阅读说明：本技术 一种硫酸化甘露-葡聚糖的增强免疫功能活性的应用 (Application of sulfated mannan-glucan in enhancing immune function activity ) 是由 郭云良 刘英娟 金维华 朱琳 王潇璐 王悦 武筱林 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种来源于海洋生物——罗氏海盘车(starfish Asterias rollestoni)的硫酸化甘露-葡聚糖在增强免疫功能方面的应用。硫酸化甘露-葡聚糖通过酸解罗氏海盘车获得,单糖组成为葡萄糖和甘露糖(单糖比例为1:0.27),含13.85％的硫酸基。该聚糖具有显著激活小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮及炎症因子,并加强细胞自噬功能的生物活性。可以用于制备免疫增强剂的药物、保健品以及特殊医学用途配方食品。(The invention provides an application of sulfated mannan-glucan derived from marine organisms, namely starfish Asterias rolestoni, in the aspect of enhancing immune function. The sulfated mannan-glucan was obtained by acid hydrolysis of asterias rollestoni, and the monosaccharide consisted of glucose and mannose (monosaccharide ratio 1:0.27) and contained 13.85% sulfate groups. The glycan has the biological activity of remarkably activating macrophages in abdominal cavities of mice to release nitric oxide and inflammatory factors and strengthening autophagy functions of cells. Can be used for preparing immunopotentiators, health products and foods for special medical purposes.)

一种硫酸化甘露-葡聚糖的增强免疫功能活性的应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及来源于海洋生物—罗氏海盘车(starfishAsterias rollestoni)的硫酸化甘露-葡聚糖在增强免疫功能方面的应用。

背景技术：

免疫是机体对病原体、有毒化合物或辐射等病理因素引起的组织损伤和感染所做出的极其复杂的一种生理过程，机体依靠这种功能识别"自己"和"非己"成分，并通过免疫应答排除抗原性异物或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持机体生理平衡。免疫失调会引起许多疾病，包括***反应(过敏、免疫复合物型、迟发型免疫病、细胞毒型免疫病)、免疫缺陷(AIDS)等以及免疫系统受损(如艾滋病病毒破坏免疫细胞，从而使人体免疫缺失)等。因此，维持动态的免疫系统平衡是保持机体健康的前提。

海洋藻类作为独特生物活性物质的重要来源，已被广泛作为医学领域药物的新来源。罗氏海盘车，属于棘皮动物门(Echinodermata)，海星纲(Asteroidea)，分布于世界各个海洋中。海星是传统的民间中药材，其味咸，性平，主要用于治疗甲状腺肿大、瘰疬、胃痛泛酸、腹泻、中耳炎、阳痿、劳伤疼痛、风湿腰腿疼、癫痫等疾病。近年来，关于海星药效物质基础的研究相继被报道，如皂苷、甾醇、糖苷、脂质、核苷、蛋白质、生物碱等类化合物，都被证实有一定的生物学活性，但对于多糖方面的研究较少，尤其是其作用机理的研究。少量的报道显示海盘车多糖具有抗凝血及保护神经细胞的作用，关于其他多糖及其生物活性却鲜有报道。因此，本发明寻求设计提供一种硫酸化甘露-葡聚糖的增强免疫功能活性的应用，能够有效增强免疫功能。

发明内容

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本发明的目的在于克服现有技术的不足，需求提供一种硫酸化甘露-葡聚糖的增强免疫功能活性的应用，其中硫酸化甘露-葡聚糖来源于海洋生物——罗氏海盘车。

为实现上述目的，本发明涉及的一种硫酸化甘露-葡聚糖的增强免疫功能活性的应用具体技术方案如下：

本发明涉及的硫酸化甘露-葡聚糖的具体制备工艺按照如下方式进行：

将干燥的干燥罗氏海盘车经异丙醇和乙醇脱脂处理后，再将其在60℃温度下干燥，然后用0.15mol/L HCl稀酸在60℃条件下浸提2h；浸提液经0.1M NaOH中和后，进行透析，于流水中透析24h后改用双蒸水再次透析24h，离心后醇沉后获得罗氏海盘车粗多糖，该粗多糖加入1％(m/v)胰蛋白酶溶液中于37℃进行脱蛋白处理，离心收集上清冻干，将冻干样品通过阴离子柱层析(DEAE-Bio agarose FF(50mm×40cm))得到水洗组分和NaCl组分，其中所得NaCl组分即为本发明所指硫酸化甘露-葡聚糖；

进一步的，本发明中所述的透析脱盐所用透析袋的截留分子量为1kD；

进一步的，本发明中所述的硫酸化甘露-葡聚糖的分子量为151.1kD。

经检验，按照本发明所述方法制备和分级提取的硫酸化甘露-葡聚糖单糖组成为葡萄糖和甘露糖，单糖组成为1:0.27，总糖得率为85.31％，硫酸根含量为13.85％。

验证制得的硫酸化甘露-葡聚糖检测其对RAW 264.7细胞的激活作用，具体操作步骤按照如下方式进行：

S1、材料选择：选用巨噬细胞RAW 264.7细胞，采用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM高糖培养液，置于37℃，该培养箱中二氧化碳与空气的比例为5:95；

S2、Griess试剂法检测RAW264.7细胞NO的释放情况

取对数生长期的RAW264.7细胞，经细胞刮刀刮取后，吹打成单细胞悬液，离心，然后用DMEM培养基重悬稀释成1×10⁵细胞/mL，接种于96孔板中，每孔100μL于CO₂培养箱中孵育；待细胞贴壁后，吸弃原培养基，加入新鲜配制培养基(包括：加入不同浓度硫酸化甘露-葡聚糖(0.625μg/mL-320μg/mL)的培养基、加入1μg/mL脂多糖(LPS)作为阳性对照的培养基及加入等体积PBS的培养基)，继续培养24h，每个样品设置3个复孔；培养结束后，取新鲜配制Griess(A:B＝1:1)混合试剂50μL与每孔50μL的培养上清混合，室温避光孵育10min后，在550nm处测定吸光度值。

以不同浓度的NaNO₂与Griess(A:B＝1:1)混合试剂反应，绘制标准曲线，计算硫酸化甘露-葡聚糖作用于RAW 264.7细胞后NO的生成量；

经测试表面不同浓度的硫酸化甘露-葡聚糖作用于RAW 264.7细胞后，NO的释放量逐渐增加，当硫酸化甘露-葡聚糖的浓度为1.25μg/mL时，NO的释放量显著增加，随着硫酸化甘露-葡聚糖的浓度达到80μg/mL时，NO的释放量与阳性对照组LPS相近，表明硫酸化甘露-葡聚糖可以显著促进RAW 264.7细胞释放NO，进而诱导免疫的发生；

S3、Western blot法检测RAW264.7细胞因子及自噬相关蛋白表达情况

取对数生长期的RAW264.7细胞，经细胞刮刀刮取后，吹打成单细胞悬液，离心，然后用DMEM培养基重悬稀释成1×10⁶细胞/mL，接种于6孔板中，每孔2mL于CO₂培养箱中孵育；待细胞贴壁后，吸弃原培养基，加入新鲜配制培养基(包括：加入不同浓度硫酸化甘露-葡聚糖(0.625μg/mL-320μg/mL)的培养基及加入等体积PBS的培养基)，继续培养0h、1h、3h、6h、9h，每个样品设置3个复孔，培养结束后，收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA在冰上对细胞进行裂解30min，离心，收集细胞裂解液；

应用BCA蛋白测定试剂盒检测细胞裂解液的蛋白浓度，用裂解液调整所有样品组处在同一个蛋白浓度，加入含β巯基乙醇的上样缓冲液，沸水5min，对蛋白进行变性处理，将该混合液进行垂直电泳分离，浓缩胶设定恒压80V，分离胶设定电压120V，电泳结束后，将胶上蛋白采用湿转的方式电转至PVDF膜上，利用抗原—抗体原理，检测细胞因子及自噬相关蛋白的表达情况；

经测定发现，硫酸化甘露-葡聚糖显著地促进了RAW264.7细胞中炎症因子的释放，硫酸化甘露-葡聚糖对IL-6和IL-1β的表达呈时间依赖性，作用细胞3h后，其表达量显著增加，硫酸化甘露-葡聚糖作用细胞3h后，TNF-α的表达量达到最高。

同时，硫酸化甘露-葡聚糖作用于细胞1h后，Beclin 1及LC3Ⅱ/Ⅰ的表达显著增加，具有统计学意义，表明硫酸化甘露-葡聚糖显著地激活了RAW264.7细胞的自噬，促进了细胞的免疫反应。

本发明制备的硫酸化甘露-葡聚糖能够用于提高人体的免疫力。

本发明制备的硫酸化甘露-葡聚糖能够制备成为一种提高免疫力的药物或保健品，其呈片剂、胶囊、口服液、软胶囊、散剂、酊剂、粉针剂、水针剂、小输液的形式。

本发明与现有技术相比，取得的有益效果如下：

1、本发明硫酸化甘露-葡聚糖具有良好的生物相容性，可以长期服用，且在药用剂量范围内无明显毒副作用；

2、本发明具有毒副作用小、安全有效等诸多优点，在增强免疫方面具有广阔的开发应用前景；

3、本发明整体构思巧妙，制备工艺简单且制备效率高，同时制备的硫酸化甘露-葡聚糖在增强免疫功能活性方面具有良好的应用环境，市场前景极为广阔。

附图说明：

图1为本发明涉及的硫酸化甘露-葡聚糖促进RAW264.7细胞NO的释放原料示意图。

图2为本发明涉及的硫酸化甘露-葡聚糖对RAW264.7细胞炎症因子的作用原理示意图。

图3为本发明涉及的硫酸化甘露-葡聚糖促进RAW264.7细胞的自噬作用原理示意图。

具体实施方式

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下面本发明将通过实施例进行具体说明。应理解，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：

本实施例涉及一种硫酸化甘露-葡聚糖的增强免疫功能活性的应用，涉及的硫酸化甘露-葡聚糖的制备方法具体操作步骤如下：

将干燥的干燥罗氏海盘车经异丙醇和乙醇脱脂处理后，再将其在60℃温度下干燥，然后用0.15mol/L HCl稀酸在60℃条件下浸提2h；浸提液经0.1M NaOH中和后，进行透析，于流水中透析24h后改用双蒸水再次透析24h，离心后醇沉后获得罗氏海盘车粗多糖，该粗多糖加入1％(m/v)胰蛋白酶溶液中于37℃进行脱蛋白处理，离心收集上清冻干，将冻干样品通过阴离子柱层析(DEAE-Bio agarose FF(50mm×40cm))得到水洗组分和NaCl组分，其中所得NaCl组分即为本发明所指硫酸化甘露-葡聚糖；

进一步的，本实施例中所述的透析脱盐所用透析袋的截留分子量为1kD；

进一步的，本实施例中所述的硫酸化甘露-葡聚糖的分子量为151.1kD。

经检验，按照本实施例中所述方法制备和分级提取的硫酸化甘露-葡聚糖单糖组成为葡萄糖和甘露糖，单糖组成为1:0.27，总糖得率为85.31％，硫酸根含量为13.85％。

实施例2：

验证制得的硫酸化甘露-葡聚糖检测其对RAW 264.7细胞的激活作用，具体操作步骤按照如下方式进行：

主要操作如下：

S1、材料选择：选用巨噬细胞RAW 264.7细胞，采用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM高糖培养液，置于37℃培养箱中培养，该培养箱中二氧化碳与空气的比例为5:95；

S2、Griess试剂法检测RAW264.7细胞NO的释放情况

取对数生长期的RAW264.7细胞，经细胞刮刀刮取后，吹打成单细胞悬液，离心，然后用DMEM培养基重悬稀释成1×10⁵细胞/mL，接种于96孔板中，每孔100μL于CO₂培养箱中孵育。待细胞贴壁后，吸弃原培养基，加入新鲜配制培养基(包括：加入不同浓度硫酸化甘露-葡聚糖的培养基、加入1μg/mL脂多糖(LPS)作为阳性对照的培养基及加入等体积PBS的培养基)，继续培养24h，每个样品设置3个复孔。培养结束后，取新鲜配制Griess(A:B＝1:1)混合试剂50μL与每孔50μL的培养上清混合，室温避光孵育10min后，在550nm处测定吸光度值。

以不同浓度的NaNO₂与Griess(A:B＝1:1)混合试剂反应，绘制标准曲线，计算硫酸化甘露-葡聚糖作用于RAW 264.7细胞后NO的生成量，结果如图1所示。

图1结果表明，不同浓度的硫酸化甘露-葡聚糖作用于RAW 264.7细胞后，NO的释放量逐渐增加。当硫酸化甘露-葡聚糖的浓度为1.25μg/mL时，NO的释放量显著增加，随着硫酸化甘露-葡聚糖的浓度达到80μg/mL时，NO的释放量与阳性对照组LPS相近，表明硫酸化甘露-葡聚糖可以显著促进RAW 264.7细胞释放NO，进而诱导免疫的发生。

S3、Western blot法检测RAW264.7细胞因子及自噬相关蛋白表达情况

取对数生长期的RAW264.7细胞，经细胞刮刀刮取后，吹打成单细胞悬液，离心，然后用DMEM培养基重悬稀释成1×10⁶细胞/mL，接种于6孔板中，每孔2mL于CO₂培养箱中孵育。待细胞贴壁后，吸弃原培养基，加入新鲜配制培养基(包括：加入不同浓度硫酸化甘露-葡聚糖的培养基及加入等体积PBS的培养基)，继续培养0h、1h、3h、6h、9h，每个样品设置3个复孔。培养结束后，收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA在冰上对细胞进行裂解30min，离心，收集细胞裂解液。

应用BCA蛋白测定试剂盒检测细胞裂解液的蛋白浓度，用裂解液调整所有样品组处在同一个蛋白浓度。加入含β巯基乙醇的上样缓冲液，沸水5min，对蛋白进行变性处理。将该混合液进行垂直电泳分离，浓缩胶设定恒压80V，分离胶设定电压120V。电泳结束后，将胶上蛋白采用湿转的方式电转至PVDF膜上，利用抗原—抗体原理，检测细胞因子及自噬相关蛋白的表达情况，结果如图2和图3所示。

图2为硫酸化甘露-葡聚糖对RAW264.7细胞因子的作用。上述测定结果提示，硫酸化甘露-葡聚糖显著地促进了RAW264.7细胞中炎症因子的释放。硫酸化甘露-葡聚糖对IL-6和IL-1β的表达呈时间依赖性，作用细胞3h后，其表达量显著增加。硫酸化甘露-葡聚糖作用细胞3h后，TNF-α的表达量达到最高。

图3为硫酸化甘露-葡聚糖对RAW264.7细胞自噬相关蛋白表达的作用。上述测定结果提示，硫酸化甘露-葡聚糖作用于细胞1h后，Beclin1及LC3Ⅱ/Ⅰ的表达显著增加，具有统计学意义，表明硫酸化甘露-葡聚糖显著地激活了RAW264.7细胞的自噬，促进了细胞的免疫反应。