阅读说明：本技术 硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用 (Application of sulfated glucuronic acid-xylo-rhamnosan in enhancing immune function ) 是由 刘英娟 郭云良 金维华 朱琳 王潇璐 王悦 武筱林 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用。该聚糖通过酸解浒苔获得,主要组成单糖包括葡糖醛酸(Glca)、木糖(Xyl)和鼠李糖(RHA)等。其制备方法：室温酸解—过滤—中和浓缩—乙醇沉淀—阴离子柱层析—水解—乙醇沉淀—Bio-Gel P-10 Gel柱层析—冷冻干燥。通过该方法制备的聚糖具有性能稳定、成本低廉、安全性高、药用价值大等特点,能够显著激活小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮。能够应用于制备免疫增强剂的药物及保健品。(The invention relates to the field of biomedicine, and in particular relates to application of sulfated glucuronic acid-xylo-rhamnosan in enhancing an immune function. The polysaccharide is obtained by acidolysis of Enteromorpha prolifera, and the main components of the polysaccharide comprise glucuronic acid (Glca), xylose (Xyl), Rhamnose (RHA) and the like. The preparation method comprises the following steps: room temperature acidolysis, filtration, neutralization and concentration, ethanol precipitation, anion column chromatography, hydrolysis, ethanol precipitation, Bio-Gel P-10Gel column chromatography and freeze drying. The glycan prepared by the method has the characteristics of stable performance, low cost, high safety, high medicinal value and the like, and can obviously activate mouse abdominal cavity macrophages to release nitric oxide. Can be used for preparing immunopotentiator medicine and health product.)

硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋浒苔来源的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用。

背景技术：

免疫是一种极其复杂的生理反应，它是机体免疫系统识别、排除异构分子,借以维持机体生理平衡和稳定的功能。机体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分,来对抗病原体、有毒化合物或辐照等病理性媒介引起的组织损伤和感染。这一过程涉及炎症介质、炎症相关的信号通路和炎症细胞因子的参与。

海洋中蕴藏着丰富的生物资源,海洋水体的高盐、高压、缺氧、低(恒)温、低(无)光照及寡营养环境造就了海洋生物特殊的生长繁殖方式、适应机制，其中存在着大量复杂多样、结构新颖、活性独特的天然活性物质。海洋藻类作为独特生物活性物质的重要来源，可用于药物的新来源在医学领域有重大意义。浒苔(Enteromorpha prolifera)，是绿藻石莼科中的水生藻类植物，作为海域的天然海藻，产量极大。浒苔多糖是浒苔的关键活性成分，已被证实具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、抗高血脂、和调节葡萄糖代谢等。Kim等发现通过热水抽提获得的多糖具有免疫调节作用，但是其作用机制还不明确。因此本发明探求设计提供一种硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用，通过对酸解获得的浒苔多糖，进一步降解并分离获得了分子量为17.3kD的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖，该聚糖的结构组成与以往报道的浒苔多糖的结构均不一致，且该聚糖在免疫调节功能活性方面的研究还未见报道。

发明内容

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本发明的目的在于克服现有技术所述的上述缺陷，寻求提供一种硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用。

为了实现上述目的，本发明涉及的一种硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用，通过如下技术方案实现：

S1、浒苔粗多糖提取：称取浒苔干品1000g，加入30L 0.1M HCl在室温下提取4h制得提取液，然后将提取液经硅藻土过滤，中和后离心取上清，上清浓缩后用乙醇沉淀，测定粗多糖(EP)得率为20.1％；

S2、DEAE-Bio Gel Agarose FF离子柱层析粗多糖：取8g粗多糖(EP)经DEAE-BioGel Agarose FF柱层析分级，不同浓度NaCl作为洗脱液，收集组分，得水洗组分(EP1)、0.3MNaCl组分(EP2)、1M NaCl组分(EP3)和2M NaCl组分(EP4)，收集各个组分，透析脱盐后，经浓缩和乙醇沉淀，得到各个分级组分；

S3、硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的制备：取1M NaCl组分(EP3)水解后，经Bio-Gel P-10Gel层析分离(2.6×100cm)，0.5M NH₄HCO₃作为洗脱液，得到2个组分，即：高分子量组分(DEP1)和低分子量组分(DEP2)，透析脱盐后，减压浓缩，低温冻干，即得硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖(DEP2)。

进一步的，本发明中透析脱盐所用透析袋的截留分子量为1kD；

进一步的，本发明中硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖得分子量为17.3kD。

进一步的，本发明中硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖能有效地激活小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮，激活炎症小体NLRP3通路，增强巨噬细胞的免疫调节能力。

进一步的，本发明制备的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖能够作为活性成份应用于制备免疫增强剂的药物及保健品。

本发明与现有技术相比，取得的有益效果如下：以浒苔作为制备原料，原材料环保易得，同时制备工艺步骤简单，制备效率高。同时制备得到的目标产物能够有效激活炎症小体NLRP3通路。

附图说明：

图1为本发明涉及的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖的制备方法原理示意图。

图2为本发明涉及的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖促进RAW264.7细胞NO的释放示意图。

图3为本发明涉及的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖对RAW264.7细胞NO的释放量呈浓度依赖性示意图。

图4为本发明涉及的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖对RAW264.7细胞NLRP3小体的激活作用示意图。

具体实施方式

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下面结合附图并通过实施例进行具体说明。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：

本实施例涉及的一种硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的增强免疫功能的应用通过如下技术方案实现：

S1、浒苔粗多糖提取：称取浒苔干品1000g，加入30L 0.1M HCl在室温下提取4h制得提取液，然后将提取液经硅藻土过滤，中和后离心取上清，上清浓缩后用乙醇沉淀。测定粗多糖(EP)得率为20.1％；

S2、DEAE-Bio Gel Agarose FF离子柱层析粗多糖：取8g粗多糖(EP)经DEAE-BioGel Agarose FF柱层析分级，不同浓度NaCl作为洗脱液，收集组分，得水洗组分(EP1)、0.3MNaCl组分(EP2)、1M NaCl组分(EP3)和2M NaCl组分(EP4)，收集各个组分，透析除盐后，经浓缩和乙醇沉淀，得到分级多糖组分；

S3、硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的制备：取1M NaCl组分(EP3)水解后，经Bio-Gel P-10Gel层析分离(2.6×100cm)，0.5M NH₄HCO₃作为洗脱液，得到2个组分，即：高分子量组分(DEP1)和低分子量组分(DEP2)，透析脱盐后，减压浓缩，低温冻干，即得硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖(DEP2)。

进一步的，本实施例中透析脱盐所用透析袋的截留分子量为1kD；

进一步的，本实施例中硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的分子量为17.3kD。

经检验，按照实施例1所述方法制备和分级提取的浒苔聚糖的各组分的得率、总糖含量、硫酸根含量、分子量如下表1所示；单糖组成如表2所示，本实施例得到的浒苔多糖主要单糖组成为葡萄糖醛酸(Glca)、木糖(Xyl)和鼠李糖(RHA)；按照主要单糖组成，该水溶性多糖属于2型多糖—葡糖醛酸，其组成结构主要包括有4-连接的鼠李糖(硫酸基位点位于C3或C2上)、4-连接的葡萄糖醛酸和4-连接的木吡喃糖残基；浒苔通过酸解获得的粗多糖(EP)经DEAE-Bio Gel Agarose FF阴离子柱层析分级分离，得到4个组分：水洗组分(EP1)、0.3MNaCl组分(EP2)、1M NaCl组分(EP3)和2M NaCl组分(EP4)；EP1主要的单糖组成为：鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖，EP2主要的单糖组成为：鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖，EP3和EP4主要的单糖组成为：鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖，EP3进一步水解后经乙醇沉淀，沉淀后复溶，经Bio-Gel P-10Gel柱(2.6×100cm)进行分级分离，0.5M NH₄HCO₃作为洗脱液，得到高分子量组分DEP1和低分子量组分DEP2；本实施例涉及到的聚糖是低分子量组分DEP2，经浓缩，冷冻干燥后备用。

表1硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的化学组成

表2硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖的单糖组成

实施例2：

本实施例测试硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖激活巨噬细胞RAW264.7细胞的效果

本实施例采用实施例1所得的硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖，聚糖以水剂形式处理，药液配置的具体操作如下：准确称取50mg聚糖，溶于1mL 0.01M磷酸盐缓冲液中(PH7.2-7.4)，经孔径0.22μm的针式滤器过滤处理，得到为无菌的聚糖贮存液，于-80℃保存，用于以下实施例中。

主要操作如下：

材料：巨噬细胞RAW264.7细胞，采用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM高糖培养液，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养。

(1)Griess试剂法检测RAW264.7细胞NO的释放情况

取对数生长期的RAW264.7细胞，经细胞刮刀刮取后，细胞用DMEM培养基重悬，接种于96孔板中(按1×10⁵细胞/mL)于CO₂培养箱中孵育24h贴壁后，加入不同分级组分的浒苔聚糖培养24h，每个样品设置3个复孔。阳性对照组加入脂多糖(LPS)，终浓度为1μg/mL。培养结束后，每孔取50μL的培养上清，加入等体积的Griess混合试剂，室温避光孵育10min后，测定吸光度(于550nm处)，以NaNO₂作为标准曲线，计算NO的释放量，结果如图2和图3所示。

图2结果表明，与空白对照组相比，EP1-EP4均能显著地激活巨噬细胞释放NO，尤其是EP3作用效果最显著，说明EP3具有较好的免疫增强活性。DEP1和DEP2为EP3的降解分级产物。其中，DEP2的作用效果最好。浒苔多糖的免疫调节效果与浒苔多糖的分子量呈负相关。图3结果表明，硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖对巨噬细胞RAW264.7细胞NO的释放量呈浓度依赖性。

(2)Western blot法检测RAW264.7细胞NLRP3激活情况取对数生长期的RAW264.7细胞，经细胞刮刀刮取后，细胞用DMEM培养基重悬，接种于6孔板中(按1×10⁶细胞/mL)于CO₂培养箱中孵育24h贴壁后，加入硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖培养0h、0.5h、1h、3h、6h，每个样品设置3个复孔。培养结束后，收集细胞，加入裂解液(含蛋白酶抑制剂)后对细胞进行裂解，得细胞裂解液。该裂解液经电泳分离后，电转至PVDF膜上，利用抗原—抗体原理，检测NLRP3炎症小体的激活情况，结果如图4所示。

图4为硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖对RAW264.7细胞NLRP3小体的激活作用。上述测定结果提示，硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李寡聚糖显著地激活了RAW264.7细胞NLRP3炎症小体中NLRP3和caspase-1，提示硫酸化葡萄糖醛酸-木-鼠李聚糖可以激活巨噬细胞的炎症小体，从而增强免疫调节能力。