阅读说明：本技术 一种功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用 (Functional nucleic acid fluorescence sensor and application thereof in lead ion detection ) 是由 吴继魁 贾敏 张俊玲 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用,属于生物化学技术领域。本发明设计的脱氧核酶和分子信标可作为铅离子的识别元件、信号扩增介导和信号发射元件。方法具体步骤如下：将脱氧核酶、核酶底物杂交混合于缓冲液中,加入分子信标、DNA聚合酶、限制性内切酶、多聚核苷酸激酶、dTNPs和待测液；将混合体系在特定条件下恒温孵育,冷却至室温,通过检测体系荧光强度,实现对铅离子的高灵敏快速检测。本发明通过设计的脱氧核酶和分子信标构建了自动等温级数扩增策略,无需分离操作,在单管中完成加样-孵育-检测过程,实现了对样品中铅离子高灵敏快速检测。(The invention relates to a functional nucleic acid fluorescence sensor and application thereof in lead ion detection, belonging to the technical field of biochemistry. The deoxyribozyme and the molecular beacon designed by the invention can be used as a recognition element, a signal amplification mediation element and a signal emission element of lead ions. The method comprises the following specific steps: hybridizing and mixing deoxyribozyme and ribozyme substrate in a buffer solution, and adding a molecular beacon, DNA polymerase, restriction endonuclease, polynucleotide kinase, dTNPs and a solution to be detected; incubating the mixed system at constant temperature under specific conditions, cooling to room temperature, and detecting the fluorescence intensity of the system to realize high-sensitivity rapid detection of lead ions. According to the invention, an automatic isothermal amplification strategy is constructed through the designed deoxyribozymes and molecular beacons, separation operation is not required, the processes of sample adding, incubation and detection are completed in a single tube, and high-sensitivity and rapid detection of lead ions in a sample is realized.)

一种功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用

技术领域

本发明涉及一种功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

GR-5脱氧核酶是通过体外筛选技术得到的单链DNA，是对铅离子具有高度特异性的识别元件。分子信标是茎环状寡链核苷酸，其基本原理是在寡链核苷酸的两端分别标记荧光基团和猝灭基团，当靶标DNA与分子信标相互杂交，分子信标的荧光基团与猝灭基团能量共振转移过程被切断进而恢复荧光信号。

等温核酸信号扩增策略是一种高效的核酸序列扩增策略，其在信号扩增过程中无需精密的温控设备和复杂的操作过程。与PCR技术相比，等温核酸信号扩增具有简单、快速、廉价等优点，其在DNA、RNA、细胞、蛋白、小分子以及金属离子高灵敏检测中具有巨大的潜在应用前景和价值。

铅离子是危险的重金属污染源之一，它严重危害人类身体健康，特别是对幼年儿童的身体健康和智力发育有着尤为严重的影响。并且，铅离子(Pb²⁺)污染也广泛分布于自然环境、生活用品以及食品中，因此需要对其实施高灵敏的检测。传统的检测方法需要复杂昂贵的仪器、繁琐的检测过程和专业的技术人员，难以满足人们对高灵敏、廉价、简单、实时、快速的检测铅离子含量的急迫需求。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，本发明提出了一种功能核酸荧光传感器，以及该荧光传感器在铅离子检测中的应用。

为了实现上述目的，本发明设计了脱氧核酶、核酶底物和分子信标，构建了等温级联扩增策略的荧光分析方法，对铅离子实现高灵敏快速检测。

本发明提供的功能核酸荧光传感器，包括脱氧核酶、核酶底物、分子信标、DNA聚合酶、限制性内切酶、多聚核苷酸激酶和dTNPs。

所述脱氧核酶序列如SEQ No.1所示；为了便于描述在本发明中将其命名为GR-5E1。

所述核酶底物序列如SEQ No.2所示，其中rA为腺嘌呤核糖核苷酸；为了便于描述在本发明中将其命名为GR-5S1。

所述分子信标序列如SEQ No.3所示，其中5′端被荧光基团标记、3′端被荧光猝灭基团标记，本发明中使用的荧光基团为FAM、荧光猝灭基团为Dabcyl；为了便于描述在本发明中将分子信标命名为MB。

进一步地，所述DNA聚合酶为大片段Bsm DNA聚合酶。

进一步地，所述限制性内切酶为限制性内切酶为Nb.Bpu10I。

进一步地，所述多聚核苷酸激酶为T4PNK。

进一步地，所述dTNPs为dATP、dCTP、dGTP、dTTP的等摩尔混合物，本发明中使用的为各10mM的混合物。

本发明还提供了一种上述功能核酸荧光传感器在铅离子检测中的应用。

应用上述功能核酸荧光传感器进行铅离子检测的步骤如下：

(1)制备脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液、分子信标缓冲液

将脱氧核酶、核酶底物、分子信标溶解于缓冲液中，得到脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液和分子信标缓冲液；

(2)绘制标准曲线

①将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，加入分子信标缓冲液、DNA聚合酶、限制性内切酶、多聚核苷酸激酶、dTNPs溶液以及浓度已知的铅离子标准溶液，混合均匀；

②加入缓冲液将步骤①得到的混合液定容；

③将步骤②得到的混合反应体系放置于恒温孵育器中孵育；

④将步骤③得到的混合反应体系进行荧光检测，记录该铅离子标准溶液对应的荧光强度峰值；

⑤使用一系列浓度已知的铅离子标准溶液代替步骤①中的铅离子标准溶液，重复步骤①②③④的操作，得到一系列铅离子标准溶液的荧光强度峰值，以铅离子标准溶液的铅离子浓度对数值为横坐标，以铅离子标准溶液的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线；

(3)待测样品检测

将步骤(2)①中的铅离子标准溶液替换为待测样品，重复步骤(2)①②③④的操作得到待测样品的荧光强度峰值，将待测样品的荧光强度峰值带入标准曲线的回归方程中，计算出待测样品中铅离子的浓度。

进一步的，步骤(1)和步骤(2)②所用的缓冲液为Bsm R缓冲液，其组成为：10mMTris-HCl(pH＝8.5)、10mM MgCl₂、100mM KCl、0.1mg/ml BSA。

进一步地，步骤(2)③为将步骤②得到的混合反应体系放置于恒温孵育器中37℃下孵育40min，然后在80℃下孵育15min。

进一步地，步骤(2)④中测定荧光强度时，采用的激发波长与发射波长根据所述荧光基团的激发波长与发射波长进行确定。基于本发明中使用分子信标的荧光基团为FAM、荧光猝灭基团为Dabcyl；所以荧光检测的条件为：激发波长为492nm、发射波长为520nm。

应用本发明所述的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测的原理如下：

如图1所示，当体系中存在Pb²⁺，GR-5E1将其对应的底物链切割为两部分。然后，BsmDNA聚合酶以片段的5′端部分为引物，以GR-5E1为模板进行复制形成双链DNA。接下来，限制性内切酶Nb.Bpu10I切刻双链DNA的特异识别位点，然后Bsm DNA聚合酶再次以该切口为起点进行链替代复制形成双链DNA。同时，生成能够与MB相互结合的寡链Target DNA。TargetDNA与MB杂交将发卡结构打开释放出荧光信号，同时因为GR-5E1切割而游离的底物片段(右3′端部分P₂)与MB-Target DNA复合物的左端相互杂交形成MB-target-P₂。然后，Bsm DNA聚合酶以P₂为引物，以MB为模板进行等温链替代形成双链DNA同时替代产生新的Target DNA，新的Target DNA再次与下一个MB相互杂交。如此进行等温级联扩增，痕量的Pb²⁺就可以使得大量的荧光猝灭的MB茎环结构打开，释放强烈的荧光信号。因此，通过等温反馈级数扩增的体系能够超高灵敏的检测体系中Pb²⁺的含量。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过设计的脱氧核酶和分子信标构建了自动等温级联扩增策略，无需分离操作，在单管中完成加样-孵育-检测过程，实现了对样品中铅离子高灵敏度快速检测。

(2)本发明设计的脱氧核酶和分子信标稳定、易于合成和修饰、成本低廉且生物相容性好。

(3)与其他传统检测方法相比，本发明检测方法操作简单且检测时间短。

(4)本发明检测方法灵敏度高，检测限低。

附图说明

图1为功能核酸荧光传感器检测铅离子的原理示意图。

图2为检测铅离子可行性凝胶电泳图。

图3为体系各物质对分子信标荧光释放的影响图。

图4为功能核酸荧光传感器检测铅离子的标准曲线。

图5为不同Pb²⁺浓度的铅离子标准溶液的荧光强度图。

图6为检测对不同干扰离子的荧光强度图。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。

实施例1：电泳可行性验证

(1)17％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶的制备

在50mL的离心管中加入6.8mL 30％丙烯酰胺凝胶储存溶液、10×TBE 1.2mL和5.04g尿素，然后加入超纯水定容至12mL，混合均匀，超声5min排除气泡。加入6μL四甲基乙二胺和80μL 10％过硫酸铵溶液，快速混匀立刻将胶液注入胶板，静置约1h待凝胶凝固。

10×TBE缓冲液的组成为：890mM Tris硼酸，20mM EDTA，pH＝8.2-8.4(25℃)

(2)待测样的制备

将脱氧核酶、核酶底物和分子信标用Bsm R缓冲液配制为脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液和分子信标缓冲液备用；

将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，然后加入铅离子的待测液、分子信标缓冲液、2个单位的DNA聚合酶、3个单位的限制性内切酶、4个单位T4多聚核苷酸激酶和dTNPs，混合均匀，然后加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为50μL，使得脱氧核酶、核酶底物、分子信标、dTNPs、铅离子的浓度分别为1μM、1μM、1μM、250μM、1μM。将上述混合反应体系放置于恒温孵育器中37℃下孵育40min，然后将恒温孵育器的温度调至80℃孵育15min，冷却至室温备用。

(3)电泳分析过程

首先将步骤(1)制备的凝胶在电泳槽内90V预电泳1h。然后将10μL步骤(2)制备的待测样品与2μL上样缓冲液混合均匀作为样品，用微量进样针取6μL上述样品上样。接下来90V条件下电泳30min。然后160V条件下电泳直至最下面的蓝色指示剂到达凝胶底部，停止电泳。电泳过程中采用的缓冲液为1×TBE。

上样缓冲液的组成为：1％SDS，100nM EDTA，60％甘油，0.03％溴酚蓝，0.03％二甲苯青FF，pH＝7.6。

(4)银染过程

首先将进行过步骤(3)后的凝胶在10％醋酸液中洗去指示剂至凝胶透明无色，然后用超纯水漂洗3次，每次漂洗约3min。接着加入银染液银染25min，快速漂洗一次，洗去多余的银。最后加入显影液在摇床上显影约10min。用ChemiDoc XRS凝胶成像采集凝胶电泳结果。

银染液的组成为：每100mL银染液含0.1g硝酸银、150μL甲醛溶液、20μL10％硫代硫酸钠溶液；

显影液的组成为：每100mL显影液含3g碳酸氢钠和150μL甲醛溶液。

图2是检测铅离子可行性凝胶电泳图，展示的是尿素变性凝胶电泳可行性分析结果。泳道1,2,3,4对应的分别是GR-5E1，GR-5S1，Target DNA，MB；泳道5对应的是GR-5E1(1μM)+GR-5S1(1μM)+MB(1μM)且没有加入Pb²⁺的体系；泳道6对应的是GR-5E1(1μM)+GR-5S1(1μM)+MB(1μM)且加入Pb²⁺的体系。电泳结果表明，铅离子能够触发等温扩增过程，进而实现目标DNA的合成扩增。

实施例2：各物质对分子信标的荧光释放的影响

(1)将脱氧核酶、核酶底物和分子信标用Bsm R缓冲液配制为脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液和分子信标缓冲液备用。

(2)将分子信标缓冲液和P₂混合均匀；加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标的最终浓度为200nM；制备得到混合反应体系1。

(3)将分子信标缓冲液、P₂和2.5μL 10mM的dTNPs混合均匀；加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标的最终浓度为200nM；制备得到混合反应体系2。

(4)将分子信标缓冲液、P₂、2.5μL 10mM的dTNPs、3个单位的限制性内切酶混合均匀；加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标的最终浓度为200nM；制备得到混合反应体系3。

(5)将分子信标缓冲液、P₂、2.5μL 10mM的dTNPs、3个单位的限制性内切酶、2个单位的DNA聚合酶混合均匀；加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标的最终浓度为200nM；制备得到混合反应体系4。

(6)将分子信标缓冲液、P₂、2.5μL 10mM的dTNPs、3个单位的限制性内切酶、2个单位的DNA聚合酶、核酶底物缓冲液混合均匀；加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标、核酶底物的最终浓度为200nM、9nM；制备得到混合反应体系5。

(7)将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，然后加入分子信标缓冲液、P₂、2.5μL 10mM的dTNPs、3个单位的限制性内切酶、2个单位的DNA聚合酶；加入加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标、核酶底物、脱氧核酶的最终浓度为200nM、9nM、10nM；制备得到混合反应体系6。

(8)将分子信标缓冲液和Target DNA混合，加入加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标、Target DNA的最终浓度为200nM、50nM；制备得到混合反应体系7。

(9)将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，然后加入分子信标缓冲液、P₂、2.5μL 10mM的dTNPs、3个单位的限制性内切酶、2个单位的DNA聚合酶、Target DNA；加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得分子信标、核酶底物、脱氧核酶、Target DNA的最终浓度为200nM、9nM、10nM、50nM；制备得到混合反应体系8。

(10)将上述混合反应体系1-8放置于恒温孵育器中37℃下孵育40min，然后将恒温孵育器的温度调至80℃孵育15min。

(11)将混合反应体系1-8冷却至室温，用爱丁堡FS5型荧光光谱仪在激发波长为492nm、发射波长为520nm的条件下测定混合反应体系的荧光强度。

图3为体系各物质对分子信标荧光释放的影响图。可以观察到只有Target DNA存在的体系在520nm处才能检测到强烈的荧光信号。

实施例3：绘制标准溶液曲线

(1)配制铅离子标准溶液

配制Pb²⁺浓度分别为1pM、10pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM的铅离子标准溶液。

(2)绘制标准曲线

①将脱氧核酶、核酶底物和分子信标用Bsm R缓冲液配制为脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液和分子信标缓冲液备用；

②将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，然后加入分子信标缓冲液、2个单位的DNA聚合酶、3个单位的限制性内切酶、4个单位的多聚核苷酸激酶、2.5μL 10mM dTNPs和10μL 1pM铅离子待测液，混合均匀；

③加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得脱氧核酶、核酶底物、分子信标的最终浓度为10nM、9nM和200nM；

④将上述混合反应体系放置于恒温孵育器中37℃下孵育40min，然后将恒温孵育器的温度调至80℃孵育15min。

⑤将混合反应体系冷却至室温，用爱丁堡FS5型荧光光谱仪在激发波长为492nm、发射波长为520nm的条件下测定混合反应体系的荧光强度，记录该铅离子标准溶液的荧光强度峰值。

⑥依次使用Pb²⁺浓度为10pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM的铅离子标准溶液代替步骤②中的铅离子标准溶液，重复步骤②③④⑤的操作，得到一系列铅离子标准溶液的荧光强度峰值，以铅离子标准溶液的铅离子浓度对数值为横坐标，以铅离子标准溶液的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线，拟合出标准曲线的回归方程为F＝81.10+22.87×lgC，R²＝0.986，其中F代表荧光强度，C代表Pb²⁺浓度，标准曲线如图4所示。

图5为不同Pb²⁺浓度的铅离子标准溶液的荧光释放图。可以观察到随着铅离子浓度的增加体系的荧光强度迅速增大。

实施例4：对其他金属离子的选择性

①分别配置10nM的Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Pb²⁺溶液备用；配置Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺的混合溶液备用，其中每种离子的浓度各10nM；配置Zn²⁺、Co^{2 +}、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Pb²⁺的混合溶液备用，其中每种离子的浓度各10nM。

②将脱氧核酶、核酶底物和分子信标用Bsm R缓冲液配制为脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液和分子信标缓冲液备用；

③将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，然后加入分子信标缓冲液、2个单位的DNA聚合酶、3个单位的限制性内切酶、4个单位的多聚核苷酸激酶、2.5μL 10mM dTNPs和10μL超纯水，混合均匀；

④加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得脱氧核酶、核酶底物、分子信标的最终浓度为10nM、9nM和200nM；

⑤将上述混合反应体系放置于恒温孵育器中37℃下孵育40min，然后将恒温孵育器的温度调至80℃孵育15min。

⑥将混合反应体系冷却至室温，用爱丁堡FS5型荧光光谱仪在激发波长为492nm、发射波长为520nm的条件下测定混合反应体系的荧光强度，记录样品的荧光强度峰值。

⑦依次使用单一Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Pb²⁺溶液和Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Cu^{2 +}、Ni²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺的混合溶液以及Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Pb²⁺的混合溶液代替步骤③中的超纯水，重复步骤③④⑤⑥的操作，记录各样品的荧光强度峰值。

图6为检测对不同干扰离子的荧光强度图。可以观察到，只有当铅离子存在时，检测体系表现出明显的荧光强度增加，而超纯水、单一的其它金属离子或其混合物几乎没有引起体系荧光强度的增加。这说明其它金属离子不会干扰Pb²⁺的检测。

实施例5：

①采集上海海洋大学公共实验楼的自来水及上海海洋大学校园明湖的湖水，将上述水样通过无菌的微孔超滤膜(0.22μm)过滤，除去颗粒杂质。将0.9mL的自来水或湖水样品与0.1mL的Pb²⁺储备溶液加标，使得样品中的Pb²⁺浓度为5nM、10nM、20nM，依次记做1#～6#样品溶液。

②将脱氧核酶、核酶底物和分子信标用Bsm R缓冲液配制为脱氧核酶缓冲液、核酶底物缓冲液和分子信标缓冲液备用；

③将脱氧核酶缓冲液和核酶底物缓冲液混合，然后加入分子信标缓冲液、2个单位的DNA聚合酶、3个单位的限制性内切酶、4个单位的多聚核苷酸激酶、2.5μL 10mM dTNPs和10μL 1#样品溶液，混合均匀；

④加入Bsm R缓冲液将反应液的体积定容为100μL，使得脱氧核酶、核酶底物、分子信标的最终浓度为10nM、9nM和200nM；

⑤将上述混合反应体系放置于恒温孵育器中37℃下孵育40min，然后将恒温孵育器的温度调至80℃孵育15min。

⑥将混合反应体系冷却至室温，用爱丁堡FS5型荧光光谱仪在激发波长为492nm、发射波长为520nm的条件下测定混合反应体系的荧光强度，记录样品的荧光强度峰值。

⑦依次2#～6#样品溶液代替步骤③中的1#样品溶液，重复步骤③④⑤⑥的操作，记录各样品的荧光强度峰值。

⑧将1#～6#样品溶液的荧光强度峰值分别代入实施例3得到的标准曲线的回归方程中，计算出各样品溶液中Pb²⁺浓度，结果如表1所示。

表1

以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明/实用新型的专利涵盖范围内。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 一种功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用

<130> 2020.6.24

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 73

<212> DNA

<213> DNAzyme

<400> 1

tggcgtcgca gaatatgcgc ccatcctcag ccgacgccat ctgaagtagc gccgccgtat 60

agtgactcgt gac 73

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> ribozyme substrates

<400> 2

gtcacgagtc actatragga agatggcgtc gc 32

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> molecular beacons

<400> 3

tggcgtcgca gaatatgcgc ccatcctcag ctgcgacgcc a 41