一种拉曼增强基底及其制备方法和检测miRNA的方法

文档序号：1308654 发布日期：2020-08-11 浏览：13次 >En<

阅读说明：本技术 一种拉曼增强基底及其制备方法和检测miRNA的方法 (Raman enhanced substrate, preparation method thereof and method for detecting miRNA (micro ribonucleic acid) ) 是由周宏� 丁可欣刘静刘树峰于 2020-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种拉曼增强基底及其制备方法和检测miRNA的方法,涉及miRNA检测技术领域。本发明在氧化铟锡(ITO)玻璃芯片表面通过电还原方法生成一层三维金纳米化薄膜,制备的该独特的三维金纳米化结构可以产生更活跃的“热点”,是一种良好的拉曼增强基底。本发明基于所述拉曼增强基底构建拉曼传感器,并用于检测miRNA。本发明通过修饰特殊结构的捕获探针来提高检测的特异性,并且结合Toehold介导的链置换放大反应对信号进行放大,可实现目标miRNA的高灵敏、特异性拉曼检测。(The invention provides a Raman enhanced substrate, a preparation method thereof and a method for detecting miRNA, and relates to the technical field of miRNA detection. According to the invention, a layer of three-dimensional gold nano-film is generated on the surface of an Indium Tin Oxide (ITO) glass chip by an electro-reduction method, and the prepared unique three-dimensional gold nano-structure can generate more active 'hot spots', and is a good Raman enhancement substrate. The Raman sensor is constructed on the basis of the Raman enhancement substrate and is used for detecting miRNA. The invention improves the detection specificity by modifying the capture probe with a special structure, and amplifies the signal by combining with the Toehold-mediated strand displacement amplification reaction, thereby realizing the high-sensitivity and specific Raman detection of the target miRNA.)

技术领域

本发明属于miRNA检测技术领域，具体涉及一种拉曼增强基底及其制备方法和检测miRNA的方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一种短片段非编码的小分子RNA，广泛存在于真核细胞中，可以调控靶基因mRNA的表达。miRNA的异常表达与许多重大疾病特别是癌症的发生密切相关。因此，miRNA作为一种典型的肿瘤标志物，正受到越来越多的关注。miRNA的含量在肿瘤患者体内往往呈现异常，比如miRNA-155和miRNA-210的表达水平在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的血液中显著增高。miRNA-21的表达水平在卵巢癌患者的血清中显著增高。此外，miRNA的表达水平不仅能检测肿瘤的发生，还可以作为肿瘤患者预后疗效评估的指标。在非小细胞肺癌(NSCLC)中，高表达let-7的患者生存时间明显长于较低表达的患者，而低表达miRNA-17a的患者的生存时间明显长于高表达的患者。因此，研究miRNA分子标志物有助于全方位的探讨肿瘤形成和发展的分子机理，并为肿瘤的诊断和治疗提供指导。

超灵敏miRNA检测对于癌症的早期诊断和靶向抗癌药物的开发具有重要意义，然而，由于miRNA片段体积小、在细胞中表达低、序列同源性高，因此对miRNA的超敏检测面临诸多挑战。传统的检测方法如微阵列法技术、定量荧光逆转录PCR和生物荧光测定法等被用于miRNA的定量检测，但是，这些方法成本高、耗时长且操作复杂，在一定程度上限制了这些技术的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种拉曼增强基底及其制备方法和检测miRNA的方法，实现目标miRNA的高灵敏、特异性拉曼检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种拉曼增强基底的制备方法，包括以下步骤：将清洗、干燥的氧化铟锡玻璃芯片置于电解液中，利用循环伏安法作用50个周期；所述电解液包括以下摩尔浓度的成分：0.03～0.1M磷酸盐溶液、0.03～0.1M KCl和2.0～2.5mM HAuCl₄·4H₂O。

优选的，所述清洗的方法，包括：将氧化铟锡玻璃，放入含有2M KOH的2-丙醇煮沸18～25min，然后置于乙醇水溶液的超声波浴中超声清洗3～5min。

优选的，将所述氧化铟锡玻璃芯片置于电解液中后，向所述电解液充氮气和保持60℃环境。

优选的，所述电解液的用量为4cm²氧化铟锡玻璃芯片/5mL电解液。

优选的，所述循环伏安法为电位在-0.8V到0.3V之间以0.05V/s的速度循环。

本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的拉曼增强基底，所述拉曼增强基底为在氧化铟锡玻璃芯片表面沉积一层三维金纳米化薄膜。

本发明还提供了一种基于上述制备方法制备得到的拉曼增强基底或所述拉曼增强基底的拉曼传感器的构建方法，包括以下步骤：(1)将摩尔比为3.0:3.2:3.2的巯基修饰的DNA1、辅助DNA2和辅助DNA3在Tris-HCl缓冲液中反应10min，冷却至18～25℃后，静置不少于60min，得双螺旋捕获探针DNA混合液；所述巯基修饰的DNA1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述辅助DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，辅助DNA3的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；所述反应的温度为85℃；

(2)将所述双螺旋捕获探针DNA混合液与TCEP混合后孵育1h，得孵育液；所述TCEP与巯基修饰的DNA1、辅助DNA2和辅助DNA3混合量的摩尔比为1000：(9～10)；

(3)将所述孵育液滴加于所述拉曼增强基底的表面，在0℃环境中反应6h后，用磷酸缓冲液冲洗3次，纯化氮烘干后，再置于巯基己醇中反应2h，磷酸缓冲液冲洗3次，纯化氮烘干，得拉曼传感器。

优选的，步骤(3)所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.01M，pH值为7.0。

本发明还提供了一种利用上述构建方法构建得到的拉曼传感器检测miRNA的方法，包括以下步骤：分别向所述拉曼传感器上滴加不同浓度的miRNA-21和罗丹明6G(R6G)修饰的拉曼探针DNA混合液，反应85min后，用磷酸缓冲液冲洗，置于633nm激光下测量表面拉曼光谱强度，根据目标物浓度与拉曼光谱强度的关系作图得标准曲线，根据所述标准曲线计算miRNA的浓度。

优选的，所述标准曲线为I＝1770.18lg C+27169.55，其中I为有目标物时的拉曼信号，C为目标物的浓度，线性相关系数R＝0.991。

本发明提供了一种拉曼增强基底的制备方法，在氧化铟锡(ITO)玻璃芯片表面通过电还原方法生成一层三维金纳米化薄膜，制备的该独特的三维金纳米化结构可以产生更活跃的“热点”，是一种良好的拉曼增强基底。本发明基于所述拉曼增强基底构建拉曼传感器，并用于检测miRNA。本发明以miRNA-21为例，利用三维金纳米化/ITO芯片作为拉曼增强基底，将巯基修饰的DNA1和两条辅助DNA(DNA2和DNA3)杂交反应形成双螺旋DNA作为捕获探针修饰在拉曼增强基底表面形成拉曼传感器，在拉曼传感器上加入目标miRNA-21时，捕获探针以特异性结合目标miRNA-21并释放出辅助DNA2；此时，在溶液中大量拉曼信号探针(罗丹明6G修饰的DNA)存在下，通过Toehold介导的链置换反应取代辅助DNA3和目标链miRNA-21，从而释放目标链miRNA-21(图2)。释放的目标链则继续打开基底表面的其他捕获探针，如此的循环作用实现了目标链miRNA-21的循环使用，并且最终在基底表面结合更多的带有罗丹明6G的拉曼信号探针，最后通过基底增强罗丹明6G的拉曼信号来实现对目标miRNA-21的高灵敏高选择性检测。

附图说明

图1为在氧化铟锡(ITO)芯片表面构建三维金纳米化的扫描电镜图；

图2为基于表面增强拉曼信号基底和Toehold介导的链置换放大反应的miRNA拉曼检测原理图；

图3为拉曼响应曲线和工作曲线，其中A为拉曼响应曲线，B为工作曲线；

图4为选择性实验图。

具体实施方式

本发明将所述氧化铟锡玻璃芯片置于电解液前，首先对所述氧化铟锡玻璃芯片进行清洗和干燥，所述清洗优选包括：将氧化铟锡玻璃放入含有2M KOH的2-丙醇煮沸18～25min，然后置于乙醇水溶液的超声波浴中超声清洗3～5min。本发明所述煮沸的时间优选为20min。本发明所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为75％。本发明所述超声清洗的超声频率优选为100KHZ，超声清洗的时间优选为5min。本发明将清洗后的氧化铟锡玻璃进行干燥，所述干燥优选为在60℃环境中烘干。本发明在进行所述清洗和干燥前，优选将氧化铟锡玻璃裁剪为1cm×4cm的小块。

本发明将所述氧化铟锡玻璃芯片置于电解液中后，优选向所述电解液充氮气和保持60℃环境。本发明所述电解液优选包括以下摩尔浓度的成分：0.05M磷酸盐溶液、0.05MKCl和2.4mM HAuCl₄·4H₂O。本发明所述循环伏安法优选为电位在-0.8V到0.3V之间以0.05V/s的速度循环。本发明所述电解液的用量优选为4cm²氧化铟锡玻璃芯片/5mL电解液。在本发明中，经过循环伏安法作用50个周期后，ITO电极颜色由无色变为黄色，说明维金纳米在电极上沉积成功。本发明在氧化铟锡(ITO)玻璃芯片表面通过电还原方法生成一层三维金纳米化薄膜，制备的该独特的三维金纳米化结构可以产生更活跃的“热点”，是一种良好的拉曼增强基底。

本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的拉曼增强基底，所述拉曼增强基底为在氧化铟锡玻璃芯片表面沉积一层三维金纳米化薄膜。

(2)将所述双螺旋捕获探针DNA混合液与TCEP混合后孵育1h，得孵育液；所述TCEP与巯基修饰的DNA1、辅助DNA2和辅助DNA3混合量的摩尔比为1000：(9～10)；

(3)将所述孵育液滴加于所述拉曼增强基底的表面，在0℃环境中反应6h后，用磷酸缓冲液冲洗3次，纯化氮烘干后，再置于MCH中反应2h，磷酸缓冲液冲洗3次，纯化氮烘干，得拉曼传感器。

本发明将摩尔比为3.0:3.2:3.2的巯基修饰的DNA1、辅助DNA2和辅助DNA3在Tris-HCl缓冲液中85℃反应10min，然后冷却至18～25℃后，静置不少于60min，得双螺旋捕获探针DNA混合液；所述巯基修饰的DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述辅助DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，辅助DNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反应的温度为85℃。本发明所述Tris-HCl缓冲液中优选还包括0.1M NaCl，pH值为7.4。本发明在所述静置时，可使三条DNA链相互杂交形成双螺旋捕获探针DNA。本发明实施例中以miRNA-21为例构建拉曼增强基底和拉曼传感器，其中巯基修饰的DNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5'-(SH)-TTTTTTGAAATG GTGGAAAGGTAGGGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'；

辅助DNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5'-TCAGACTGATGTTGACCCTATATCCATAAATT-3'；

辅助DNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：5'-CCTTTCCACCATTTC-3。

得双螺旋捕获探针DNA混合液后，本发明将所述双螺旋捕获探针DNA混合液与TCEP混合后孵育1h，得孵育液；所述TCEP与巯基修饰的DNA1、辅助DNA2和辅助DNA3混合量的摩尔比为1000：(9～10)。本发明所述孵育的温度优选为25℃。本发明所述TCEP的加入可使巯基DNA1上的二硫键断裂。

得孵育液后，本发明将所述孵育液滴加于所述拉曼增强基底的表面，在0℃环境中反应6h后，用磷酸缓冲液冲洗3次，纯化氮烘干后，再置于巯基己醇(MCH)中反应2h，磷酸缓冲液冲洗3次，纯化氮烘干，得拉曼传感器。本发明所述0℃环境优选为冰浴环境。本发明所述磷酸缓冲液的摩尔浓度优选为0.01M，pH值为7.0。本发明所述MCH优选为1mM的新鲜配制溶液，本发明所述MCH的加入可使上述的双螺旋捕获探针DNA在拉曼增强基底表面有序的直立起来，并且还可以封闭拉曼基底表面的其它活性位点，防止其它生物分子发生非特异性的吸附。

本发明在检测miRNA时，首先绘制标准曲线，以实施例中检测miRNA-21为例，具体包括：取10μL一组浓度梯度的目标miRNA-21和罗丹明6G修饰的拉曼探针DNA(1.0μM)混合液，分别滴加到拉曼传感器上室温下反应85分钟后，然后用10mM，pH7.4的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，在633nm激光下，用拉曼光谱仪测量了传感器的表面增强拉曼光谱强度，根据目标物浓度与拉曼光谱强度的关系作图得标准曲线，并根据标准曲线计算线性回归方程为I＝1770.18lg C+27169.55，其中I为有目标物时的拉曼信号，C为目标物的浓度，线性相关系数R＝0.991。

下面结合实施例对本发明提供的拉曼增强基底及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

试剂盒仪器：激光共焦拉曼分析仪(RamLab-010，英国雷尼绍公司)、电化学工作站(CHI660B，上海辰华仪器有限公司)、超纯水机(Sybergy UV，默克密理博)。

HAuCl₄·4H₂O(氯金酸)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)和MCH(巯基己醇)购于Sigma-Aldrich公司，DNA和RNA由大连宝生物合成(其中DNA1为巯基修饰)。

实施例1

将一块ITO玻璃切成小块(1cm×4cm)，放入含有2M KOH的2-丙醇煮沸20min，彻底清洗干净，然后用乙醇和水在超声波浴中清洗后60℃烘干。将清洗后的ITO玻璃芯片浸入5.0mL含有0.05M磷酸盐溶液(pH＝2)、0.05M KCl和2.4mM HAuCl₄·4H₂O的电解液中，在电解液充氮气和60℃的条件下，采用循环伏安法(电位在-0.8V到0.3V之间以0.05V/s的速度)作用50个周期。在此条件下，ITO电极颜色由无色变为黄色，说明维金纳米在电极上沉积成功(图1)。最后，将这些ITO芯片作为拉曼增强基底进行微洗并在4℃条件下保存，以备后续实验。

实施例2

20mL含有3.0μM巯基修饰的DNA1、3.2μM辅助DNA2和3.2μM辅助DNA3的Tris-HCl缓冲液(0.1M NaCl，pH值7.4)在85℃下加热10分钟，然后冷却至室温至少60分钟使三条DNA链相互杂交形成双螺旋捕获探针DNA。在上述探针混合物中加入1.0mM TCEP，25℃孵育1h，使巯基DNA1上的二硫键断裂，最后取10μL捕获探针DNA溶液滴加到制备好的拉曼基底芯片表面于冰浴反6小时后用0.01M，pH7.0磷酸缓冲溶液洗涤芯片3次，然后用纯化氮烘干后将芯片沉入1mM新鲜的MCH中反应2小时，然后用0.01M，pH7.0磷酸缓冲溶液洗涤芯片3次，再用氮气烘干后制得拉曼传感器以备后续实验。

其中，巯基修饰的DNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5'-(SH)-TTTTTTGAAATGGTGGAAAGGTAGGGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'；

辅助DNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5'-TCAGACTGATGTTGACCCTATATCCATAAATT-3'；

辅助DNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：5'-CCT TTC CAC CAT TTC-3。

实施例3

取10μL一组浓度梯度的目标miRNA-21和罗丹明6G(R6G)修饰的拉曼探针DNA(1.0μM)混合液，分别滴加到拉曼传感器上室温下反应85分钟后，然后用10mM，pH7.4的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，在633nm激光下，用拉曼光谱仪测量了传感器的表面增强拉曼光谱强度，根据目标物浓度与拉曼光谱强度的关系作图得标准曲线(图3)，并根据标准曲线计算线性回归方程为I＝1770.18lg C+27169.55(I为有目标物时的拉曼信号，C为目标物的浓度)，线性相关系数R＝0.991。其中，罗丹明6G(R6G)修饰的拉曼探针DNA核苷酸序列为SEQ IDNO.4：5'-TCA GAC TGATGTTGACCC TAC CTTTCCACCATTTC-(R6G)-3’。

实施例4

(1)选择性实验：使用目标miRNA-21、单碱基错配miRNA-21、多碱基错配miRNA-21以及空白组来验证该传感器的选择性。如图4所示，当存在过量的单碱基错配miRNA-21(5.0nM)和多碱基错配miRNA-21(5.0nM)时，与空白试验相比，拉曼信号的变化非常微小(空白试验中不存在目标miRNA-21)。然而，即使与单碱基错配miRNA(5.0nM)相比，当出现少量的目标miRNA-21时，拉曼强度也显著增强。这些对比清楚地表明，由于Toehold链置换反应的高度序列依赖性，使得该传感器对于miRNA-21的拉曼检测方法具有良好的选择性；其中，目标miRNA-21核苷酸序列为SEQ ID NO.5：5'-UAG CUUAUCAGACUGAUG UUGA-3'；

单碱基错配miRNA-21核苷酸序列为SEQ ID NO.6：5'-UAG CUUAUC AGACCGAUGUUGA-3'；

多碱基错配miRNA-21核苷酸序列为SEQ ID NO.7：5'-UAG CUAAUC AGACCGAUGUAGA-3'。

(2)样品测定：将含目标miRNA-21的样品与罗丹明6G修饰的拉曼探针DNA(1.0μM)混合后加到拉曼传感器上，室温下反应85分钟后，然后用10mM，pH7.4的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，在633nm激光下，用拉曼光谱仪测量了传感器的表面增强拉曼光谱强度，根据拉曼强度(I＝2176)，再利用线性回归方程(I＝1770.18lg C+27169.55)计算样品中目标miRNA-21含量为7.6fM。

本专利制备表面增强拉曼基底，通过修饰特殊结构的捕获探针来提高检测的特异性，并且结合Toehold介导的链置换放大反应对信号进行放大，可实现目标miRNA的高灵敏、特异性拉曼检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种拉曼增强基底及其制备方法和检测miRNA的方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 48

<212> DNA