温贮存。
通用缓冲液原液：以6.05gTris、7.8g马来酸、7.0g柠檬酸(或7.65g一水柠檬酸)、3.12g硼酸，和244mL氢氧化钠(1M)，用去离子水定容至500mL。
培养缓冲液：将100mL通用缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃贮存备用。
终止缓冲液(1M Tris；pH 10-11)：64.5克Tris加入到450mL去离子水中，去离子水定容至500mL，灭菌后室温下贮存备用。
MUB荧光标准物质系列溶液：称取8.8mg MUB溶入1mL乙二醇单甲醚中，再加入4mL无菌去离子水混合均匀，制成MUB母液；取20μL上步MUB母液用无菌去离子水稀释体积至20mL作为校准液，其浓度为10μM，避光4℃保存一周内备用；取适量MUB校准液用无菌去离子水依次稀释为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液。
600μM荧光共轭纤维素二糖苷(4-MUB-β-D-纤维素二糖苷)溶液：称取17.2mg 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷溶入2mL乙二醇单甲醚中，加入8mL无菌去离子水混合均匀，制备成5mM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷母液，不能直接冷冻，否则会有底物晶体析出；取一定量4-MUB-β-D-纤维素二糖苷母液按照3∶22的比例加入无菌去离子水进一步稀释成600μM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷工作液，-20℃冷冻贮存半年内备用。
2.检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法步骤：
1)将待测的凋落物样品剪碎过2mm筛后，每个样品称取3个0.15g左右(记录具体数值)分别加入3个称重过的2mL离心过滤管(Corning，CA，0.22μm)；加入pH 4.5的培养缓冲液600μL，在4℃下孵育60min进行16000×g(4℃条件下)离心30min得到酶滤液，将酶滤液混合至5mL无菌离心管中，用培养缓冲液调节体积至4mL作为酶活待测液，放置于4℃冰箱避光保存备用。将上步制备的酶活待测液吸取1mL放入1.5mL或2mL离心管，在避光条件下85℃高温加热2h使酶液灭活充分，冷却至室温备用，作为灭活酶液。
2)制作标曲时，在黑色酶标板上按照顺序依次加入100μL已知系列浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，各4次重复。
3)将酶活待测液和灭活酶液按照序号分别加入2mL深孔联排板中，以便微量排枪吸取，减少操作时间。用微量排枪将33.3μL待测酶液和灭活酶液分别加入酶活孔(3次重复，图1所示左起第1-3列，5-7列，9-11列)和阴性对照孔(1样1孔，图1所示左起第4列，8列，12列)；用微量排枪将66.7μL体积的600μM荧光底物(4-MUB-β-D-纤维素二糖苷)工作液加入到上述酶标孔中。在避光的条件下，22℃震荡(160rpm)孵育30min。
4)迅速向所有酶标孔(含标曲孔)加入100μL体积1M Tris(pH10-11)终止液终止反应。采用多功能酶标仪进行荧光检测，激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为500ms，测定的对应吸光值为A。
5)以已知稀释浓度的MUB荧光标准物质溶液和测定的对应吸光值A绘制相应的荧光标准曲线，计算得到斜率b。
6)计算凋落物样品酶的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)
式中：200μL为上机测试液的体积，即100μL(33.3μL+66.7μL)反应液加100μL终止液体积；4mL为样品酶液总体积，即酶滤液混合后用培养缓冲液调节后的体积；33.3μL为100μL反应液中加入的酶活待测液体积，X为离心过滤管高速离心后酶滤液的混合体积(具体数值由滤液质量换算，单位mL，1g为1mL)。
7)计算待测样品的比酶活(pmol/min/g)＝(A活-A阴)*D/(b*t*m)
式中：A活为样品待测酶活反应液的吸光值，A阴为对照灭活酶液的吸光值，D为稀释因子，b为标曲斜率，t为反应液震荡孵育时间30min，m为测试样品凋落物的干重(将3个离心过滤管连同其中的凋落物烘干后得到的重量除去离心过滤管的自重；单位g)。
实施例2：枫香纯林与枫香黑松混交林凋落物外切葡聚糖酶活性的检测
本实施例所使用的凋落物枝条采自江苏省南京市紫金山(32°04′N，118°50′E)西南麓枫香纯林与枫香黑松混交林。将采集的直径5mm枫香枝条105℃杀青15min，80℃连续烘干48h，称取7g干重放入300目(0.050mm孔径)10cm*8cm尼龙分解袋中。将装有烘干枫香枝条的尼龙分解袋分别埋入枫香纯林与枫香黑松混交林中，距离树主干1m左右用原表层土壤(0-10cm)覆盖并轻轻压实。埋藏1年之后，取出处于半降解的凋落物枝条，去除泥沙等杂质，处理1为枫香纯林凋落物枝条，处理2为枫香黑松混交林凋落物枝条，各处理3次重复，凋落物外切葡聚糖酶活性检测的具体方法和步骤同实施例1。具体操作步骤如下：
1)将待测的枫香枝条剪碎过2mm筛后，每个样品称取3个0.15g左右(记录具体数值)分别加入到3个称重过的2mL离心过滤管(Corning，CA，0.22μm)；加入pH 4.5的培养缓冲液600μL，在4℃下孵育60min 16000×g(4℃条件下)离心30min，将酶滤液混合至5mL无菌离心管中，用培养缓冲液调节体积至4mL，放置于4℃冰箱避光保存备用，作为酶活待测液。将灭活酶液吸取1mL放入1.5mL或2mL离心管，在避光条件下85℃高温加热2h使酶液灭活充分，冷却至室温备用。
2)制作标曲时，按照顺序依次加入100μL已知系列浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，各4次重复。
3)将酶活待测液和灭活酶液按照序号分别加入2mL深孔联排板中，以便微量排枪吸取，减少操作时间。用微量排枪将33.3μL酶活待测液和灭活酶液分别加入酶活孔(3次重复)和阴性对照孔(1样1孔)；用微量排枪将66.7μL体积的750μM荧光底物(4-MUB-β-D-纤维素二糖苷)工作液加入到上述酶活孔和阴性对照孔中。在避光的条件下，22℃震荡(160rpm)孵育30min。
4)迅速向所有酶标孔(含标曲孔)加入100μL体积1M Tris(pH10-11)终止液终止反应。采用多功能酶标仪进行荧光检测，激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为500ms，测定的对应吸光值为A。
5)以已知稀释浓度的MUB荧光标准物质溶液和测定的对应吸光值A绘制相应的荧光标准曲线，计算得到斜率b＝3.331。
6)计算待测酶液的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)
式中：200μL为上机测试液的体积，即100μL(33.3μL+66.7μL)反应液加100μL终止液体积；4mL为酶活待测液总体积，即酶滤液混合后用培养缓冲液调节后的体积；33.3μL为100μL反应液加入的酶活待测液体积，X为离心过滤管高速离心后酶滤液的混合体积(具体数值由滤液质量换算，单位mL，1g为1mL)。
7)计算枫香枝条凋落物的比酶活(pmol/min/g)＝(A活-A阴)*D/(b*t*m)
式中：A活为样品待测酶活反应液的吸光值，A阴为对照灭火酶液的吸光值，t为反应液震荡孵育时间30min，m为测试样品枫香枝条的干重(将3个离心过滤管连同其中的枫香枝条烘干后得到的重量除去离心过滤管的自重；单位g)。试验结果如下表所示：
由上表数据可以看出，各处理之间外切葡聚糖酶活性结果差异达到显著水平，较小的标准差表明该分析方法活性结果之间的偏差较小，精确度高，重现性好。
实施例3：尾巨桉人工林凋落物外切葡聚糖酶活性的检测
本实施例所使用的凋落物枝条采自广东省湛江市南方种苗基地(21°27′N，110°11′E)4年生和9年生尾巨桉人工林。将采集的5mm直径尾巨桉凋落物枯枝105℃杀青15min，80℃连续烘干48h，称取10g干重放入300目(0.05mm孔径)10cm*8cm尼龙分解袋中。将装有烘干尾巨桉枯枝的尼龙网袋分别埋入4年生和9年生尾巨桉人工林中，距树主干1m左右用原表层土壤(0-10cm)覆盖并轻轻压实。埋藏4个月之后，取出处于半降解的凋落物，去掉泥沙等杂质，处理1为4年生尾巨桉人工林凋落物枝条，处理2为9年生尾巨桉人工林凋落物枝条，各处理3次重复，测得标准曲线斜率b为3.2986，详细操作步骤同实施例2。试验结果如下表所示：
表中数据同样显示了此分析方法结果的准确性，拥有较高的精密度和重现性，同时表明不同林龄对桉树枝条凋落物外切葡聚糖酶的活性影响较大。