一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体rmx-m和应用

文档序号：1165988 发布日期：2020-09-18 浏览：36次 >En<

阅读说明：本技术 一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体rmx-m和应用 (Method for improving mannanase activity of bifunctional cellulase, cellulase mutant RMX-M and application ) 是由罗会颖郑洁姚斌黄火清王亚茹柏映国苏小运王苑涂涛张�杰于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业生物技术领域,具体涉及一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体RMX-M和应用。本发明通过氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的E218位点实施定点突变获得E218H突变体。结果表明,以羧甲基纤维素钠和角豆胶为底物两种底物测定时,酶促反应的最适pH值不变,最适温度降低5℃；以角豆胶为底物时,突变体的甘露聚糖比活力比野生型提高了约80%；在以羧甲基纤维素钠为底物时,与野生型RMX的纤维素比活相比,突变体RMX-M的比活略有降低,实现了在纤维素酶活损失较小的基础上提高了其降解半纤维素底物甘露聚糖的能力。(The invention relates to the technical field of agricultural biology, in particular to a method for improving mannanase activity of bifunctional cellulase, a cellulase mutant RMX-M and application. The invention adopts the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: site-directed mutagenesis is carried out on E218 site of the wild cellulase shown in 1 to obtain an E218H mutant. The result shows that when the test is carried out by taking the sodium carboxymethylcellulose and the carob bean gum as two substrates, the optimum pH value of the enzymatic reaction is not changed, and the optimum temperature is reduced by 5 ℃; when carob bean is used as a substrate, the specific activity of mannan of the mutant is improved by about 80 percent compared with that of the wild type; when sodium carboxymethylcellulose is used as a substrate, compared with the cellulose specific activity of wild type RMX, the specific activity of the mutant RMX-M is slightly reduced, so that the capability of degrading the hemicellulose substrate mannan is improved on the basis of less loss of the cellulose activity.)

一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体RMX-M和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体RMX-M和应用。

背景技术

非淀粉多糖(non-starch polysaccharide, NSP) 是植物中除了淀粉之外的碳水化合物的总称，包括纤维素、半纤维素和果胶类等。非淀粉多糖是饲料纤维的主要成分，由于这些纤维将饲料中的营养物质包围在细胞内部，在一定程度上抑制了动物的对营养物质的降解与吸收。自然界中广泛存在着可以降解非淀粉多糖的酶类，包括纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶等，这些酶可以有效降解饲料中的NSP，提高饲料营养价值并改善动物生长性能。

饲料中非淀粉多糖的降解往往需要多种酶的复合作用，但是，复合酶的添加增加了饲料使用的成本，成为限制其广泛应用的一个重要因素。一种酶同时具有两种或以上功能的多功能酶是简化饲料加工工艺、降低饲料成本的有效途径。获得单催化域酶催化两种甚至多种底物的多功能酶，或者利用分子改良拓宽酶高效作用底物的范围，获得功能多样性的高效NSP酶意义重大。

利用蛋白质工程手段对酶分子进行改良也是目前酶工程领域的研究热点，但是由于对于酶的氨基酸序列与功能之间的研究还很有限，依据酶突变策略设计的突变方案难以获得预期的技术效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法。

本发明的再一目的是提供一种甘露聚糖酶活提高的双功能纤维素酶突变体。

本发明的再一目的是提供上述编码甘露聚糖酶活提高的双功能纤维素酶突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备甘露聚糖酶活提高的双功能纤维素酶的方法。

本发明为了改变纤维素酶的底物特异性，对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶进行突变。

本发明通过对野生型纤维素酶的218位点进行定点突变，将218位点的His定点突变为Elu，获得底物特异性改变的纤维素酶突变体RMX-M，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的制备底甘露聚糖酶活提高的双功能纤维素酶的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3）回收并纯化所表达的底物特异性改变的纤维素酶RMX-M。

本发明通过氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的E218位点实施定点突变获得E218H突变体。结果表明，以羧甲基纤维素钠和角豆胶为底物两种底物测定时，酶促反应的最适pH值不变，最适温度降低5℃；以角豆胶为底物时，突变体的甘露聚糖比活力比野生型提高了约80%；在以羧甲基纤维素钠为底物时，与野生型RMX的纤维素比活相比，突变体RMX-M的比活略有降低，实现了在纤维素酶活损失较小的基础上提高了其降解半纤维素底物甘露聚糖的能力。

附图说明

图1显示本发明的纤维素酶突变体与野生型的最适pH。

图2显示本发明的纤维素酶突变体与野生型的最适温度。

图3为本发明的纤维素酶突变体与野生型的比活比较图。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r。

2、生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司，连接酶购自Promaga公司，点突变试剂盒购自全式金公司，羧甲基纤维素钠购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：0.5% 酵母提取物，1% 蛋白胨，1% NaCl， pH 7.0

YPD培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖

MD固体培养基：2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34% YNB，0.00004% Biotin

BMGY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1% 甘油(V/V)，1.34% YNB，0.00004%Biotin。

BMMY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，0.5%甲醇(V/V)。

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1底物特异性改变的纤维素酶突变体重组载体pPIC9r-RMX-M的制备

将突变前的野生型纤维素酶编码基因（去除信号肽编码序列）克隆到表达载体pPIC-9r上，重组载体命名pPIC9r-RMX；以重组载体pPIC9r-RMX为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为pPIC9r-RMX-M。

表1 底物特异性改变的纤维素酶突变体RMX-M特异性引物

引物	序列 (5'<i>—</i>3') <sup><i>a</i></sup>	长度 (bp)
			RMX-E218H-F	CATCCAACAAGATATTGTACcacATGCACCAATACT	36
RMX-E218H-R	gtgGTACAATATCTTGTTGGATGGATCCTTC	31

实施例2底物特异性改变的纤维素酶突变体的制备。

（1）纤维素酶突变体RMX-M在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

将获得的含有底物特异性改变的突变体基因RMX-M的重组质粒pPIC9r-RMX-M转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/RMX-M。取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300 mLBMGY培养基的1 L三角瓶中，置于30℃，220 rpm摇床培养48 h；培养液4000 g离心5 min，弃上清，沉淀用200 mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220 rpm条件下诱导培养。每隔12 h补加1 mL甲醇，同时取上清用于酶活性检测。

（2）重组纤维素酶的纯化

收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10 kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，最后剩余约20 ml蛋白浓缩液。浓缩到一定倍数的重组纤维素酶RMX-M，利用离子交换层析法进行纯化。具体地，取纤维素酶RMX及突变体RMX-M浓缩液10.0 mL经预先用10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡过的HiTrap Q HP阴离子柱，然后用含有1 mol/L的NaCl的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)进行线性梯度洗脱，利用DNS法对梯度洗脱的蛋白液进行酶活性检测，同时利用SDS-PAGE凝胶电泳对梯度洗脱的蛋白液进行纯度的检测。

实施例3重组甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体和野生型的活性分析

采用二硝基水杨酸（DNS）法测定重组纤维素酶RMX及突变体RMX-M的基本酶学性质。具体方法如下：在pH 5.0，75 ℃条件下，1 mL的反应体系包括100 µL适当的稀释酶液，900 µL底物，反应10 min，加入1.5 mL DNS终止反应；沸水浴煮5 min后冷却至室温，在540 nm波长下测定OD值。甘露聚糖酶测定方法同纤维素酶。内切纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 葡萄糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 甘露糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。酶学性质研究所用酶液均需达到电泳纯。

（1）最适pH分析比较

实施例2经纯化的表达的野生型纤维素酶RMX及突变体RMX-M在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-7.0的柠檬酸—磷酸氢二钠系列缓冲体系。纯化的纤维素酶RMX及突变体RMX-M在不同pH的缓冲体系、75 ℃下以羧甲基纤维素钠及角豆胶为底物，测定的最适pH结果如图1所示，RMX和RMX-M的最适pH均为5.0。

（2）最适温度分析比较

纯化的纤维素酶在各自最适pH条件下，以羧甲基纤维素钠及角豆胶为底物，测定20-80℃不同温度下的酶活性，分析实验结果如图2所示，RMX和RMX-M最适温度分别为75℃和70℃。

（3）比活分析比较

实施例2纯化后的纤维素酶野生型RMX与突变体RMX-M在pH5.0，75℃和pH5.0，70℃件下以羧甲基纤维素钠及角豆胶进行酶促反应以测定其酶活性。

比活测定结果如图3所示，在以羧甲基纤维素钠为底物时，野生型RMX的纤维素比活为1214 U/mg，突变体RMX-M的比活为1007 U/mg，较野生型降低约20%；在以角豆胶为底物时，野生型RMX的甘露聚糖比活为251 U/mg，突变体RMX-M的比活为454 U/mg，较野生型提高了约80%，实现了在纤维素酶活损失较小的基础上提高了其降解半纤维素底物甘露聚糖的能力。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体RMX-M和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Pro Glu Ser Ser Leu Asp Lys Arg Ala Gly Asn Phe Lys Phe Phe

1 5 10 15

Gly Val Asn Glu Ala Gly Pro Glu Phe Gly Asn Gln Asn Leu Pro Gly

20 25 30

Val Tyr Asn Lys Asp Tyr Val Phe Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Asp Thr

35 40 45

Phe Ile Ser Lys Gly Phe Asn Thr Phe Arg Leu Asn Ile Gln Met Glu

50 55 60

Arg Leu Ala Pro Asn Ala Ile Asn Gly Asn Leu Asp Thr Thr Tyr Leu

65 70 75 80

Asn Met Ile Lys Glu Gln Val Asn Tyr Val Thr Gly Lys Gly Ala Tyr

85 90 95

Met Met Ile Asn Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Gln Ile Tyr

100 105 110

Arg Asp Thr Gln Ser Phe Gly Gln Phe Trp Ala His Leu Ala Gln Glu

115 120 125

Phe Lys Ser Asn Ser Arg Val Ile Phe Asp Thr Asp Asn Glu Phe His

130 135 140

Asp Glu Pro Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn

145 150 155 160

Ala Ile Arg Ala Thr Gly Ala Thr Asn Gln Tyr Ile Ala Val Glu Gly

165 170 175

Asn Ala Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Lys Gly Thr Asp

180 185 190

Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Lys Asp Pro Ser Asn

195 200 205

Lys Ile Leu Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Ser Thr Thr Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Ser Glu Arg Leu Lys

225 230 235 240

Ala Ala Thr Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Leu Leu Gly

245 250 255

Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Pro Thr Cys Gln Ala Ala Val Lys Asp

260 265 270

Met Leu Ser Tyr Met Val Lys Asn Lys Asp Val Trp Glu Gly Ala Val

275 280 285

Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Ile Glu

290 295 300

Pro Thr Asn Gly Pro Ala Tyr Asn Thr Tyr Val Pro Leu Ile Thr Gln

305 310 315 320

Tyr Ala

<210> 2