阅读说明：本技术 藻酸双酯钠在制备用于预防或***转移的药物中的应用 (Application of polysaccharide sulfate in preparation of medicine for preventing or treating tumor metastasis ) 是由 邱培菊 管华诗 杨金波 马赫 李春霞 王鑫 赵晨阳 于 2018-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了藻酸双酯钠在制备用于预防或治疗肿瘤转移的药物中的应用。藻酸双酯钠具有安全性较高,出血副作用较小的优点,藻酸双酯钠来源于海洋,原料易得,价格便宜。本发明通过实验进一步证明藻酸双酯钠具有抑制肿瘤肺转移和肝转移的作用,效果显著,本发明增加了藻酸双酯钠的临床适应症,弥补了抗肿瘤转移药物市场的不足,具有重要的经济和社会价值。(The invention provides application of polysaccharide sulfate in preparing a medicament for preventing or treating tumor metastasis. The polysaccharide sulphate has the advantages of high safety and small bleeding side effect, is sourced from oceans, is easy to obtain raw materials and is low in price. Experiments further prove that the polysaccharide sulphate has the effect of inhibiting tumor lung metastasis and liver metastasis, has obvious effect, increases the clinical indication of the polysaccharide sulphate, makes up the deficiency of the anti-tumor metastasis medicament market, and has important economic and social values.)

藻酸双酯钠在制备用于预防或***转移的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及藻酸双酯钠在制备用于预防或***转移的药物中的应用。

背景技术

肿瘤转移一直是导致肿瘤患者死亡的主要原因之一，临床肿瘤病人的死亡 90％是由于肿瘤转移引起的。肿瘤转移涉及多方面因素，不但包括肿瘤细胞本身的特征变化，还包括宿主环境的变化。肿瘤微环境是一个动态网络，它包括肿瘤细胞、细胞外基质和间质组织等，是影响肿瘤转移的关键因素。肿瘤微环境是指肿瘤在生长过程中，由肿瘤细胞和非肿瘤细胞共同构成的、与肿瘤发生和转移相关的局部稳态环境。它主要包括肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质的结构组分(如胶原蛋白、弹性蛋白等)，以及其分泌的细胞因子、肽类生长因子等可溶性物质，是一个复杂的体系。

目前临床上还没有专门针对肿瘤转移的药物，某些化疗药物由于其自身的细胞毒作用，在抑制肿瘤细胞生长的同时也抑制了远端肿瘤细胞的生长，间接发挥了抗肿瘤转移的疗效，但是毒副作用较大，不适合长期使用。靶向VEGFR、FGFR、 EGFR等具有促进肿瘤新生血管生成作用的受体的酪氨酸激酶抑制剂可抑制肿瘤生长，也可在一定程度上抑制肿瘤转移的发生，但目前多数靶向血管生成的候选药物还处于临床II/III期实验中，少数已经在国内外上市的抗肿瘤血管生成药物价格昂贵。因此，亟需疗效显著且价格便宜的抗肿瘤转移药物用于预防肿瘤转移的发生。

肿瘤转移的发生是一个极其复杂的过程，涉及多靶点参与，单一靶点的药物较难达到理想的疗效，因此选用多靶点的药物预防肿瘤转移的发生将是一种理想抗癌策略。多糖类化合物，其复杂的结构特征赋予了其丰富的作用靶点，在通过调控肿瘤微环境而抑制肿瘤转移发生方面具有显著的优势。但是目前临床上还没有预防或者***转移的多糖类药物。

藻酸双酯钠(PSS)是我国自主研发的第一个海洋糖类药物，在临床应用已有30年的历史，用于治疗缺血性心、脑血管病(脑血栓、脑栓塞、冠心病等) 高脂血症，安全性较高，副作用较小。目前还未有研究报道PSS在肿瘤转移治疗上的应用。

发明内容

为了弥补抗肿瘤转移药物市场的不足，本发明的目的是提供了藻酸双酯钠在制备用于预防或***转移的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明的第一方面公开了藻酸双酯钠在制备用于预防或***转移的药物中的应用，具体地，其可用于制备预防或***转移的药物。特别地，藻酸双酯钠的抗肿瘤转移作用不是通过抑制肿瘤血管生成实现的。

优选地，上述肿瘤转移为肿瘤肺转移或肿瘤肝转移。更进一步的，肿瘤转移为黑色素瘤细胞的肺转移或肥大细胞癌细胞的肝转移。

进一步的，藻酸双酯钠以剂量依赖方式抑制肿瘤转移。

本发明的第二方面公开了藻酸双酯钠在提高受试者体内CD8⁺和CD4⁺T百分比方面的应用，例如，其可用于制备具有上述所用的药物。

本发明的第三方面公开了藻酸双酯钠在提高受试者体内CD4⁺/CD8⁺T细胞比例方面的应用，例如，其可用于制备具有上述所用的药物。

优选地，上述CD4⁺和CD8⁺T细胞为外周血和/或肺纵膈***中的CD4⁺和CD8⁺细胞。

本发明的第四方面公开了藻酸双酯钠在抑制肿瘤细胞与L-selectin之间的粘附方面的应用，例如，其可用于制备具有上述所用的药物。进一步地，藻酸双酯钠以剂量依赖方式发挥所述抑制作用。

本发明的藻酸双酯钠的优选分子量范围为1,000-25,000Da，包含藻酸双酯钠的药物的给药方式优选为腹腔注射、静脉注射或口服。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：藻酸双酯钠在临床有30多年的应用历史，疗效显著，安全性较高，出血副作用较小。藻酸双酯钠来源于海洋，原料易得，价格便宜，且有口服制剂，可长期服用。本发明通过实验进一步阐明藻酸双酯钠抑制肿瘤转移的作用，效果显著，增加了藻酸双酯钠的临床适应症，弥补了抗肿瘤转移药物市场的不足，具有重要的经济和社会价值。

附图说明

图1是PSS抑制B16F10细胞诱导的肿瘤肺转移实验结果。

图2是PSS显著提高肺纵膈***和血液中CD8⁺和CD4⁺T细胞百分比的实验结果。

图3是PSS抑制B16BL6细胞诱导的肿瘤肺转移实验结果。

图4是PSS抑制A549细胞诱导的肿瘤肺转移实验结果。

图5是PSS抑制P815细胞诱导的肿瘤肝转移实验结果。

图6是PSS抑制L-selectin与肿瘤细胞粘附实验结果。

图7是PSS降低肺组织中肿瘤细胞数的实验结果。

图8是PSS对血浆中血管生成相关因子含量的影响。

图9是PSS对肺肿瘤组织中血管生成因子CD31表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

藻酸双酯钠(简称为PSS)结构式如式I所示，它是以β-D-(1，4)-甘露糖醛酸和α-L-(1，4)-古罗糖醛酸为基本骨架的硫酸多糖类化合物。PSS是以褐藻胶为原料，经降解、丙二醇酯化、硫酸化修饰得到的一种海洋药物，其制备工艺决定了PSS是由不同分子量、硫含量、丙二醇酯基取代度构成的聚甘露糖醛酸(M) 和聚古罗糖醛酸(G)交替形成的多糖硫酸酯混合物，它的重均分子量为15-20 kDa，分散度为1.2-1.8，硫含量为9-13％，M/G比值为1.5-2.5，结构较复杂，因此具备广泛的作用靶点。PSS具有口服和注射两种剂型，口服制剂活性保持且副作用更低，适合长期服用。

实施例1、PSS抑制B16F10细胞诱导的肿瘤肺转移

1)将60只雄性C57BL/6J小鼠称重，平均分为健康组、模型组(注射肿瘤细胞)、PSS30mg/kg组(注射肿瘤细胞和PSS溶液)、PSS 20mg/kg组(注射肿瘤细胞和PSS溶液)、PSS10mg/kg组(注射肿瘤细胞和PSS溶液)。PSS 各组按照剂量给药半小时后(模型组注射生理盐水)，模型组和PSS给药组于C57BL/6J小鼠尾静脉注射黑色素瘤B16F10-luc细胞0.1mL/3×10⁵个/只。于小鼠种瘤当天开始记录，继续每日给药一次至小鼠种瘤后的第21天，首先注射荧光素，15min后利用小动物成像系统进行拍照，取出肺组织、拍照、称量肺重量，用多聚甲醛溶液固定肺组织，进行H&E染色。当尾静脉注射时，PSS 22.5mg/kg 相当于人的临床剂量，腹腔注射的吸收率约为静脉注射的80％，本次实验的低剂量为30mg/kg，接近人的临床剂量，同时，为阐明PSS抗肿瘤肺转移效应是否具有剂量依赖性，本实验分别设置了30、20、10mg/kg三个剂量组。后续实施例中各组处理方式相同。

由图1A可知，模型组肺部的荧光强度普遍较强，PSS作用后荧光强度普遍减弱，且PSS高剂量组的荧光强度弱于低剂量组，也即PSS可以剂量依赖方式减少转移至肺部的肿瘤细胞数。与此同时，图1B中的肺部实体图照片和H&E 染色结果也呈现了相同的趋势。由图1C小鼠体重变化趋势可知，给药期间小鼠的体重均呈现上升趋势，且给药组与空白组体重无显著性差异。由图1D可知，相对于健康小鼠，模型组小鼠的肺重量显著增加，其平均肺重为健康组的4倍，而PSS可显著降低由黑色素瘤肺转移造成的肺重量增加，且肺重量接近于健康小鼠的肺重。由以上结果可知，PSS在测试浓度下可以剂量依赖方式降低B16F10 黑色素瘤细胞诱导的肺转移。

2)PSS显著提高肺纵膈***和血浆中CD8⁺和CD4⁺T细胞的百分比

将60只雄性C57BL/6J小鼠称重，平均分为空白组、模型组、PSS 30mg/kg 腹腔注射组、PSS 90mg/kg口服灌胃组。给药半小时后，于C57BL/6J小鼠尾静脉注射黑色素瘤B16F10-luc细胞0.1mL/3×10⁵个/只。于小鼠种瘤当天开始记录，继续每日一次给药至小鼠种瘤后的第21天，取出肺纵膈***和血液，先用 CD16/32封闭抗体于4℃封闭15min，再于室温下标记PerCP-Cy5.5-CD3和PE -CD8或PE-CD4荧光抗体30min，进行流式细胞仪分析。

如图2A和2B所示肿瘤肺转移模型组肺纵膈***中CD8⁺和CD4⁺T细胞百分比低于健康组，而PSS 90mg/kg口服可显著地提高相应的CD8⁺和CD4⁺T 细胞百分比，并接近于相应的健康组百分比。而健康组、模型组和PSS口服给药组中肺纵膈***中CD4⁺/CD8⁺T细胞比值无明显变化(图2C)。如图2D 和2E所示，发生肿瘤肺转移时，血液中CD8⁺和CD4⁺T细胞百分比显著低于健康组，而PSS 30mg/kg腹腔注射组可显著地增加血液中CD8⁺和CD4⁺T细胞百分比，同时，PSS显著地增加血液中CD4⁺/CD8⁺T细胞的比值(图2F)。由此可知，PSS作用后可调控肺转移小鼠的血液和病变部位***中CD4⁺和CD8⁺T 细胞数量趋向于健康小鼠的数量。

实施例2、PSS抑制B16BL6细胞诱导的肿瘤肺转移

将40只雄性C57BL/6J小鼠称重，平均分为空白组、模型组、PSS 45mg/kg 组、PSS30mg/kg组。给药半小时后，于C57BL/6J小鼠尾静脉注射黑色素瘤 B16BL6细胞0.1mL/3×10⁵个/只。于小鼠种瘤当天开始记录，继续每日一次给药至小鼠种瘤后的第21天。取血后处死该鼠，取出肺组织，拍照并计数转移至肺部的黑色素瘤结节数，并用多聚甲醛溶液固定肺组织，进行H&E染色。

由图3A可知，模型组肺部的黑色素瘤结节普遍较多，PSS作用后黑色素瘤结节数显著降低，且PSS高剂量组的结节数少于低剂量组，也即PSS可以剂量依赖方式减少转移至肺部的黑色素瘤结节数。由图3B统计结果可知，模型组的黑色素瘤结节数平均为12.63个，分别为PSS 30mg/kg、PSS 45mg/kg的2.8、 5.2倍。

实施例3、PSS抑制A549细胞诱导的肿瘤肺转移

将36只雄性nu/nu小鼠称重，平均分为空白组、模型组、PSS 45mg/kg组、 PSS30mg/kg组。给药半小时后，于nu/nu小鼠尾静脉注射A549-luc细胞 0.1mL/8×10⁵个/只。于小鼠种瘤当天开始记录，继续每日一次给药至小鼠种瘤后的第21天，首先注射荧光素，15min后利用小动物成像系统进行拍照。取血后处死该鼠，取出肺组织，并用多聚甲醛溶液固定肺组织，计数转移至肺部的肿瘤结节数，并进行H&E染色。

采用nu/nu小鼠尾静脉注射A549-luc细胞建立人工肺转移模型，检测PSS 对肺转移的抑制作用。为阐明PSS抗肿瘤肺转移效应是否具有剂量依赖性，分别设置了45和30mg/kg两个剂量组。由图4A可知，模型组肺部的荧光强度普遍较强，PSS作用后荧光强度普遍减弱，且PSS在浓度为30和45mg/kg时均可显著地降低肺部的荧光强度。由肺部组织H&E染色结果可知(图4B)，模型组肺组织呈现明显的癌性占位，而PSS给药组肺部组织正常，未见占位形态。由图4C可知，PSS作用后未对小鼠的体重造成明显的影响。由图4D可知，PSS 显著抑制小鼠肺部荧光强度，浓度为30mg/kg时的荧光强度为模型组的1/6。

实施例4、PSS抑制P815细胞诱导的肿瘤肝转移

将30只雄性DBA/2小鼠小鼠称重，平均分为健康组、模型组、PSS腹腔注射组(30mg/kg)PSS口服组(90mg/kg)。给药半小时后，于DBA/2小鼠尾静脉注射P815细胞0.1mL/5×10⁴个/只。于小鼠种瘤当天开始记录，继续每日一次给药至小鼠种瘤后的第12天。取血后处死该鼠，取出肝组织，拍照并计数转移至肝部的肿瘤结节数，并用多聚甲醛溶液固定肝组织，进行H&E染色。

采用DBA/2雄性小鼠尾静脉注射P815细胞建立人工肝转移模型，检测PSS 对肝转移的抑制作用。由图5A可知，健康对照组肝表面光滑而模型组小鼠肝表面呈现多个肿瘤结节，PSS腹腔注射组(30mg/kg)和PSS口服给药组(90mg/kg) 小鼠肝表面的结节数显著降低，H&E染色结果也呈现了相同的趋势。由图5B小鼠体重变化趋势可知，给药期间小鼠的体重均呈现上升趋势，且给药组与空白组体重无显著性差异。由图5C中统计结果可知，PSS两种给药方式对转移至肝部结节数的抑制率可达80％。

实施例5、PSS抑制L-selectin和肿瘤细胞粘附

将PSS溶于H₂O∶DMSO＝1∶1体系配成浓度范围为1-5mM的溶液，借助 Arrayit，SpotBot 3点平台中的SpotBot 3Microarrayer控制软件将PSS置于生物芯片Graft-to-PCL表面，紫外光交联15min将化合物交联于芯片表面，分别以不同浓度的L-selectin(125nM，250nM，500nM)溶液作为流动相，进行PSS 和L-selectin的动态结合检测，通过PLEXERA SPRDate Analysis Module(DAM) 分析软件进行数据分析与拟合，得到结合曲线，平衡解离常数等动力学数据。由图6A可知，PSS和L-selectin的平衡解离常数为1.4×10^-7M，由此可推测PSS和 L-selectin具有较强的亲和力。

L-selectin蛋白与肿瘤细胞粘附实验是将Calcein-AM荧光标记的肿瘤细胞加入到包被了L-selectin的96孔板中，使肿瘤细胞与L-selectin在冰上震荡共孵育 1h，洗掉未粘附的肿瘤细胞，粘附在96孔板上的细胞即为L-selectin介导的粘附细胞。如图6B和6C所示，PSS可以剂量方式抑制HL60和LS180细胞与L-selectin粘附。

实施例6、PSS降低肺组织中肿瘤细胞数

将GFP标记的B16F10细胞混悬于PBS中，细胞密度40×10⁵个/mL，尾静脉注射至C57BL6/J小鼠体内(100μL/只)，于注射肿瘤细胞前15min腹腔注射 PSS 30mg/kg，肿瘤细胞注射2h后，取小鼠肺组织，经Liberase降解成单细胞悬液，氯化铵裂红，离心，重悬于PBS，过100μm滤膜，进行流式细胞仪分析。

以未注射肿瘤细胞的健康小鼠肺部细胞悬液作为阴性对照，圈定FITC阳性表达区域为P4门，由图7A可知，注射肿瘤细胞后，P4门内细胞数显著增加，由图7B可知，模型组细胞数占总数的2.65％，而PSS组(30mg/kg)FITC阳性表达细胞占总数的1.2％。由此可知，PSS可显著地降低粘附于肺部的肿瘤细胞数，进而抑制早期转移结节的形成。

实施例7、PSS对B16F10细胞诱导的肺转移模型小鼠血浆中血管生成因子浓度的影响

采用ELISA技术检测了PSS对B16F10细胞诱导的肺转移模型小鼠血浆中血管生成因子含量的影响。分别设置标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7 孔，依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔加100μL标准品稀释液，待测样品孔加入100μL待测样品，酶标板加上覆膜，37℃温育1h。弃去液体，甩干。每孔加检测溶液A工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育1h。弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2min，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。每孔加检测溶液B工作液100μL，酶标板覆膜， 37℃温育30min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在10-20min，即可终止)。每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(O.D.值)。

由图8A可知，模型组血浆中VEGF的含量约为47.3pg/mL，而PSS 10、20、 30mg/kg组含量约为45.0、51.9、50.1pg/mL，也即PSS作用后未对血浆中的 VEGF含量产生明显的影响。由图8B-D可知，PSS也未对血浆中FGF1、FGF2 和Anpgt-1的含量造成明显的影响。由以上结果可知，PSS可显著地抑制转移至肺部的肿瘤细胞，而对肿瘤血管生成相关的VEGF、FGF1、FGF2和Anpgt-1蛋白的含量未产生明显的影响，也即PSS抗肿瘤肺转移活性不是由抗血管生成作用引起。

实施例8、PSS对B16F10细胞诱导的肺转移模型小鼠肺部肿瘤组织中血管生成因子CD31表达的影响

将小鼠肺肿瘤组织经4％***固定后，石蜡包埋。将石蜡切片经75℃烤片2h，二甲苯中脱蜡5min×3次，100％乙醇2min×2次，自来水冲洗2min。柠檬酸盐溶液∶蒸馏水＝1∶100放入高压锅内，锅放于电磁炉上，大功率加热至沸腾，切片放入，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热，当压力阀开始喷气时，调至100℃，计时90s，关闭高压锅，冷却电磁炉至室温，流水冲洗干净。免疫组化油笔圈出组织，放置孵育盒内，滴加封闭液，37℃孵育10min。PBS冲洗2× 3min。吸去玻片上的液体，滴加CD31一抗，37℃恒温箱孵育1h，PBS冲洗2 ×3min。吸去玻片上的液体，滴加兔二抗，37℃恒温箱孵育15min，PBS冲洗2 ×3min。配DAB染色液，滴加DAB染色液，显微镜下观察染色程度，一般2-5 min后，清水终止染色。苏木素复染细胞核1min，流水冲洗5min。50％乙醇脱水10s，70％乙醇脱水10s，无水乙醇1min×2次，二甲苯中透明3min×2次，中性树胶封片。

CD31染色阳性颗粒定位于肿瘤组织中血管内皮细胞胞膜和胞浆中，它是血管内皮细胞重要的标记物。通过标记血管内皮可反映肿瘤血管密度。如图9中 CD31免疫组化结果所示，模型组和PSS高、中、低剂量组中均有不同程度的 CD31阳性表达，且模型组和给药组的阳性表达率无显著性差异，表明在PSS抗肿瘤肺转移作用与血管生成无关。

现有技术中有文献报道PSS可体外抑制HUVECs细胞介导的新血管生成，同时破坏成熟的血管(CN 102784164 A)。理论推导PSS体外可抑制HUVEC 细胞介导的新血管生成，推测PSS体内也具有抗肿瘤血管生成作用，但是本发明通过实验表明PSS在体内并未对血浆中促肿瘤血管生成的关键因子VEGF、 FGF1、FGF2、Anpgt-1的含量产生明显的影响，也未对转移部位肿瘤组织中血管因子CD31表达产生影响，所以PSS体外抑制新血管生成和破坏成熟血管作用并不能推出PSS体内也具有抗肿瘤血管生成的作用，但是PSS在体内产生了预料不到的预防和***转移的疗效。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。