具体实施方式

葡聚糖是一种多糖，更具体地说是一种不含带电基团的中性多糖。其是一种支链葡萄糖聚合物(右旋糖)。有利地，该聚合物将包含主链，该主链具有在葡萄糖单体和由α-1,2、α-1,3和/或α-1,4糖苷键形成的支链之间的α-1,6糖苷键。

可通过甜菜发酵制得葡聚糖。通过水解和纯化不同分子量的葡聚糖级分，可以从天然葡聚糖中获得它。其也可以合成制备。

葡聚糖可以被硫酸化，尤其是在硫酸镁的存在下，得到硫酸葡聚糖。

因此，硫酸葡聚糖是一种葡聚糖，其至少部分羟基已被硫酸酯基团替代。

硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐有利地通过以下方式制备：

-发酵甜菜，尤其是甜菜糖，以获得葡聚糖，然后

-尤其是在硫酸镁存在下，将葡聚糖硫酸化以获得硫酸葡聚糖，以及

-任选地，成盐以获得皮肤病学或皮肤美容学上可接受的硫酸葡聚糖盐，更特别是硫酸葡聚糖钠盐。

更特别地，硫酸葡聚糖呈钠盐形式并且有利地可通过以下方式获得或得到：

-发酵甜菜，尤其是甜菜糖，以获得葡聚糖，然后

-尤其是在硫酸镁存在下，在酸化水中，尤其是通过甲酸溶解，将葡聚糖硫酸化得到硫酸葡聚糖，

-成盐以得到硫酸葡聚糖钠盐，

-纯化，尤其是通过溶解在水中和在乙醇中的一种或多种沉淀，和

-回收硫酸葡聚糖钠盐，尤其是通过离心、干燥(例如，在真空下)和研磨。

现有技术中已知的硫酸葡聚糖的理化性质使其成为用于美容学组合物的良好化合物，其在水和盐溶液中具有良好的溶解性并且在环境温度在pH范围为4至10的溶液中具有高稳定性。硫酸葡聚糖还被描述为具有吸水特性、防止自由基引起的损伤的保护作用(特别是通过局部应用)、蛋白质或不稳定物质的稳定作用以及由于其优异的亲水性而产生的水合作用。还描述了生物学特性，例如抗凝作用、酶如透明质酸酶、葡糖苷酶、弹性蛋白酶或凝血酶的抑制作用，或抗病毒活性。

硫酸葡聚糖可以是合成的或天然的。应当理解，硫酸葡聚糖可以来自任何来源。

优选地，根据本发明，硫酸葡聚糖以钠盐的形式存在。INCI名称为硫酸葡聚糖钠，CAS编号为9011-18-1。

根据本发明，硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐有利地具有在2kDa和5000kDa之间，优选地在4kDa和1000kDa之间，更优选地在5kDa和100kDa之间，甚至更优选地在9kDa和20kDa之间的平均分子量，正如优选地，硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐具有4kDa和8kDa之间的分子量。

优选地，根据本发明的硫酸葡聚糖由SAFIC ALCAN公司以Dextralip 10C的名称提供并且呈钠盐形式。

硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐可用于治疗和/或预防炎症性皮肤病。

优选地，炎症性皮肤病选自特应性皮炎、湿疹、银屑病、红斑痤疮、扁平苔藓、痒疹、脂溢性皮炎和粉刺。优选地，其是特应性皮炎。

本发明的另一个目的涉及皮肤病学或皮肤美容学组合物，其用于治疗和/或预防炎症性皮肤病的用途，所述组合物包含作为活性成分的如上面定义的至少一种硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐，以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。

本发明的另一个目的涉及皮肤病学或皮肤美容学组合物在治疗和/或预防炎症性皮肤病中的用途，所述组合物包含作为活性成分的如上面定义的至少一种硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐，以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。

本发明的另一个目的涉及皮肤病学或皮肤美容学组合物在制备旨在用于治疗和/或预防炎症性皮肤病的药物中的用途，所述组合物包含作为活性成分的如上面定义的至少一种硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐，以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。

本发明的另一个目的涉及一种用于治疗和/或预防炎症性皮肤病的方法，其包括向有需要的人施用有效量的皮肤病学或皮肤美容学组合物，所述组合物包含作为活性成分的如上面定义的至少一种硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐，以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。

在一个特别的实施方案中，根据本发明的组合物用于治疗和/或预防选自特应性皮炎、湿疹、银屑病、红斑痤疮、扁平苔藓、痒疹、脂溢性皮炎和粉刺的炎症性皮肤病。

优选地，根据本发明的组合物用于治疗和/或预防特应性皮炎。

在一个特别的实施方案中，根据本发明的皮肤病学或皮肤美容学组合物包含相对于组合物的总重量按重量计0.01％至1％，优选0.01％至0.5％，甚至更优选0.02％至0.3％的硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐。有利地，根据本发明的皮肤病学或皮肤美容学组合物包含相对于组合物的总重量按干重计0.03％的硫酸葡聚糖或其皮肤病学或皮肤美容学上可接受的盐。

根据本发明的组合物有利地旨在局部应用，尤其是皮肤上的应用。

因此，根据本发明的组合物可以以用于局部施用的公知形式存在，即尤其是洗剂、摩丝、凝胶、分散剂、乳液、喷雾剂、精华、香膏(baumes)、面膜或霜剂。

有利地，其将是霜剂或香膏。

本发明还涉及根据本发明实施方案之一的皮肤病学或皮肤美容学组合物，其特征在于它们以适合于局部应用的适当形式存在。

除了根据本发明的硫酸钠之外，这些化合物通常包含生理学上可接受的介质，通常基于水或溶剂，例如醇、醚或二醇。它们还可以含有表面活性剂、络合剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、保湿剂(humectants)、润肤剂、微量元素、精油、香料、染料、哑光剂、化学或矿物过滤剂、保湿剂(agents hydratants)或温泉水等。

以下实施例阐明本发明，但不限制其范围。

实施例

实施例1、硫酸葡聚糖在炎症中对前列腺素PG6K的影响

角质形成细胞是表皮中最常见的细胞。在对环境中存在的几种细胞外因子的应答中，表皮释放各种生物活化介质，特别是生物活性脂质、前列腺素和白三烯，它们在炎症性皮肤反应的启动和调节中起重要作用，也参与调节免疫应答。

角质形成细胞似乎是皮肤药理学研究的良好模型。这种细胞模型可以在体外确定各种化合物调节由花生四烯酸代谢产生的这些介质产生的能力。

在这项研究中，本发明人特别研究了一种前列腺素，6-酮基-PGF1α(PG6KF1α)，其是前列环素的稳定代谢物。该代谢物是受刺激的角质形成细胞产生的主要代谢物之一，代表花生四烯酸代谢物的产生调节(Dorris和Stokes Peebles，Mediators ofinflammation，第2012卷，文章ID 926968，9页)。

本研究的目的是通过测量硫酸葡聚糖对前列腺素PG6KF1α释放的影响来寻找其潜在的抗炎活性。

本研究中使用的细胞系是HaCat系(人角质形成细胞)。

在24孔板中，在37℃和5％CO2的环境中，将细胞在补充有胎牛血清的DMEM(Dulbecco改良的伊格尔培养基)中培养。然后将它们依然在37℃与溶解在水中的待测产品预培养60分钟。加入花生四烯酸通路的刺激物5小时。这是刺激阶段；刺激物是钙离子载体A23187(0.01％DMSO溶液)，以5μM使用。在这项研究中，测试了两种不同的硫酸葡聚糖，一种是天然硫酸葡聚糖，来自SAFIC ALCAN的分子量为9000-20000Da，以及来自Welding GMBH&Co的合成硫酸葡聚糖，分子量为4000-8000Da。刺激5小时后，仍然在相同的培养基中，吸出每孔的培养上清液，以3000转/分钟离心，然后在-20℃储存。根据供应商的说明，使用Euromedex Elisa试剂盒测量培养上清液中前列腺素PG6KF1α的产生。统计分析是通过ANOVA进行的，然后是Dunnett事后检验。请注意，进行了3次独立实验。每个产品和每个剂量的结果是对3个孔进行的测量的平均值。因此，对照组(没有刺激剂)可以量化基础PG6KF1α的产生。所有其他组都有一个刺激期，或者没有其他产品(可以知道PG6KF1α的最大产生)，或者在用作参考产品的吲哚美辛(非甾体抗炎药)存在下，或者在不同浓度的硫酸葡聚糖存在下。

PG6KF1α活化的结果(以pg/ml计)总结在下表1A和1B中：

表1A：分子量为9000-20000Da的天然硫酸葡聚糖(Dextralip)对PG6KF1α产生的影响

[表1A]

Conc：浓度；Moy：平均值；SEM：平均值的标准误差；Inh：抑制；Indo：吲哚美辛。

表1B：分子量在4000至8000Da之间的合成硫酸葡聚糖对PG6KF1α产生的影响

[表1B]

Conc：浓度；Moy：平均值；SEM：平均值的标准误差；Inh：抑制；

NS：不显著。

钙离子载体A23187的刺激极大地刺激了PG6KF1α的产生。吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，可将这种产生抑制三分之一，这证实了本测试的相关性。从10μg/ml到3mg/ml测试的两种硫酸葡聚糖显示出对PG6KF1α释放的统计学显著抑制作用。这种响应于合成硫酸葡聚糖浓度增加的产生类似于钟形曲线。同样，使用天然硫酸葡聚糖，不能清楚地显示出浓度响应效应。

本发明人证明了硫酸葡聚糖在炎症中的功效。

实施例2、硫酸葡聚糖在炎症中对NFKB活性的影响

本研究的目的是在人角质形成细胞中，在由TNFα刺激的转录因子NFKB的活化水平上，评估硫酸葡聚糖的潜在舒缓特性。本研究中使用的细胞系是用荧光素酶报告基因稳定转染的HaCat系(人角质形成细胞)。

在与实施例1相同的条件下将这些细胞培养在24孔板上。然后将它们与待测产品一起预培养60分钟，所述待测产品以水溶液的形式加入培养基中。向培养物中加入刺激物TNFα(0.3ng/ml，在培养基中稀释)，然后在37℃培养5小时。在本研究中，测试了天然硫酸葡聚糖，来自SAFIC ALCAN的分子量为9000-20000Da。在本测试中使用阳性对照，地塞米松(合成糖皮质激素，具有抗炎和免疫抑制作用，以水溶液的形式加入到培养基中)，在培养基中以2μM进行测试。请注意，进行了3次独立实验。Bright-GloTM试剂(其诱导细胞裂解，从而使荧光素酶释放)及其底物(荧光素)在读取发光之前加入。原始数据用Excel进行分析。组间比较通过单因素ANOVA进行，然后是Dunnett事后检验。

NFKB活化的结果(RLU)总结在下表2中：

[表2]

RLU相对光单位；Cont：对照；Conc：浓度；Moy：平均值；sem：平均值的标准误差；Inh：抑制；Stim：TNFα的刺激；Dexa：地塞米松；S.Dex：硫酸葡聚糖；NS：不显著。

TNFα刺激(0.3ng/ml)确实会诱导NFKB活化。用作免疫抑制剂的地塞米松将这种活化抑制了40％以上(p<0.05vs无TNFα)，这验证了本测试的可靠性。

以0.3和1mg/ml测试的硫酸葡聚糖不会降低NFKB活化。反过来，在3mg/ml的浓度下，硫酸葡聚糖显著(p<0.01)将TNFα诱导的NFKB活化降低了42％。

本发明人因此证明硫酸葡聚糖具有舒缓特性。

实施例3、硫酸葡聚糖对皮肤炎症的作用(特应性皮炎模型)

特应性皮炎或特应性湿疹是一种慢性炎症性疾病，周期性进展，具有缓解阶段。特应性皮炎病变尤其是由于过敏原特异性T细胞的活化。这种免疫应答可能是由于环境过敏原渗透到皮肤中。皮肤屏障的破坏以及由此的过敏原的分散与诱导特异性免疫应答和湿疹病变有关。已经提出了两个互补的假设来解释该疾病的起源。第一个假设是皮肤屏障功能的损害会允许过敏原进入并诱导免疫致敏。第二个假设是特应性是一种免疫系统功能障碍，导致Th1/Th2对Th2有益的失衡和过敏原特异性IgE的产生。由于所有这些原因，特应性皮炎被认为是一种涉及多种机制的复杂疾病。

在本研究中，在模拟特应性皮炎环境的模型中评估了根据本发明的硫酸葡聚糖对受刺激的人角质形成细胞的影响。

方法

本研究是在标准条件(37℃，5％CO2)下培养的正常人表皮角质形成细胞上进行的。培养基是标准培养基(角质形成细胞-SFM补充有0.25ng/ml表皮生长因子(EGF)、25μg/ml垂体提取物和25μg/ml庆大霉素)。没有生长因子的测试培养基是相同的。

为了模拟特应性皮炎环境，将角质形成细胞在含有或不含(对照)待测化合物、载体(水)或阳性对照巴弗洛霉素(大环内酯家族，浓度为30nM)的培养基中预培养1小时。本研究中测试的硫酸葡聚糖是来自SAFIC ALCAN的分子量为9000-20000Da。预培养后，通过加入到细胞中的TLR配体(Poly I:C和PamC3)和炎性细胞因子(IL-4和IL-13)的混合物刺激角质形成细胞24小时。未受刺激的对照条件也同时进行。将细胞培养24小时。

收集培养上清液，离心并在-80℃冷冻。TSLP和IL-8通过ELISA进行定量。

进行了三个独立的实验。通过单因素ANOVA然后是Dunnett事后检验确定统计分析。

结果

在24小时测量的正常人表皮角质形成细胞产生的TSLP显示在下表3中。

[表3]

Moy：平均值；sem：平均值的标准误差；Inh：抑制；*p<0.05；**p<0.01vs刺激。

通过混合试剂(Poly I:C、PamC3、IL-4和IL-13)刺激角质形成细胞以模拟特应性皮炎环境确实会在24小时诱导TSLP产生增加。用作阳性对照的巴弗洛霉素显著抑制TSLP的产生。这些结果充分验证了本药理试验。

根据本发明的硫酸葡聚糖几乎完全抑制了在24小时测量的TSLP产生。事实上，在3μg/ml硫酸葡聚糖时，TSLP产生降低了90％，在30μg/ml时降低达到96％(针对两种浓度，p<0.01，与表3中的刺激条件相比)。反过来，硫酸葡聚糖浓度低10倍不会诱导TSLP产生减少。硫酸葡聚糖对特应性皮炎环境诱导的TSLP产生的抑制作用似乎明显依赖于浓度。

在24小时测量的正常人表皮角质形成细胞产生的白细胞介素8(IL-8)显示在下表4中。

[表4]

Moy：平均值；sem：平均值的标准误差；Inh：抑制；**p<0.01vs刺激。

通过试剂混合物刺激角质形成细胞以模拟特应性皮炎环境，诱导大量产生IL-8。巴弗洛霉素(30nM)显著抑制IL-8的产生(减少超过50％)。所有这些结果都验证了药理试验。

根据本发明的硫酸葡聚糖以浓度依赖性方式减少由特应性皮炎环境诱导的IL-8产生。测试的最低硫酸葡聚糖浓度不足以抑制IL-8的产生(表2)。反过来，在3μg/ml时，硫酸葡聚糖显著降低了80％以上的IL-8产生(与刺激条件相比，p<0.01)。在30μg/ml时，硫酸葡聚糖完全抑制IL-8产生(100％抑制)，表明根据本发明的硫酸葡聚糖对于减少特应性皮炎的这些选择性细胞因子非常有效。

这些研究的结论

因此，本发明人已经表明，在通过模拟特应性皮炎环境的混合试剂(Poly I:C、PamC3、IL-4和IL-13)刺激24小时后，正常人表皮角质形成细胞会产生大量的TSLP和IL-8。在该模型中，本发明人证明根据本发明的硫酸葡聚糖非常有效并且能够防止炎性细胞因子(尤其是TSLP，特应性皮炎发展中的关键标志物)的这种释放，证明在该疾病中具有保护作用。

实施例4、硫酸葡聚糖在参与角质形成细胞分化和水合作用的基因的调节中的评 估

表皮作为身体的机械和化学屏障，起着重要的保护作用。其确保维持不可渗透的皮肤屏障功能。角化细胞，角质层的角质形成细胞，连同脂质基质，在很大程度上确保了这种功能。然而，更深的层也有助于构建此功能中固有的元素。表皮角质形成细胞的分化能力确保了具有选择性渗透功能的屏障的构建(Elias和Choi,Exp.Dermatol.14(10),p 719-726,2005))。

角质形成细胞的分化在空间和时间上受到调节，从皮肤最深层(分化最少的基底膜)到角质层(角质形成细胞分化为角化细胞的最后一步)(Houben等人,SkinPharmacol.Physiol.20(3),p 122-132,2007)。从细胞和分子的角度来看，主要观察角蛋白丝的形成，角质形成细胞向角化细胞的转化，或“角质化”，以及层状结构的细胞间脂质连接物(ciment)的形成，确保皮肤屏障的不渗透性和功能。

在蛋白质方面，表皮分化主要集中在结构细胞质蛋白如细胞角蛋白发育上，这有助于表皮的结构完整性。它们的表达根据角质形成细胞的成熟程度而变化。碱性角蛋白1和酸性角蛋白10是角质形成细胞终末分化的早期标志物，存在于表皮的基底层。在随后发生的这一生物过程中，其他标志物的表达可以按照与角质胞膜如外皮蛋白相同的方式进行，连同某些主要酶(导致结构蛋白在它们之间形成桥梁)，以及角质形成细胞脂质和转谷氨酰胺酶(TGM)，如TGM1或3(Houben等人，Skin Pharmacol.Physiol.20(3),p 122-132,2007)。

存在于角化细胞中的纤维基质是在颗粒层的角质形成细胞和角化细胞之间的过渡时期中形成的。兜甲蛋白是一种结构蛋白，含有谷氨酰胺和赖氨酸残基，可以粘附在角质包膜中的其他蛋白质上。由其前体丝聚蛋白原产生的碱性丝聚蛋白分子储存在透明角质颗粒中，与细胞角蛋白丝结合，然后能够聚集。被半胱天冬酶14降解的丝聚蛋白也是角质层中天然水合因子的几种主要成分的主要来源。其他标记物对分化的角质形成细胞具有特异性。claudine 4(CLDN4)是一种紧密连接蛋白。其主要在颗粒层表达，在角质形成细胞分化过程中表达增加。角膜锁链蛋白(cornéodesmosine，CDSN)在角化细胞中表达。其是角化粒的必需蛋白质，其蛋白水解是脱屑所必需的。激肽释放酶，如KLK5和KLK7，表现出与胰凝乳蛋白酶相似的活性，并在脱屑前的细胞间内聚结构的蛋白水解中发挥作用，即去除角质层的最外层。

同时，角质形成细胞脂质的合成和转运形成了皮肤屏障所必需的角化细胞间脂质连接物的基础，其形成是终末表皮分化的最后阶段。这种细胞外脂质基质是液体和电解质经皮转运的主要屏障(Feingold,J.Lipid Res.48,p 2531-2549,2007)。因此，一定数量的酶和脂质转运蛋白的角质形成细胞表达与分化一起上调。连接物由三种脂质物质，即胆固醇、游离脂肪酸和神经酰胺之间的平衡产生。这些脂质来源于棘层和颗粒层中产生的葡糖神经酰胺、鞘磷脂、胆固醇和磷脂。它们由层状体运输，层状体是分泌细胞器，与颗粒层和角质层融合。除了这些脂质前体之外，层状体还含有许多酶，包括脂质酶，如酸性鞘磷脂酶、β-葡糖脑苷脂酶或磷脂酶A2，以及酸性和中性脂肪酶。这些酶与脂质前体同时输送到细胞外空间，分别将鞘磷脂转化为神经酰胺，将葡糖脑苷脂转化为神经酰胺，将磷脂质转化为游离脂肪酸和甘油。SULT2B1是一种在分化的角质形成细胞中表达的磺基转移酶胆固醇，并参与硫酸胆固醇的合成。最近的一项研究还表明，硫酸胆固醇通过增加RORα的表达来诱导丝聚蛋白的表达(Hanyu等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.428(1),p 99-104,2012)。

表皮神经酰胺发挥着特殊而重要的作用，是皮肤屏障功能的重要标志物。当屏障功能发生改变连同表皮分化程度发生变化时，在皮肤神经酰胺生产中发挥作用的酶的表达和活性会特别增加(Feingold，2007)。这是酸性鞘磷脂酶(aSmase)和β-葡萄糖神经酰胺酶的特例，它们参与皮肤神经酰胺的细胞外代谢。UGCG(UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶)也参与葡萄糖神经酰胺的合成。UGCG催化鞘糖脂生物合成中的第一个糖基化步骤，并且对于层状体中脂质和蛋白质的规则排列和维持表皮屏障是必需的(Jennemann等人，J.Biol.Chem.282(5),p 3083-3094,2007)。DGS2(鞘脂C4-羟化酶/δ-4去饱和酶)既作为鞘脂C4-羟化酶又作为δ-4去饱和酶；其二氢神经酰胺羟化酶活性与人类皮肤植物神经酰胺的产生相竞争。

与表皮脂肪酸结合的蛋白质FABP-E(FABP5)是一种脂质转运蛋白。FABP-E在角质形成细胞分化中起重要作用。

角质层中水的功能之一是激活皮肤柔软和正常脱屑所必需的酶水解反应(Rawlings和Matts J.Invest.Dermatol.124(6),p 1099-1110,2005)。如果角质层中的水分含量低于临界水平，酶促反应就会被破坏，导致角化细胞粘附和细胞在皮肤表面累积。这会造成明显的干燥和瘙痒，并且皮肤会剥落和去角质。

皮肤的屏障功能还包括抵御微生物。上皮在宿主的先天防御中起着积极的作用。皮肤抗微生物系统尤其依赖于某些表面脂质和某些组成蛋白的存在，这些组成蛋白根据角质形成细胞的分化状态越来越多地表达，如RNAse7或蛋白酶抑制剂3。这些蛋白具有抗微生物活性。先天免疫还有一个适应性成分，其依赖于具有直接抗微生物活性的抗微生物肽的可诱导分泌。它们通过对上皮细胞和炎症细胞产生影响而作为炎症介质发挥重要作用。抗微生物肽通常在棘层和颗粒层的上层合成，但它们在释放它们的角质层中具有活性。研究最多的皮肤抗微生物肽是β-防御素和导管素。人类β-防御素是在人类上皮中发现的主要抗微生物肽类，其中四种已在皮肤中被鉴定，hBD 1-4。虽然它们属于同一个家族，但它们受到不同通路的调控。人类β-防御素2(hBD-2或DEFB4A)，一种4kDa肽结合肝素，是主要的皮肤抗微生物肽之一。

皮肤含水量依赖于两点，皮肤血液的经皮补水和表皮保水，这涉及到屏障功能。然而，防止水分流失的屏障并非万无一失。通过角质层在外部和内部环境之间的正常的水分交换称为经皮水分流失(TEWL)，并且是无感水分流失(IWL)所固有的。

正常人角质形成细胞与溶解在培养基中的硫酸葡聚糖(2mg/ml)培养48小时。本研究中测试的硫酸葡聚糖来自Welding GMBH&Co；其分子量为4000-8000Da。该化合物的作用是通过RT-qPCR技术评估的，分析了12个靶基因，这些基因因其在角质形成细胞分化、抗微生物防御和水合作用中的重要性而选择。氯化钙(以1.5mM测试)用作参考化合物(诱导终末表皮分化的生理剂)。然后收集细胞用于通过实时PCR分析目标表达(mRNA)。根据供应商的说明(Roche Life Science，Meylan，法国)，使用TriPure Isolation提取总RNA。使用Bioanalyser 2100(Agilent Technologies，Les Ulis，法国)对它们进行分析。使用oligo(dT)和Transcriptor逆转录酶将mRNA逆转录为互补DNA。根据供应商的说明(Roche)在系统中进行PCR。使用的PCR混合物是SYBR green I。结果用Microsoft分析。通过用两个参考基因，RPL13A(核糖体蛋白L13A)和TBP(TATA盒结合蛋白)进行标准化，计算每个基因的相对量。

结果

由于某些标志物在对照细胞中的表达非常弱，因此根据实验，相对量可能非常高且可变。

本发明人表明，在培养48小时后，以2mg/ml测试的硫酸葡聚糖显著诱导不同的角质形成细胞脂质分化标志物(诱导SULT2B1、FABP5、DGS2)、多种角质形成细胞蛋白质分化标志物(诱导KLK7、FLG、TGM1、CASP14和CLDN4)，诱导抗微生物肽hBD2(或DEFB4)并最终诱导水合标记物(FLG和CASP14)。所有这些结果示于下表5中。

[表5]

Moy：平均值；QR：相对量；sem：平均值的标准误差；NV：未验证；SULT2B1：胆固醇磺基转移酶；FABP5：表皮脂肪酸结合蛋白；DEGS2：鞘脂C4-羟化酶/δ-4去饱和酶；KLK7：7型激肽释放酶；FLG：丝聚蛋白；CDSN：角膜锁链蛋白；TGM1：转谷氨酰胺酶1；CASP14：半胱天冬酶14；CLDN4：claudine 4；DEFB4A：β-防御素2。

本发明人因此表明，硫酸葡聚糖通过活化角质形成细胞分化和通过诱导抗微生物肽的表达而有效地起作用。这种双重作用使得可以得出结论：硫酸葡聚糖可显著恢复皮肤屏障，增强皮肤的微生物防御能力并防止皮肤脱水。本发明人证明硫酸葡聚糖可用于治疗和/或预防炎症性皮肤病。