海参多糖在抗新型冠状病毒中的应用
阅读说明：本技术 海参多糖在抗新型冠状病毒中的应用 (Application of sea cucumber polysaccharide in resisting novel coronavirus ) 是由 朱蓓薇 宋爽 董秀萍 周大勇 温成荣 刘正奇 祁立波 陶帅妃 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了海参多糖在抗新型冠状病毒中的应用,属于生物医学技术领域。本发明通过假病毒和真病毒模型证实了海参多糖能够通过与SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白结合,防止机体细胞的细胞膜对SARS-CoV-2病毒进行吸附和内化,从而阻止SARS-CoV-2病毒感染机体细胞,表明海参多糖具有预防和治疗新型冠状病毒所致肺炎的效果。海参多糖可制备吸入剂,进入鼻腔、气管、肺部,防止病毒的感染机体组织,用于预防和治疗新型冠状病毒；海参多糖加入护手乳液配方,可增加护手乳液抗新型冠状病毒的效果；海参多糖制成的口服液可抑制SARS-CoV-2病毒从消化系统侵入,起到预防和辅助治疗新型冠状病毒所致肺炎的作用,并具有增强免疫力、降血脂、减肥、改善肠道菌等作用。(The invention discloses application of sea cucumber polysaccharide in resisting novel coronavirus, belonging to the technical field of biomedicine. The invention proves that the sea cucumber polysaccharide can prevent the cell membrane of organism cells from adsorbing and internalizing SARS-CoV-2 virus by combining with S protein on the surface of the SARS-CoV-2 virus through a pseudovirus and a euvirus model, thereby preventing the SARS-CoV-2 virus from infecting the organism cells, and showing that the sea cucumber polysaccharide has the effect of preventing and treating pneumonia caused by novel coronavirus. The Stichopus japonicus polysaccharide can be made into inhalant, and can enter nasal cavity, trachea, and lung to prevent virus infection of organism tissue, and can be used for preventing and treating novel coronavirus; the formula of the hand protection emulsion added with the sea cucumber polysaccharide can improve the effect of the hand protection emulsion on resisting novel coronavirus; the oral liquid prepared from sea cucumber polysaccharide can inhibit SARS-CoV-2 virus from invading from digestive system, has effects of preventing and adjunctively treating pneumonia caused by novel coronavirus, and has effects of enhancing immunity, reducing blood lipid, reducing weight, improving intestinal bacteria, etc.)
技术领域
本发明涉及海参多糖在抗新型冠状病毒中的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)，正式分类命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，简称新冠病毒(novel coronavirus)。 人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病 例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
新冠病毒通过皮肤黏膜进入体内后，通过病毒表面的刺突蛋白(简称S蛋白)，与细胞上 的血管紧张素转化酶酶2(简称ACE2)受体结合，然后细胞膜将对病毒进行吸附和内化，病 毒进入细胞质后脱壳，释放基因组。基因组被释放入细胞质以后，病毒的RNA会与宿主细胞 的核糖体结合，翻译出两组蛋白质，紧接着，蛋白质水解酶会把这两组蛋白质切开，生成病 毒继续组装、复制的酶和蛋白质。新生成的酶包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，它的 作用就是复制形成新的病毒RNA。新的病毒RNA将和水解酶产生的蛋白质结合，组装成新的病毒，释放出原宿主细胞，继续感染其它细胞。根据新冠病毒的染病机理，抗新冠病毒药物的研发主要从两方面入手，一是阻止病毒和宿主细胞结合，作用靶点为S蛋白或者ACE2；二是阻止新病毒在宿主细胞内的产生，作用靶点为RdRp或者蛋白质水解酶。
海参多糖是海参体壁的一类重要营养成分，其含量可占干参总有机物的6％以上。海参多 糖由海参岩藻聚糖硫酸酯和海参岩藻糖基化硫酸软骨素组成。海参岩藻聚糖硫酸酯是一类由 L-岩藻糖聚合而成的硫酸化多糖；海参岩藻糖基化硫酸软骨素是一类主链结构由葡萄糖醛酸- 乙酰氨基半乳糖重复单元构成、带有岩藻糖基支链的硫酸化多糖。海参多糖具有增强免疫力、 降血脂、减肥、改善肠道菌群等多种功效。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是缺乏有效抑制新型冠状病毒的物质。
[技术方案]
本发明提供了海参多糖在抗冠状病毒中的用途，所述冠状病毒包括新型冠状病毒SARS-CoV-2。所述的抗冠状病毒是指预防或治疗冠状病毒所致肺炎，包括与SARS-CoV-2 病毒表面的S蛋白结合、阻止SARS-CoV-2病毒侵入机体细胞。海参多糖的这种用途可用于 制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物、食品、日化产品。
所述海参多糖来源于海参，包括楯手目海参科、楯手目刺参科、芋参目尻参科和枝手目 瓜参科的海参品种，由海参岩藻聚糖硫酸酯和海参岩藻糖基化硫酸软骨素组成。海参岩藻聚 糖硫酸酯是一类由L-岩藻糖聚合而成的硫酸化多糖；海参岩藻糖基化硫酸软骨素是一类主链 结构由葡萄糖醛酸-乙酰氨基半乳糖重复单元构成、带有岩藻糖基支链的硫酸化多糖。
本发明提供了所述海参多糖在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的用途，所述 药物以海参多糖为抑制冠状病毒进入机体细胞的活性成分。
所述药物还包括药学上可以接受的辅料，包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化 剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节 剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、 稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
所述药物的剂型可以是：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、搽剂、喷鼻剂、泡腾片、含漱剂、散剂、乳剂、混悬剂、溶液剂。
本发明提供了所述海参多糖在制备用于防护冠状病毒感染的防护用品中的用途，所述的 防护用品包括：护手乳液、洗手液、漱口水。
本发明提供了利用海参多糖制备冠状病毒感染防护用品的方法，是在制备防护用品的过 程中加入海参多糖。
本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的吸入剂的制备方法，在无菌环境中，分别用 8～50倍量的纯净水将30～50克氯化钠、70～120克枸橼酸、70～120克枸橼酸钠、0.5～2克苯扎 氯铵搅拌溶解。用500mL的纯净水将5～20克海参多糖搅拌溶解。合并以上溶液后，用纯净 水稀释至5～20升，用0.5微米滤膜过滤后，罐装。
本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的口服液的制备方法，取1～2公斤枸杞子、1～2 公斤桂圆加12～20升水煮开，文火保持0.5～3小时，过滤取滤液，浓缩至8～15升，加入40～100 克海参多糖，8～16克果胶，500～1000克蜂蜜，搅拌均匀，自然冷却，静置2～6小时，使沉淀 完全。采用压滤取滤液，添加500～1500克白糖、35～80克柠檬酸、3～10克食盐、15～60克维 生素C混匀，以硅藻土加压过滤，再经孔径为5微米和0.5微米的两级微孔滤膜过滤，再将 滤液进行巴士杀菌(70～90摄氏度，20～50分钟)，即可罐装。
本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的护手乳液的制备方法，护手乳液的配方以质 量比计如下：油相：3～6份硬脂酸，1～4份硬脂酸单甘酯，1～5份棕榈酸异丙酯，1～4份凡士 林，5～10份白矿油，1～4份十六醇，0.1～0.5份香精，0.1～0.4份尼泊金甲酯，0.1～0.4份尼泊 金丙酯；水相：5～10份甘油，0.1～0.5份尿素囊，0.1～0.4份二甲基对氯苯酚，0.5～1份三乙醇 胺，0.05～0.5份海参多糖，65～75水；
将油相(硬脂酸、硬脂酸单甘酯、棕榈酸异丙酯、凡士林、白矿油、十六醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)加热搅拌溶解；将海参多糖溶于水中，再加入甘油和三乙醇胺，加热搅拌溶解；然后在剧烈搅拌下将水相慢慢倒入油相；均质器处理后，开始加热搅拌，冷却至45～55℃时加入尿囊素、二甲基对氯苯酚和香精，继续搅拌冷却至25～35℃时出料；陈放2～3天没有变化，检验合格后包装。
[有益效果]
本发明通过真病毒模型实验证实海参多糖在3.9μg/mL及以上浓度能够通过与SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白结合防止机体细胞的细胞膜对SARS-CoV-2病毒进行吸附和内化，从而阻止SARS-CoV-2病毒感染机体细胞，表明海参多糖具有抗新型冠状病毒的效果。
海参多糖外用有保湿作用，食用海参多糖具有增强免疫力、降血糖、降血脂、减肥、改 善肠道菌群等作用，外用和口服均对人体有益无害。因此，海参多糖可制备吸入剂(喷鼻剂)， 进入鼻腔、气管、肺部，防止病毒的感染机体组织，用于预防和治疗新型冠状病毒；海参多 糖加入护手乳液配方，可增加护手乳液抗新型冠状病毒的效果，预防新型冠状病毒感染；海 参多糖制成的口服液可抑制SARS-CoV-2病毒从消化系统侵入，起到预防和辅助治疗新型冠 状病毒所致肺炎的作用，并具有增强免疫力、降血糖、降血脂、减肥、改善肠道菌等作用。
海参多糖来源于食物、无毒性，用于防治新冠病毒时，无毒副作用。
附图说明
图1将SARS-CoV-2病毒与不同浓度的海参多糖混合处理后的细胞免疫荧光图。海参多 糖的终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9μg/mL。阴性对照为空白培养基。
具体实施方式
实施例1制备海参多糖的方法
具体方法如下：
将海参(刺参，Stichopus japonicus)洗净、水煮、沥干、剪成小块，然后冻干。将冻干 样品置于4℃丙酮中浸泡24h，室温下晾干。以1g冻干样品为例，加入30mL 0.1mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH 6.0)、100mg木瓜蛋白酶(比酶活2units/mg)、48mg乙二胺四乙酸和18mg半胱氨酸，涡旋混合，于60℃水浴振荡酶解24h，将反应混合物离心(6000g，15min，室 温)，取上清液。向上清液中加入1.6mL 10％氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后， 离心(8000g，15min，室温)取沉淀。将沉淀溶解于15mL 3mol/L NaCl-乙醇(100：15v/v) 溶液中，再加入30mL 95％乙醇溶液，4℃放置24h，离心(8000g，15min，室温)取沉淀。将 沉淀用10mL80％乙醇洗2至3次后，再用10mL 95％乙醇洗2至3次，室温晾干，蒸馏水 溶解，用透析袋(3500Da)进行除盐，冻干，得海参多糖。
本实施例还可以包括溶液配制、超纯水的制备等前处理步骤。
实施例2确定实施例1所制备的海参多糖的结构特性和组成
具体方法如下：
采用1H NMR进行海参多糖结构特性和纯度检测；
采用凝胶渗透色谱法进行海参多糖分子量检测；
采用明胶比浊法进行海参多糖硫酸根含量检测；
采用高效液相色谱+PMP衍生化法进行海参多糖单糖组成检测；
采用傅里叶红外进行海参多糖官能团检测。
结果表明，海参多糖含有岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基化硫酸软骨素，岩藻聚糖硫酸酯分 子量＞670kDa，岩藻糖基化硫酸软骨素的分子量＞179kDa；硫酸根含量为26-28％；岩藻糖、 葡萄糖醛酸和氨基半乳糖的摩尔比为9:0.8:1。
实施例3使用假病毒模型评价海参多糖的抗新型冠状病毒的作用
将编码HCoV-19刺突蛋白的基因的全长序列克隆到pCAGGS载体用于假病毒的生产， 构建得到的重组载体称为pCAGGS-HCoV-19-S。通过DNA测序确认pCAGGS-HCoV-19-S构建成功。将pCAGGS-HCoV-19-S和pNL4-3质粒共转染到HEK 293T细胞，培养48h后，收 集含有SARS-CoV-2假病毒的上清液，并通过感染Huh7细胞确定假病毒的50％组织细胞感 染量(TCID50)。
使用该SARS-CoV-2假病毒模型评价海参多糖的抗新型冠状病毒的作用，具体步骤如下：
(1)选择生长状态良好的Huh7细胞，胰酶消化后，96孔铺板，培养过夜，至18-24h时细胞达到80-100％；
(2)每孔100TCID50假病毒，与含有海参多糖的无血清培养基混合，混合后海参多糖的 终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL和1mg/mL，于37摄氏度孵育30min。EK1肽作为阳性对 照，空白无血清培养基作为阴性对照。
(3)以PBS洗涤Huh7细胞去除血清后，用3倍倍比稀释病毒与海参多糖的混合物并感染Huh7细胞，每个孔100μL，每个样品设置三个平行孔，4-6h后，补加含有5％FBS血 清的培养基100μL。
(4)48h测定Luciferase值。参考Promega公司Luciferase Assay SystemProtocol或 Dual Luciferase Reporter Assay System Protocol。具体操作：倒扣96孔板，用PBS洗2遍，确 保吸干PBS，然后加入30μL的裂解液，常温裂解30min，吸出10μL于白板上，底物50μL， 测定luciferase值，结果如下表1所示。
表1
以上结果表明，海参多糖终浓度为0.1mg/mL和1mg/mL时，都能够有效的抑制SARS-CoV-2病毒进入细胞。而且由于所使用的模型为具有S蛋白的SARS-CoV-2假病毒， 可以推出海参多糖的作用靶点为S蛋白。
实施例4海参多糖对duSARS-CoV-2真病毒的作用
SARS-CoV-2真病毒(来源于第二军医大学)和海参多糖用含有5％胎牛血清的DMEM培养基混匀，使海参多糖的终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9μg/mL，37 摄氏度放置1小时，加入提前12小时接种Vero E6细胞的96孔板(加入以前吸除原细胞培 养液)，培养24小时，然后用免疫荧光检测病毒蛋白，DAPI染色细胞核。用免疫荧光显微 镜观测了500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9μg/mL八个浓度梯度的海参多糖对病 毒的抑制作用，结果如图1所示，在500～3.9μg/mL浓度范围内，海参多糖均能够显著抑制 新冠病毒对细胞的感染。
实施例5海参多糖喷鼻剂的制备方法
在无菌环境中，分别用10倍量的纯净水将40克氯化钠、100克枸橼酸、100克枸橼酸钠、 1克苯扎氯铵搅拌溶解。用500mL的纯净水将10克海参多糖搅拌溶解。合并以上溶液后，用纯净水稀释至10升，用0.5微米滤膜过滤后，罐装。
实施例6海参多糖护手乳液的制备方法
护手乳液的配方如下表2：
表2
将油相(硬脂酸、硬脂酸单甘酯、棕榈酸异丙酯、凡士林、白矿油、十六醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)加热搅拌溶解。将海参多糖溶于水中，再加入甘油和三乙醇胺，加热搅拌溶解。然后在剧烈搅拌下将水相慢慢倒入油相。均质器处理后，开始加热搅拌，冷却至50℃时加入尿囊素、二甲基对氯苯酚和香精，继续搅拌冷却至30℃时出料。陈放2～3天没有变化，检验合格后包装。
实施例7海参多糖口服液的制备方法
取1.6公斤枸杞子、1.6公斤桂圆加16升水煮开，文火保持1小时，过滤取滤液，浓缩至12升，加入60克海参多糖，12克果胶，840克蜂蜜，搅拌均匀，自然冷却，静置3小时， 使沉淀完全。采用压滤取滤液，添加910克白糖、52克柠檬酸、6.5克食盐、26克维生素C 混匀，以硅藻土加压过滤，再经孔径为5微米和0.5微米的两级微孔滤膜过滤，再将滤液进 行巴士杀菌(80摄氏度，30分钟)，即可罐装。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。