一种知母配方颗粒的质量标准检测方法
阅读说明：本技术 一种知母配方颗粒的质量标准检测方法 (Quality standard detection method of rhizoma anemarrhenae formula granules ) 是由 罗云 王朋辉 梁宇星 韩艳 赵峰 刘爱珍 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种知母配方颗粒的质量标准检测方法,包括知母配方颗粒的鉴别、知母配方颗粒的检查、知母配方颗粒相关物质的含量测定。本发明针对知母配方颗粒提供了系统化,科学化的质量标准检测方法,包括其鉴别、各项理化指标的检查以及相关成分含量的测定,测定方法使用参数精准控制,能完全反应出知母配方颗粒的质量,更有效地控制产品质量,并可作为大规模生产的知母配方颗粒疗效一致性的评价依据,具有较高的科学指导和产业调控价值。(The invention discloses a quality standard detection method of rhizoma anemarrhenae formula granules, which comprises the steps of identifying the rhizoma anemarrhenae formula granules, checking the rhizoma anemarrhenae formula granules and measuring the content of related substances of the rhizoma anemarrhenae formula granules. The invention provides a systematic and scientific quality standard detection method aiming at rhizoma anemarrhenae formula granules, which comprises the steps of identification, check of various physicochemical indexes and determination of related component contents, and the determination method adopts accurate control of use parameters, can completely reflect the quality of the rhizoma anemarrhenae formula granules, more effectively control the product quality, can be used as an evaluation basis for the consistency of curative effects of the rhizoma anemarrhenae formula granules produced in a large scale, and has higher scientific guidance and industrial regulation and control values.)
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，尤其涉及一种知母配方颗粒的质量标准检测方法。
背景技术
知母配方颗粒为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎制成的配方颗粒。其味苦、甘，寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火，滋阴润燥的功能，可用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘。
在近几年的时间里面，国内外都分别针对知母这种药材的功效和作用，进行不断的开发和研究，尤其是知母饮片的加工，希望可以找到更加多配合治疗的方案。但是针对知母配方颗粒的质量标准检测方法却鲜有研究，其有效成分得不到相应的保证，难以保证患者用药安全有效。
发明内容
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种知母配方颗粒的质量标准检测方法。
为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：
一种知母配方颗粒的质量标准检测方法，包括以下步骤：
(1)知母配方颗粒的鉴别；
(2)知母配方颗粒的检查；
(3)知母配方颗粒相关物质的含量测定。
进一步的，所述鉴别方法包括以下步骤：
(1)性状：应为黄白色至棕黄色颗粒；气微，味微甜、略苦；
(2)取知母配方颗粒粉末0.2g，加30％丙酮10ml，超声处理20分钟，取上清液作为供试品溶液；
(3)取知母皂苷BⅡ对照品，加30％丙酮制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
(4)照薄层色谱法，吸取上述溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
优选的，所述步骤4中的展开剂为正丁醇、冰醋酸、水按体积比4：1：5形成的混合液的上层溶液。
进一步的，所述检查方法包括以下步骤：
(1)粒度检查：照粒度和粒度分布测定法，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和，不得超过15％；
(2)水分检查：中药颗粒剂照水分测定法，水分不得超过8.0％；
(3)溶化性检查：取供试品10g，加热水200ml，搅拌5分钟，立即观察，应全部溶化或轻微浑浊，并不得有焦屑等异物；
(4)微生物限度检查：照微生物限度检查法，规定需氧菌数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌数不得过102cfu/g，大肠埃希菌不得检出；
(5)重金属及有害元素检查：照铅、镉、砷、汞、铜测定法测定，铅不得过5mg/kg、镉不得过0.3mg/kg、砷不得过2mg/kg、汞不得过0.2mg/kg、铜不得过20mg/kg；
(6)浸出物的检查：照醇溶性浸出物测定法的热浸法测定，用乙醇作溶剂，不得少于19.0％。
进一步的，所述含量测定包括芒果苷的含量测定和知母皂苷BⅡ的含量测定。
更进一步的，所述芒果苷的含量测定包括以下步骤：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.2％冰醋酸水溶液(15：85)为流动相，检测波长为258nm，理论板数按芒果苷峰计算应不低于6000；
(2)对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：取知母配方颗粒粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，于功率400W、频率40kHz下超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按干燥品计算，每1g含芒果苷(C19H18O11)不得少于2.3mg。
更进一步的，所述知母皂苷BⅡ的含量测定包括以下步骤：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(25：75)为流动相，蒸发光散射检测器检测，理论板数按知母皂苷BⅡ峰计算应不低于10000；
(2)对照品溶液的制备：取知母皂苷BⅡ对照品适量，精密称定，加30％丙酮制成每1ml含0.50mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：取知母配方颗粒粉末0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％丙酮25ml，称定重量，于功率400W、频率40kHz下超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用30％丙酮补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液5-10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，按干燥品计算，每1g含知母皂苷BⅡ(C45H76O19)不得少于10.0mg。
本发明的优点是：
本发明针对知母配方颗粒提供了系统化，科学化的质量标准检测方法，包括其鉴别、各项理化指标的检查以及相关成分含量的测定，测定方法使用参数精准控制，能完全反应出知母配方颗粒的质量，更有效地控制产品质量，并可作为大规模生产的知母配方颗粒疗效一致性的评价依据，具有较高的科学指导和产业调控价值。
附图说明
图1所示为知母配方颗粒薄层鉴别色谱图，其中：1、知母配方颗粒201805012；2、知母配方颗粒201805022；3、知母配方颗粒201805032；4、阴性样品；5、知母皂苷BⅡ对照品。
图2所示为不同浓度的铅标准品吸光度标准曲线图。
图3所示为不同浓度的镉标准品吸光度标准曲线图。
图4所示为不同浓度的砷标准品吸光度标准曲线图。
图5所示为不同浓度的汞标准品吸光度标准曲线图。
图6所示为不同浓度的铜标准品吸光度标准曲线图。
图7所示为芒果苷含量测定中对照品、样品、辅料、空白样品HPLC对比图谱。
图8所示为芒果苷标准曲线图。
图9所示为LN B17064色谱柱耐用性考察。
图10所示为LN B18123色谱柱耐用性考察。
图11所示为LN B18102色谱柱耐用性考察。
图12所示为知母皂苷BII含量测定中对照品、样品、辅料、空白样品HPLC对比图谱。
图13所示为知母皂苷BII标准曲线图。
图14所示为LOT：15224色谱柱耐用性考察。
图15所示为LOT：15308色谱柱耐用性考察。
图16所示为LOT：14106色谱柱耐用性考察。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：
实施例
炮制：知母饮片按《中国药典》2015年版一部知母项下炮制标准及药材炮制通则0213中的净制、切制、炮制标准进行炮制。
制法：取知母饮片1670g加水煎煮二次，加水量分别为12倍、10倍，每次2h、1.5h，滤过，合并煎液，浓缩至相对密度1.07-1.12(55-60℃)，加入饮片量20％糊精喷雾干燥成浸膏粉，加入糊精辅料适量，混匀，干法制粒，制成颗粒1000g，分装，即得。
性状：对三批试生产知母配方颗粒样品进行性状查，结果见表1。
表1三批次知母配方颗粒性状描述
根据上述三批试生产产品性状检查结果，本品为黄白色至棕黄色颗粒；气微，味微甜、略苦。
一、鉴别
本实验以知母皂苷BⅡ对照品为对照，本方法根据《中华人民共和国药典》2015年版一部知母药材的薄层鉴别方法，建立了知母配方颗粒的薄层鉴别方法。实验结果表明：该知母配方颗粒的薄层鉴别方法稳定、可行。
1、仪器与试药
仪器：SONY DSC-HX400照相机、JA2003N千分之一天平(上海佑科科学仪器仪表有限公司)、DZKW型水浴锅(上海科恒仪器有限公司)、DHG电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、Cary数控超声波清洗器(合肥金尼克机械制造有限公司)、展开缸、硅胶G薄层板。
试药：
知母配方颗粒(批号：201805012、201805022、201805032)；
对照品：知母皂苷BⅡ对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号：111839-201706)；
正丁醇、冰醋酸、丙酮均为分析纯。
2、溶液的制备
2.1供试品溶液的制备：
取本品粉末0.2g，加30％丙酮10ml，超声处理20分钟，取上清液作为供试品溶液。
2.2对照品溶液的制备：
取知母皂苷BⅡ对照品，加30％丙酮制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
2.3阴性样品溶液的制备：
取按照比例缺知母的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。
3、薄层色谱条件
薄层板：硅胶G薄层板；
点样量：供试品溶液、阴性样品溶液及对照品溶液各4μl；
展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)的上层溶液；
显示剂：香草醛硫酸试液；
检视：日光下检视。
4、知母配方颗粒样品薄层鉴别
分别对不同批次的知母配方颗粒样品进行薄层鉴别，实验结果见图1。
结论：采用所述薄层鉴别方法对三批知母的配方颗粒进行鉴别，实验结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在与样品色谱相应的位置上，不显相同颜色的斑点。
二、检查
1、粒度：照粒度和粒度分布测定法《中国药典》2015年版四部(通则0982第二法双筛分法测定)，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和，不得超过15％。本品三批检测结果见表2，均符合规定。
2、水分：中药颗粒剂照水分测定法《中国药典》2015年版四部(通则0832)测定，规定水分不得超过8.0％。本品3批检测结果见表2，均符合规定。
3、溶化性：根据颗粒剂项下有关的各项规定《中国药典》2015年版四部(通则0104)检查，取供试品10g，加热水200ml，搅拌5分钟，立即观察，应全部溶化或轻微浑浊，并不得有焦屑等异物。本品3批检测结果见表2，均符合规定。
4、装量：根据颗粒剂项下有关的各项规定《中国药典》2015年版四部多剂量包装的颗粒剂，照最低装量检查法(通则0942)检查。本品3批检测结果见表2，均符合规定。
表2粒度、水分、溶化性、装量检查结果表
5、微生物限度检查：根据颗粒剂项下有关的各项规定《中国药典》2015年版四部(通则0104)检查，照微生物限度检查法(中国药典2015年版四部通则1105)检查，规定需氧菌数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌数不得过102cfu/g，大肠埃希菌不得检出。
表3微生物限度检验结果
6、重金属及有害元素：
铅
6.1、仪器与试药
仪器：原子吸收分光光度计(安捷伦科技有限公司)、BSA224S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、微波消解仪(南京先欧仪器制造有限公司)、赶酸器(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；
试药：知母配方颗粒(批号：201805011、201805021、201805031)；
标准品：铅单元素标准溶液(中国计量科学研究院，批号：GBW08619-13115)；
硝酸(优级纯)、双氧水。
6.2、溶液的制备
6.2.1供式品溶液的制备：取50g样品粉碎，存于塑料袋中。称取供试品0.5g于消解罐内罐中，加入浓硝酸8mL，双氧水2mL，盖上盖子，放置过夜。次日将装有供式品的内罐套上外罐，放入微波消解仪中。按照微波消解仪的操作规程操作，消解完毕，取出，将消解罐内罐放电热板上加热驱酸，至无黄烟溢出，取下，放凉。用硝酸(2.0％)定量转移并定容至50mL；同时做试剂空白。
6.2.2铅标准使用液的制备：吸取1.0mL铅标准溶液，置于1000mL容量瓶中，加2％硝酸稀释至刻度。如此多次稀释成每毫升含10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng铅的标准吸收液。
6.2.3仪器条件：波长283.3nm，狭缝0.5nm，灯电流10mA,干燥温度100℃持续10s，灰化温度600℃持续20s，原子化温度2100℃持续3s，背景校正为氘灯。
6.2.4标准曲线绘制：吸取上面配置的铅标准使用液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng/mL各10uL,注入石墨炉，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。
6.2.5试样测定：分别吸取样液和空白液各10uL，注入石墨炉，测得其吸光值，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中铅的含量。
6.3、方法学考察
6.3.1线性关系考察
吸取上面配置的铅标准使用液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng/mL各10uL，注入石墨炉，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。结果见表4及图2。
表4不同浓度标准品的吸光度
6.4、知母配方颗粒样品铅的测定
取知母配方颗粒3批，照铅测定项下测定，结果见表5。
表5样品铅的测定结果
镉
6.1、仪器与试药
仪器：原子吸收分光光度计(安捷伦科技有限公司)、BSA224S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、微波消解仪(南京先欧仪器制造有限公司)、赶酸器(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；
试药：知母配方颗粒(批号：201805011、201805021、201805031)；
标准品：镉单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号：GSB04-1721-2004：163041-1)；
硝酸(优级纯)、双氧水。
6.2、溶液的制备
6.2.1供式品溶液的制备：取50g样品粉碎，存于塑料袋中。称取供试品0.5g于消解罐内罐中，加入浓硝酸8mL，双氧水2mL，盖上盖子，放置过夜。次日将装有供式品的内罐套上外罐，放入微波消解仪中。按照微波消解仪的操作规程操作，消解完毕，取出，将消解罐内罐放电热板上加热驱酸，至无黄烟溢出，取下，放凉。用硝酸(2.0％)定量转移并定容至50mL；同时做试剂空白。
6.2.2镉标准使用液的制备：吸取1.0mL镉标准溶液，置于1000mL容量瓶中，加2％硝酸稀释至刻度。如此多次稀释成每毫升含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng镉的标准吸收液。
6.2.3仪器条件：波长228.8nm，狭缝0.5nm，灯电流4mA，干燥温度100℃持续10s，灰化温度600℃持续20s，原子化温度1800℃持续3s，背景校正为氘灯。
6.2.4标准曲线绘制：吸取上面配置的镉标准使用液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng/mL各10uL，注入石墨炉，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。
6.2.5试样测定：分别吸取供式液和空白液各10uL，注入石墨炉，测得其吸光值，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中镉的含量。
6.3、方法学考察
6.3.1线性关系考察
吸取上面配置的镉标准使用液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng/mL各10uL，注入石墨炉，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。结果见表6及图3。
表6不同浓度标准品的吸光度
6.4、知母配方颗粒样品镉的测定
取知母配方颗粒3批，照试样测定项下测定，结果见表7。
表7样品镉的测定结果
砷
6.1、仪器与试药
仪器：原子吸收分光光度计(安捷伦科技有限公司)、BSA224S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、微波消解仪(南京先欧仪器制造有限公司)、赶酸器(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；
试药：知母配方颗粒(批号：201805011、201805021、201805031)；
标准品：砷单元素标准溶液(中国计量科学研究院，批号：GBW08611-15083)；
硝酸(优级纯)、双氧水、硼氢化钾、氢氧化钾。
6.2、溶液的制备
6.2.1供式品溶液的制备：取50g样品粉碎，存于塑料袋中。称取供试品0.5g于消解罐内罐中，加入浓硝酸8mL，双氧水2mL，盖上盖子，放置过夜。次日将装有供式品的内罐套上外罐，放入微波消解仪中。按照微波消解仪的操作规程操作，消解完毕，取出，将消解罐内罐放电热板上加热驱酸，至无黄烟溢出，取下，放凉。用硝酸(2.0％)定量转移并定容至50mL；同时做试剂空白。
6.2.2砷标准使用液的制备：吸取1.0mL砷标准溶液，置于1000mL容量瓶中，加2％硝酸稀释至刻度。如此多次稀释成每毫升含5.0、10.0、15.0、20.0、25.0ng砷的标准吸收液。
6.2.3仪器条件：波长193.7nm，狭缝0.5nm，灯电流10mA，氢化物发生装置。
6.2.4标准曲线绘制：吸取上面配置的砷标准使用液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/L,注入氢化物发生装置，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。
6.2.5试样测定：分别吸取样液和空白液注入氢化物发生装置，测得其吸光值，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中砷的含量。
6.3、方法学考察
6.3.1线性关系考察
吸取上面配置的砷标准使用液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/L，注入氢化物发生装置，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。结果见表8及图4。
表8不同浓度标准品的吸光度
6.4、知母配方颗粒样品砷的测定
取知母配方颗粒3批，照试样测定项下测定，结果见表9。
表9样品砷的测定结果
汞
6.1、仪器与试药
仪器：原子吸收分光光度计(安捷伦科技有限公司)、BSA224S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、微波消解仪(南京先欧仪器制造有限公司)、赶酸器(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；
试药：知母配方颗粒(批号：201805011、201805021、201805031)；
标准品：汞单元素标准溶液(中国计量科学研究院，批号：GBW08617-15034)；
硝酸(优级纯)、双氧水、硼氢化钾、氢氧化钾。
6.2、溶液的制备
6.2.1供式品溶液的制备：取50g样品粉碎，存于塑料袋中。称取约0.4g试样于消解罐内罐中，加入浓硝酸8ml，双氧水2ml，盖上盖子，放置过夜。次日将装有供试品的内罐套上外罐，放入微波消解仪中。按照微波消解仪的操作规程操作，消解完毕，取出，将消解罐内罐放电热板上加热驱酸，至无黄烟溢出，并继续浓缩至2～3ml，放冷，加20％硫酸溶液2ml、5％高锰酸钾溶液0.5ml，摇匀，滴加5％盐酸羟胺溶液至紫红色恰消失，转入50ml量瓶中，用水洗涤容器，洗液合并于量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，必要时离心，取上清液，即得。同法同时制备试剂空白溶液。
6.2.2汞标准使用液的制备：精密量取汞单元素标准溶液适量，用2％硝酸溶液稀释，制成每1ml含汞(Hg)0.1μg的溶液，即得(0-5℃贮存)。分别精密量取汞标准贮备液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置50ml量瓶中，加20％硫酸溶液10ml、5％高锰酸钾溶液0.5ml，摇匀，滴加5％盐酸羟胺溶液至紫红色恰消失，用水稀释至刻度，摇匀如此多次稀释成每毫升含2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ng汞的标准吸收液。
6.2.3仪器条件：波长253.6nm，狭缝0.5nm，灯电流4mA，氢化物发生装置。
6.2.4标准曲线绘制：吸取上面配置的汞标准使用液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/L,注入氢化物发生装置，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。
6.2.5试样测定：分别吸取样液和空白液注入氢化物发生装置，测得其吸光值，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中汞的含量。
6.3、方法学考察
6.3.1线性关系考察
吸取上面配置的汞标准使用液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/L，注入氢化物发生装置，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。结果见表10及图5。
表10不同浓度标准品的吸光度
6.4、知母配方颗粒样品汞的测定
取知母配方颗粒3批，照试样测定项下测定，结果见表11。
表11样品汞的测定结果
铜
6.1、仪器与试药
仪器：原子吸收分光光度计(安捷伦科技有限公司)、BSA224S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、微波消解仪(南京先欧仪器制造有限公司)、赶酸器(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；
试药：知母配方颗粒(批号：201805011、201805021、201805031)；
标准品：铜单元素标准溶液(中国计量科学研究院，批号：GBW08615-16032)；
硝酸(优级纯)、双氧水。
6.2、溶液的制备
6.2.1供式品溶液的制备：取50g样品粉碎，存于塑料袋中。称取0.5g试样于消解罐内罐中，加入浓硝酸8mL，双氧水2mL，盖上盖子，放置过夜。次日将装有供式品的内罐套上外罐，放入微波消解仪中。按照微波消解仪的操作规程操作，消解完毕，取出，将消解罐内罐放电热板上加热驱酸，至无黄烟溢出，取下，放凉。用硝酸(2.0％)定量转移并定容至50mL；同时做试剂空白。
6.2.2铜标准使用液的制备：吸取1.0mL铜标准溶液，置于1000mL容量瓶中，加2％硝酸稀释至刻度。如此多次稀释成每毫升含0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μg铜的标准吸收液。
6.2.3仪器条件：波长324.7nm，狭缝0.2nm，灯电流4mA，火焰检测器检测。
6.2.4标准曲线绘制：吸取上面配置的铜标准使用液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μg/mL,注入火焰检测器，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。
6.2.5试样测定：分别吸取样液和空白液注入火焰检测器，测得其吸光值，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中铜的含量。
6.3、方法学考察
6.3.1线性关系考察
吸取上面配置的铜标准使用液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μg/mL，注入火焰检测器，测得吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程。结果见表12及图6。
表12不同浓度标准品的吸光度
6.4、知母配方颗粒样品铜的测定
取知母配方颗粒3批，照试样测定项下测定，结果见表13。
表13样品铜的测定结果
结论：根据上述3批样品测定结果，知母配方颗粒中铅的含量为0.151-0.201mg/kg考虑到不同批次之间的差异，定本品每1kg含铅不得过5mg，镉的含量为0.004-0.011mg/kg考虑到不同批次之间的差异，定本品每1kg含镉不得过0.3mg，砷的含量为0.015-0.047mg/kg考虑到不同批次之间的差异，定本品每1kg含砷不得过2mg，汞的含量为0mg/kg考虑到不同批次之间的差异，定本品每1kg含汞不得过0.2mg，铜的含量为0.7-0.9mg/kg考虑到不同批次之间的差异，定本品每1kg含铜不得过20mg。
7、浸出物：照醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法，用乙醇作溶剂，不得少于19.0％。本品3批检测结果见表14，均符合规定。
表14浸出物检验结果
三、含量测定
知母含多种知母皂苷(Timosaponin)，还含芒果苷、异芒果苷、鞣酸等。又含菝葜皂苷元、马尔可皂苷元、薯蓣皂苷元、宝藿苷、淫羊藿苷、知母属皂苷Ⅰ-Ⅳ等。知母根茎含知母多糖A-D、顺-扁柏树脂酚、咕吨酮-C-糖苷、β-谷甾醇、烟酸等。用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘。知母配方颗粒是知母药材饮片经加工制成的配方颗粒，具有用药安全、有效、方便以及易于贮藏和运输等特点。本方法参考《中国药典》2015年版一部知母药材项下的含量测定方法制订，并对该方法进行了方法学验证，实验结果表明，该方法操作方便、可行，准确度高。
芒果苷：照高效液相色谱法(通则0512)测定。
1、仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent VWD,安捷伦科技有限公司；
色谱柱：Agilent C18(4.6*250mm，5μm)，LN B17064；Agilent C18(4.6*250mm，5μm)，LN B18123；Agilent C18(4.6*250mm，5μm)，LN B18102；
电子分析天平：BSA224S(万分之一),赛多利斯科学仪器有限公司；MCM36(百万分之一)，赛多利斯科学仪器有限公司；
乙腈：色谱纯，TEDIA(天地)科技有限公司；
乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
冰醋酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；
水：娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团；
芒果苷对照品(批号：111607-201704，纯度98.1％)，购自中国食品药品检定研究院。
2、含量测定方法的初步确定
参照《中国药典》2015年版一部中知母【含量测定】项下色谱条件进行实验，所得图谱基线平稳，峰形、分离度良好，故沿用知母含量测定方法，并进行方法的考察。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％冰醋酸水溶液(15：85)为流动相；检测波长为258nm；柱温30℃。理论板数按芒果苷峰计算应不低于6000。
对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.1供试品溶液制备方法考察
2.1.1提取方式考察
取本品(批号：201805011)约0.1g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称重，分别超声30分钟、回流提取30分钟，取出，放冷，称重，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。结果见表15。
表15提取方式考察结果
结果表明，不同提取方式对应的每克取样量下芒果苷峰面积相对偏差小于2.0％，考虑操作方便，故确定提取方式为超声处理。
2.1.2提取溶剂考察
取本品(批号：201805011)0.1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶，分别精密加入水25ml、稀乙醇25ml、乙醇25ml，称定重量，超声30分钟，取出，放冷，称重，以对应溶剂补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。结果见表16。
表16知母配方颗粒提取溶剂
结果表明，水与稀乙醇作为提取溶剂时，每克取样量下芒果苷峰面积最高，且二者的峰面积相对偏差小于2.0％，为考虑样品的稳定性及操作方便，便于过滤，故确定提取溶剂为稀乙醇。
因此确定供试品制备方法为：取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3、方法学考察
3.1专属性试验
知母配方颗粒中含有芒果苷，为考察辅料、溶剂是否干扰芒果苷的测定，按处方比例称取辅料同法制成辅料样品溶液，记录色谱图。结果表明，辅料糊精、溶剂色谱中在与芒果苷相应的保留时间没有色谱峰，表明辅料、溶剂对芒果苷的测定无干扰，以本法同时测定本品中芒果苷的含量具有专属性(见图7)。
3.2线性关系的考察
精密称取芒果苷对照品11.503mg(111607-201704，98.1％)置100ml量瓶，加稀乙醇适量，超声溶解，加稀乙醇至刻度线，摇匀，作为储备液。分别精密量取上述储备液2ml、2ml、5ml、10ml至25ml、20ml、20ml、20ml容量瓶，加稀乙醇至刻度线，混匀，即得对照品溶液。
分别精密吸取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，照液相色谱法(2015年版中国药典四部通则0512)测定。以浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。芒果苷回归方程：
y＝45.444x-12.118，相关系数：R2＝1.0000
如表17和图8所示，结果表明，芒果苷在9.03-112.84μg/ml范围内线性良好。
表17芒果苷线性关系
3.3仪器精密度试验
精密吸取芒果苷对照品溶液(浓度为51.46μg/ml)10μl，按【含量测定】项下的色谱条件和测定法项下进行操作，连续进样6次，测定结果见表18。
表18仪器精密度试验结果(n＝6)
结果表明，RSD<2.0％，仪器精密度良好。
3.4稳定性试验
取本品(批号：201805011)，研细，取约0.1g，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0、2、4、8、12、18、24h进样测定，测定结果见表19。
表19稳定性试验结果
结果表明，RSD<2.0％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
3.5耐用性验证
取样品溶液，分别连接Agilent C18(4.6*250mm，5μm)，LN B17064；Agilent C18(4.6*250mm，5μm)，LN B18123；Agilent C18(4.6*250mm，5μm)，LN B18102；三个不同批号色谱柱，在同一色谱条件下对同一知母配方颗粒样品进行进样，结果如图9、10、11所示，色谱峰型良好，分离度良好，结果表明该色谱条件具有普适性。
3.6重复性试验
取本品(批号：201805011)，研细，取约0.1g(共6份)，精密称定，按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。结果见表20。
表20重复性试验结果(n＝6)
结果表明，RSD<2.0％，说明本方法的重复性良好。
3.7加样回收率试验
采用加样回收法，取本品(批号：201805011)，研细，取约0.05g(共6份)，精密称定，分别添加浓度为0.113mg/mL的对照品溶液5mL(批号：111607-201704，纯度98.1％)，按供试品溶液制备方法提取处理。结果见表21。
根据知母配方颗粒(批号：201805011)中芒果苷含量为11.20mg/g。
表21芒果苷准确度试验结果(n＝6)
结果，平均回收率为93.27％，RSD<2.0％，表明本方法准确度较好。
4、知母配方颗粒样品的含量测定
取知母配方颗粒3批，照标准含量测定项下测芒果苷(C19H18O11)的含量，结果见表22，成品转移率见表23。
表22样品的含量测定结果
表23三批样品芒果苷含量测定结果
结论：根据上述3批样品测定结果，三批配方颗粒中芒果苷(C19H18O11)的含量测定结果为1.10-1.12％；转移率为35.6-36.3％。
5、含量限度的制定
由于配方颗粒在生产中加入了辅料，故在计算中需扣除辅料量，再结合标准汤剂中含量限度范围与出膏率，定本品每克含芒果苷(C19H18O11)不得少于2.3mg。
知母皂苷BⅡ：照高效液相色谱法(通则0512)测定。
1、仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent ELSD,安捷伦科技有限公司；
色谱柱：Thermo(4.6*250mm，5μm)LOT：15224；Thermo(4.6*250mm，5μm)LOT：15308；Thermo(4.6*250mm，5μm)LOT：14106
电子分析天平：BSA224S(万分之一),赛多利斯科学仪器有限公司；MCM36(百万分之一)，赛多利斯科学仪器有限公司
乙腈：色谱纯，TEDIA(天地)科技有限公司；
丙酮：国药集团化学试剂有限公司；
水：娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团；
知母皂苷BII对照品(批号：111839-201706，纯度94.5％)，购自中国食品药品检定研究院。
2、含量测定方法的初步确定
参照《中国药典》2015年版一部中知母【含量测定】项下色谱条件进行实验，所得图谱基线平稳，峰形、分离度良好，故沿用知母含量测定方法，并进行方法的考察。
色谱条件与系统适用性试验：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－水(25：75)为流动相；蒸发光散射检测器检测。柱温30℃。
对照品溶液的制备：取知母皂苷BII对照品适量，精密称定，加30％丙酮制成每1ml含0.50mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％丙酮25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用30％丙酮补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
2.1供试品溶液制备方法考察
2.1.1提取方式考察
取本品(批号：201805011)约0.15g(共2组)，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入30％丙酮25ml，密塞，称重，分别超声30分钟、回流提取30分钟，取出，放冷，称重，用30％丙酮补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表24。
表24提取方式考察结果
结果表明，不同提取方式对应的每克取样量下提取知母皂苷BII超声与加热回流峰面积相对偏差为1.76％，为考虑操作方便，故提取方式为超声处理。
2.1.2提取溶剂考察
取本品(批号：201805011)0.15g(共3组)，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入30％丙酮25ml、丙酮25ml、水25ml，称定重量，超声(功率400W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，称重，分别以对应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表25
表25知母配方颗粒提取溶剂
由此可知，30％丙酮为提取溶剂时，每克取样量下知母皂苷BII峰面积最高，因此确定提取溶剂为30％丙酮。
因此确定供试品制备方法为：取本品粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％丙酮25ml，密塞，称定重量，超声(功率400W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％丙酮补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3、方法学考察
3.1专属性试验
知母配方颗粒中含有知母皂苷BII，为考察辅料是否干扰知母皂苷BII的测定，按处方比例称取辅料同法制成辅料样品溶液，记录色谱图。结果表明，辅料糊精、溶剂色谱中在与知母皂苷BII相应的保留时间没有色谱峰，表明辅料糊精、溶剂对知母皂苷BII的测定无干扰，以本法同时测定本品中知母皂苷BII的含量具有专属性(见图12)。
3.2线性关系的考察
精密称取知母皂苷BII对照品26.280mg(111839-201706，纯度94.5％)置50ml量瓶，加30％丙酮适量，超声溶解，加30％丙酮至刻度线，摇匀，作为储备液。分别精密量取上述储备液2ml至5ml、10ml、20ml、25ml容量瓶，加30％丙酮至刻度线，混匀，即得对照品溶液。
分别精密吸取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，照液相色谱法(2015年版中国药典四部通则0512)测定。以浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。知母皂苷BII回归方程：
y＝1.6670x-1.6160，相关系数：R2＝0.9990
如表26和图13所示，结果表明，知母皂苷BII在39.74-496.69μg/ml范围内线性良好。
表26知母皂苷BII线性关系
3.3仪器精密度试验
精密吸取知母皂苷BII对照品溶液(浓度为496.69μg/ml)20μl，按正文【含量测定】项下的色谱条件和测定法项下进行操作，连续进样6次，测定结果见表27。
表27仪器精密度试验结果(n＝6)
结果表明，RSD<2.0％，仪器精密度良好。
3.4稳定性试验
取本品(批号：201805011)，研细，取约0.3g，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0、2、4、8、12、18、24h进样测定，测定结果见表28。
表28稳定性试验结果
结果表明，RSD<2.0％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
3.5耐用性验证
取样品溶液，分别连接Thermo(4.6*250mm，5μm)LOT：15224；Thermo(4.6*250mm，5μm)LOT：15308；Thermo(4.6*250mm，5μm)LOT：14106，三个不同批号色谱柱，在同一色谱条件下对同一知母配方颗粒样品进行进样结果如图14、15、16所示，色谱峰型良好，分离度良好，结果表明该色谱条件具有普适性。
3.6重复性试验
取本品(批号：201805011)，研细，取约0.3g(共6份)，精密称定，按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。结果见表29。
表29重复性试验结果(n＝6)
结果表明，RSD<2.0％，说明本方法的重复性良好。
3.7加样回收率试验
采用加样回收法，取本品(批号：201805011)，研细，取约0.15g(共6份)，精密称定，分别添加浓度为496.69μg/mL的对照品溶液3mL(批号：111839-201706，纯度94.5％)，按供试品溶液制备方法提取处理。结果见表30。
根据知母配方颗粒(批号：201805011)中知母皂苷BII含量为10.34mg/g。
表30知母皂苷BII准确度试验结果(n＝6)
结果，平均回收率为103.80％，RSD<2.0％，表明本方法准确度较好。
4、配方颗粒样品的含量测定
取知母配方颗粒3批，照标准含量测定项下测知母皂苷BⅡ的含量，结果见表31，成品转移率为表32。
表31样品的含量测定结果
表32三批样品知母皂苷BⅡ含量测定结果
结论：根据上述3批样品测定结果，三批配方颗粒中知母皂苷BⅡ(C45H76O19)的含量测定结果为1.08-1.11％；转移率为20.9-21.4％。
5、含量限度的制定
由于配方颗粒在生产中加入了辅料，故在计算中需扣除辅料量，再结合标准汤剂中含量限度范围与出膏率，暂定本品每克含知母皂苷BⅡ(C45H76O19)不得少于10.0mg。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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