阅读说明：本技术 甜油菜籽蛋白质分离物 (Sweet rapeseed protein isolate ) 是由 马克·亚历山大·范登贝尔赫 史晶 于 2018-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及甜油菜籽蛋白质分离物,包含油菜籽蛋白质分离物的组合物、食品和饮料,以及具有增甜效果的油菜籽蛋白质分离物蛋白质的用途。(The present invention relates to a sweet rapeseed protein isolate, compositions, food products and beverages comprising the rapeseed protein isolate, and the use of rapeseed protein isolate protein having a sweetening effect.)

具体实施方式

在本发明的第一方面，提供了一种天然油菜籽蛋白质分离物，包含超过60重量％的芸苔籽蛋白和30mg/kg至3000mg/kg的酚类化合物。

在本发明的上下文中，酚类化合物(phenolics)是具有酚部分的化合物。在暴露于本发明的第二方面的方法之前通常在油菜籽中出现的酚类化合物的实施例是羟基肉桂酸(羟基肉桂酸的实施例是间香豆酸、邻香豆酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸)，但也可以是衍生自它们的化合物，例如4-乙烯基丁香酚等。术语“酚类化合物”还包括在本领域中称为多酚类的化合物。酪氨酸和包含酪氨酸的多肽和蛋白质被排除在酚类化合物的上述定义之外。

在一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物具有250mg/kg至2500mg/kg的酚类化合物。在另一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物具有500mg/kg至2000mg/kg的酚类化合物。在另一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物具有1600mg/kg至1900mg/kg的酚类化合物。

在一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％的水溶液中具有相当于至少10g/L的蔗糖水溶液的甜度。

在一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物包含芸苔籽蛋白，芸苔籽蛋白是通过蓝色非变性PAGE(Blue Native PAG，蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为10kDa至15kDa的蛋白质。在一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物是芸苔籽蛋白，一种1.7-2S白蛋白。术语芸苔籽蛋白包括几种亚型，分别为芸苔籽蛋白-1、芸苔籽蛋白-2、芸苔籽蛋白-3、芸苔籽蛋白-1A、芸苔籽蛋白-B和Nap1，分子量范围为12.5至14.5kDa。成熟的芸苔籽蛋白包含通过两个链间二硫键连接在一起的一条小(短，约4kDa)的多肽链和一条大(长，约9kDa)的多肽链，而大链具有两个链内二硫键(Shewry等人，Plant Cell.7(1995)945-956)。

在另一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物包含60至100重量％的芸苔籽蛋白，优选70至97重量％的芸苔籽蛋白，更优选80至95重量％的芸苔籽蛋白，例如80±10重量％的芸苔籽蛋白或85±10重量％的芸苔籽蛋白。

在另一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％的水溶液中具有相当于至少20g/L，优选25至125g/L，更优选30至100g/L的蔗糖水溶液的甜度。

或者，甜度水平可以表示为甜度等效因子。在一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的甜度等效因子为至少0.5。这意味着当加入2重量％的水溶液时，甜度相当于至少10g/L的蔗糖水溶液。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物的甜度当量为至少15g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少0.75)，更优选至少25g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为1.25)，或至少30g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为1.5)，至少35g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为1.75)，至少40g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为2.0)，至少45g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为2.25)，至少50g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为2.5)，或甚至约100g/L的蔗糖(意味着甜度等效因子至少为5)，例如70至130g/L(意味着甜度等效因子为3.5至6.5)，这样的数量相当于市场上的一些高糖饮料的甜度。

通过以下方式确定包含预定重量百分比的本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的水溶液的甜度等效因子(例如1％，2％或3％)：由受过训练的感官专门小组成员评估甜度，并将其与固定参考蔗糖溶液进行比较并确定提供相似甜度的实际蔗糖溶液/浓度。可以通过将相等甜的蔗糖溶液的浓度(以g/L计)除以本发明的天然油菜籽蛋白质分离物来计算包含预定重量百分比的本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的水溶液的甜度等效因子(例如1％、2％或3％)。作为这种计算的非限制性实施例：如果本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的2％水溶液与3％蔗糖溶液同样甜，则甜度等效因子为30/20＝1.5。

在另一个实施方式中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物在温度为23±2℃、pH为3至10的条件下具有至少88％，优选至少90％，更优选至少94％，最优选至少96％的溶解度。这也称为可溶性固形物指数(SSI)。

为了用于人类食物消耗，天然油菜籽蛋白质分离物优选包含低水平的盐。这是通过测量电导率来确定的。优选地，在2至12范围内的pH下，天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率小于9000μS/cm。更优选地，在2.5至11.5范围内的pH下，天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率小于4000μS/cm。为了进行比较，5g/L氯化钠水溶液的电导率约为9400μS/cm。

在另一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物的植酸盐水平小于0.4重量％，优选小于0.25重量％，更优选小于0.15重量％。

在又一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物的蛋白质含量以干重计为至少90重量％(计算为凯氏定氮×6.25)，更优选至少94重量％，最优选至少96重量％，特别是至少98重量％。

优选地，天然油菜籽蛋白质分离物基本上未水解。基本上未水解是指蛋白质没有被故意水解。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含至少0.1重量％，更优选至少0.5重量％，最优选至少1重量％的根据本发明的油菜籽分离物，所述组合物的甜度评分相对于包含0重量％的本发明的油菜籽分离物的组合物在统计学上显著增加。

在本发明的第二方面，提供了一种用于获得根据本发明的第一方面的天然油菜籽蛋白质分离物的方法，该方法包括以下步骤：

i)在45℃至65℃的温度下将冷榨油菜籽油粕与水性液体混合；

ii)从步骤i)中获得的混合物中分离所述水性液体；

iii)使步骤ii)中获得的所述水性液体脱脂(decreaming)；

iv)通过添加酸或碱将步骤iii)中获得的经脱脂的水性液体的pH调节至中性，并与沉淀剂混合以获得沉淀物，其中所述沉淀剂包括镁、锌、铁或钙的盐；

v)去除在步骤iv)中获得的所述沉淀物以获得水性液体；

vi)浓缩并洗涤在步骤v)中获得的所述水性液体；

vii)使步骤vi)中获得的经浓缩并洗涤的水性液体在截止值>50kDa的膜上过滤；

viii)使步骤vii)中获得的渗透物在截止值为5kDa至50kDa的膜上过滤；

ix)通过干燥的方式，从步骤vi)中获得的经浓缩并洗涤的水性渗余物中分离天然油菜籽蛋白质分离物，

其中，在步骤i)或ii)或iii)或iv)或v)或vi)中的任何一个之前、期间或之后加入抗坏血酸或其衍生物和亚硫酸盐。

如上所述，油菜籽蛋白质分离物是从经冷榨的油菜籽压榨粕(油菜籽油生产的副产品)产生的。

该过程从萃取步骤i)开始，其中油菜籽粕与盐水溶液(例如0至5％的氯化钠)在4℃至75℃，更优选20℃至75℃且最优选45℃至65℃的温度下混合。优选地，在步骤i)中进行所述混合，使得所述经冷榨的油菜籽油粕与所述水性液体之间的比例为1:2至1:30(质量比)。粕与水的比率优选地在1:5至1:40的范围内，更优选地在1:5至1:20的范围内。

在5min至2小时的时间段之后，在分离步骤ii)中将富含蛋白质的溶液与不溶性物质分离。以下将富含蛋白质的溶液称为提取物。

优选地，将提取物的pH调节至中性，并且对提取物进行进一步处理以净化(clarify)物质并去除非蛋白质物质。在脱脂步骤iii)中，通过固/液分离步骤(例如过滤或离心分离)去除残留的脂肪和形成的沉淀物。优选地，步骤iii)中的脱脂通过离心方式进行。

然后在超滤/渗滤(UF/DF)步骤vi)中分离、浓缩并洗涤提取物。UF/DF步骤的目的是使油菜籽蛋白质分离物中存在的芸苔籽蛋白的相对百分比富集，从而浓缩蛋白质并且去除抗营养因子(例如酚类化合物、多酚化合物、残留的植酸盐、芥子油苷)。步骤vi)中的浓缩和洗涤优选通过超滤和渗滤进行。

在步骤vii)中，获得的溶液在截留值>50kDa的膜上进行过滤。如此获得的渗余物富含高分子量蛋白质，例如十字花科蛋白(在实施例中称为级分I)，并且渗透物富含低分子量蛋白质，例如芸苔籽蛋白。

在步骤viii)中，将步骤vii)中获得的渗透物在截留值为5至50kDa的膜上进行过滤。如此获得的渗余物富含低分子量蛋白质，例如芸苔籽蛋白。膜的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的。任选地，在步骤vii)和步骤viii)中，可以在进一步加工之前用水或水溶液洗涤渗余物。

最后，在步骤ix)中，可以将洗涤后的浓缩物在合适的干燥器中干燥，例如喷雾干燥器(单级或多级)，入口温度为150℃至200℃，出口温度为50℃至100℃，从而得到油菜籽蛋白质分离物。

在该过程中或该过程的部分过程中存在抗坏血酸或其衍生物和亚硫酸盐。因此，在步骤i)或ii)或iii)或iv)或v)或vi)中的任何一个之前、期间或之后加入抗坏血酸或其衍生物和亚硫酸盐。

在一个实施方式中，抗坏血酸或其衍生物是L-抗坏血酸或L-抗坏血酸钙或L-抗坏血酸钾或L-抗坏血酸钠。在另一个实施方式中，亚硫酸盐是亚硫酸根、亚硫酸氢根或焦亚硫酸根的铵盐或金属盐。非限制性实施例是焦亚硫酸钠或焦亚硫酸钾。

抗坏血酸或其衍生物的量可以在很宽的范围内变化。合适的实施例是其中相对于经冷榨的油菜籽油粕和水性液体的混合物，抗坏血酸的量为0.05g/kg至5g/kg，或0.25g/kg至1g/kg。相对于经冷榨的油菜籽油粕和水性液体的混合物，亚硫酸盐的量为0.01g/kg至0.5g/kg，或0.05g/kg至0.1g/kg。或者，抗坏血酸和亚硫酸盐的量以相对于组合物总重量的百分比表示。因此，对于抗坏血酸，这可以在0.005％至0.5％(w/w)，或者0.025％至0.1％(w/w)的范围内，并且对于亚硫酸盐，这可以在0.001％至0.05％(w/w)，或者0.005％至0.01％(w/w)的范围内。

有趣的是，抗坏血酸或其衍生物与亚硫酸盐的结合产生了前所未有的效果。例如，施加焦亚硫酸盐导致颜色初始去除，但是该颜色初始去除看起来并不持久，并且在长时间的温育之后，在某些情况下甚至导致更深的颜色。另一方面，施加抗坏血酸导致较小的颜色初始去除，但是该较小的颜色初始去除随着时间的推移更稳定并且最终导致显著较低的颜色值。当根据本发明将抗坏血酸和焦亚硫酸盐组合时，观察到了一种效果，其中所讨论的工艺物料流的所得颜色低于用单个组分测试的物料流的颜色。需注意的是，如在本发明的第二方面中进一步定义的，根据本发明获得的L颜色值显著高于关于现有技术油菜籽蛋白质分离物所报道的那些L颜色值。

发现与原料中存在的那些相比，最终油菜籽蛋白质分离物中的酚类化合物水平显著降低。由于酚类化合物是抗营养成分，这代表了与本发明相关的一个有价值的优点。原料(即经冷榨的油菜籽粕)中的酚类化合物水平为10000mg/kg至20000mg/kg，例如为17000mg/kg至17600mg/kg。在没有抗坏血酸或其衍生物的情况下，用亚硫酸盐处理这种经冷榨的油菜籽粕会使酚类化合物含量降低到3500mg/kg至10000mg/kg，例如降低至3500mg/kg至7400mg/kg。然而，按照本发明的方法，使用抗坏血酸或其衍生物和亚硫酸盐导致酚类化合物的水平仍然较低，低于上述第一方面所述的3500mg/kg。

在一个实施方式中，方法步骤i)-vi)在1-8h内，优选在3-5h内进行，在此时段期间观察到了与未处理对照的最大差异。在另一个实施方式中，在少于4小时，优选在30分钟至3.5小时的条件下执行方法步骤i)-vi)，在此条件下，提取物的颜色(以100-L表示)以及因此最终产品的颜色远低于未经处理的提取物，而且也低于仅用抗坏血酸或亚硫酸盐处理过的提取物。

第一方面的方法的优点在于，没有观察到感兴趣的蛋白质(特别是十字花科蛋白和芸苔籽蛋白)显著降低。对于已知易于降解的芸苔籽蛋白来说，这尤其令人惊讶。在上述条件下，芸苔籽蛋白浓度保持在大于对照的初始芸苔籽蛋白浓度的95％。

第一方面的方法的另一个优点是，在该过程中获得的油菜籽蛋白质分离物的未处理的透明溶液随着时间的流逝易于形成深色沉淀物，而在本发明方法期间获得的样品则不会发生这种沉淀。

本发明的方法的特征在于它非常适合于大规模应用。因此，在一个实施方式中，该方法以至少500kg，优选500kg至10000kg或1000kg至5000kg的规模进行。

优选地，以芸苔籽蛋白的水平高于十字花科蛋白的水平的方法获得油菜籽蛋白质分离物(即，天然油菜籽蛋白质分离物包含60重量％至100重量％的芸苔籽蛋白)。

已经发现，如本发明的第二方面所述，从经冷榨的油种子粕中获得并在温和条件下萃取的包含60重量％至100重量％的芸苔籽蛋白的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物具有令人惊讶的甜味。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物包含60重量％至100重量％的芸苔籽蛋白。本文公开的天然油菜籽蛋白质分离物的甜度高于其他蛋白质分离物(豌豆、大米、大豆和乳清)的甜度(在某些条件下，甚至高2-3倍)。

在本发明的第三方面，提供了天然油菜籽蛋白质分离物增加食品甜度的用途。

在一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物用于增加食品的甜度和蛋白质水平。

在另一个实施方式中，用于增加食品的甜度或甜度和蛋白质水平的天然油菜籽蛋白质分离物作为根据本发明第一方面的油菜籽蛋白质分离物的一部分施用。

在又一个实施方案中，本发明提供了天然油菜籽蛋白质分离物减少食品中(添加的)糖和/或(添加的)蔗糖的量的用途。

在一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物是芸苔籽蛋白。

因此，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物可用于食品和膳食补充剂，例如冰淇淋、奶粉、饮料、巧克力、果汁、酸奶、乳制品、烘焙食品、谷类食品、保健品条(health bar)、糖果产品和乳剂，例如蛋黄酱和沙拉酱。食品还可以包含其他成分，例如食品淀粉、增甜剂、香料、调味料(包括盐)、食品块(food pieces)、稳定剂、抗氧化剂、甾醇、可溶性纤维、树胶、风味剂(flavorings)、防腐剂、着色剂和它们的任何组合。

在一个实施方式中，通过本发明的天然油菜籽蛋白质分离物增甜的本食品和膳食补充剂具有的甜度等于蔗糖的添加量大于0.5重量％，大于1重量％，大于2重量％，大于3重量％，大于4重量％或大于5重量％，例如0.5重量％至15重量％，或5至10重量％，或10重量％至15重量％的类似增甜的食品和膳食补充剂的甜度。

在一个实施方式中，一种或多种其他增甜剂可以包含在本食品和膳食补充剂中，例如蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甜菊糖苷(如莱鲍迪甙M、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙A或甜叶菊提取物)、罗汉果苷或罗汉果提取物、奇异果甜蛋白质、巴西甜蛋白质、马槟榔蛋白质、应乐果甜蛋白质、莫纳甜(monatin)、喷塔汀、米拉克林(miraculin)、仙茅蛋白质、neoculin、新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)、叶甘素(phyllodulcin)、甘草酸及其盐、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、埃利坦(alitame)、阿斯巴甜、甜蜜素、赤藓糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、肌醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、甘油、半乳糖醇、氢化异麦芽酮糖醇、还原异麦芽酮糖醇-寡糖、还原木糖-寡糖(reduced xylo-oligosaccharides)、还原龙胆-寡糖(reduced gentio-oligosaccharides)、还原麦芽糖浆、还原葡萄糖浆、纽甜、糖精、塔格糖、曲二糖、阿洛糖(allose)、阿洛酮糖(allulose)、阿洛酮糖(psicose)、帕拉金糖、甘露糖、山梨糖、菊粉或低聚果糖。

在另一个实施方式中，在通过本发明的天然油菜籽蛋白质分离物增甜的本发明的食品和膳食补充剂中，可以减少蔗糖的添加量，同时保持食品和膳食补充剂具有所需感官特性，用量为0.5重量％至至少10重量％，例如1重量％至5重量％。

在又一个实施方案中，通过添加本发明的天然油菜籽蛋白质分离物实现的增甜在保持食品和膳食补充剂具有期望的感官特性的同时导致添加糖的总量减少至少25％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少75％，再更优选100％。通过本发明的天然油菜籽蛋白质分离物增甜的本食品和膳食补充剂包含的添加的蔗糖总量小于10重量％，更优选小于8重量％，更优选小于8重量％，更优选小于5重量％(wt)，甚至更优选小于2重量％(wt)，最优选为0-1重量％。

在一个实施方式中，对于某些食品应用，期望在保持风味的同时增加蛋白质含量。例如，在US 4,493,853中，描述了一种巧克力产品，该巧克力产品通过添加加工的奶酪而具有增加的蛋白质含量。尽管这种方法有几个缺点，例如使用了相对大量的昂贵加工奶酪，但是显然存在增加巧克力中蛋白质含量的需求。类似地，基于植物的蛋白质条如今越来越受欢迎，并且可获得几种具有约20％的基于植物的蛋白质含量的蛋白质条。这样的蛋白质条由例如坚果、坚果黄油、南瓜籽、香豌豆和大米等的成分制成，并且任选地蘸上并浇上巧克力。这些蛋白质条旨在作为持续有益健康的蛋白质零食以提供持久的能量和饱腹感。

本发明的天然油菜籽蛋白质分离物可以在食品(如蛋白质条、巧克力等)中用作蛋白质添加剂。

在一个实施方式中，通过本发明的天然油菜籽蛋白质分离物增甜的本食品和膳食补充剂可包含0.01重量％至10重量％，优选0.1重量％至5重量％，更优选0.5重量％至4重量％，例如1重量％、2重量％或3重量％的本发明的天然油菜籽蛋白质分离物。

在一个实施方式中，通过本发明的天然油菜籽蛋白质分离物增甜的本食品和膳食补充剂可包含0.01重量％至10重量％，优选0.1重量％至5重量％，更优选0.5重量％至4重量％，例如1重量％、2重量％或3重量％的芸苔籽蛋白。

在本发明的第四方面，提供了包含根据本发明的油菜籽蛋白质分离物的食品。合适的实施例是蛋白质条和/或巧克力、饮料或基于牛奶的粉末(例如应用于咖啡机中)。

下面描述本发明的非限制性实施例。

实施例

测试方法

蛋白质含量

通过凯氏定氮法来确定蛋白质含量(重量％)，AOAC官方方法991.20牛奶中的氮(总量)，使用转换系数6.25。

使用紫外分光光度计进行颜色测量

使用具有96孔板的紫外分光光度计(TECAN Infinite M1000 Pro酶标仪)测定颜色值。每孔的样品体积为275μl。通过过滤(0.45μm)使样品澄清，然后进行吸光度测量。

使用DIN 5033第3部分和DIN 6174中所述的公式将在400-700nm(10nm间隔，经空白(MilliQ水)校正的)处测得的吸光度转换为L值。为了计算L，使用照明体D65和观测角为10°的“CIE 1964补充标准比色观测器”标准光谱函数。为了比较不同样品之间的100-L，使用外推的100-L值，因为L(或100-L)与样品浓度没有线性关系。

在相等的pH下从工艺中物料流采集样品，不进行进一步稀释。

使用Hunterlab分光光度计进行颜色测量

使用Hunterlab分光光度计，将颜色定义为三维空间中的固定点。测得的参数是L、a和b值。

L值：样品中白色饱和度的量：值100是白色，值0是黑色

a值：从绿色变为红色的颜色饱和度：正值是红色饱和度，负值是绿色饱和度

b值：从黄色变为蓝色的颜色饱和度：正值是黄色饱和度，负值是蓝色饱和度

Yl E313：泛黄指数(ASTM E313)；用于表示样品泛黄的数学计算：值越高，样品越黄

为了限定在脱色之后获得的白度，优选使用测得的L值。

酚类化合物含量

油菜籽蛋白质分离物样品中的酚类化合物的分析是基于Narvaez-Cuenca C-E.,Journal of Agricultural and Food Chemistry(2011)59(10247-10255)中描述的马铃薯酚类化合物的分析。

仪器：Acquity UPLC(Waters)，由泵、进样器、样品管理器和柱箱组成

Acquity PDA检测器(Waters)

5417C离心机(Eppendorf)

天平(Mettler PM480 Deltarange)

预处理标准品：称重约10mg的芥子酸标准品(Aldrich)，使其精确到0.01mg的重量，并溶于50.0mL的甲醇(50％)和乙酸(0.5％)的水溶液中。

预处理油菜籽蛋白质分离物样品：在50mL Greiner管中称重约1g样品，并且用9mL的甲醇(50％)和醋酸(0.5％)的水溶液稀释。将样品以2000转/分钟摇动约60分钟，并且保持在4℃过夜，然后将样品离心(4500转/分钟，10分钟，4℃)。将1mL上清液转移至2mLEppendorf管中，并再次离心(14000转/分钟，10分钟，4℃)。在上述HPLC程序中分析0.5mL上清液。

将溶液注入液相色谱仪，并借助积分仪测量峰面积。芥子酸的预计保留时间为约12分钟。

使用Chromeleon、Empower或Excel计算校准曲线，并且将斜率用于以下计算。

按照以下方式计算芥子酸浓度：

按照以下方式计算酚类化合物总浓度：

电导率

使用以下电导率仪测量天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率：Hach senslON+EC71。

溶解度检测

下面的溶解度检测改编自Morr等人(J.Food Sci.(1985)50,1715-1718)，区别在于使用水代替0.1M氯化钠。

将足以提供0.8g蛋白质的蛋白质粉末称量到烧杯中。将少量的脱矿质水添加到该粉末中，并搅拌混合物直至形成光滑的糊状物。然后添加额外的脱矿质水以使总重量为40g(得到2重量％的蛋白质分散液)。使用磁力搅拌器将分散体缓慢搅拌至少30min。之后，测定pH并用氢氧化钠或盐酸将pH并调节至所需水平(2、3、4等)。测量分散体的pH并在60分钟搅拌期间定期校正。搅拌60分钟后，将等分的蛋白质分散体保留用于蛋白质含量测定(凯氏定氮分析)。将另一部分样品以20000g离心2分钟。离心后分离上清液和沉淀。还通过凯氏定氮分析来测定蛋白质含量。蛋白质溶解度(％)＝(上清液中的蛋白质/总分散体中的蛋白质)×100。

用于测定溶解度的替代方法是可用的，并且在一些情况下使用缓冲液，如WO2011/057408中的硼酸盐-磷酸盐缓冲液。然而，此类值不能与在本申请中在不存在缓冲液的情况下测定获得的值相比。

通过蓝色非变性PAGE测定分子量

在非变性PAGE的情况下，蛋白质电荷会影响电泳迁移率。在蓝色非变性PAGE(并且与透明非变性PAGE相反)的情况下，考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供进行电泳分离所需的电荷。

蛋白质溶解在500mM氯化钠中。由于高盐浓度与电泳分离不相容，因此将样品用水稀释10倍(最终盐浓度：50mM)。使用G-250(SimplyBlue^TM，ThermoFischerScientific)，并用ExQuest^TM Spot Cutter(BioRad)扫描凝胶。观察在进行蓝色非变性PAGE后的所得条带。可以预期，约14kDa的条带表示2S，约150kDa的条带表示7S，并且约300kDa的条带表示12S。

十字花科蛋白/芸苔籽蛋白(C/N)比率

通过尺寸排阻色谱(SEC)分析确定C/N比率。将样品溶解在500mM氯化钠盐溶液中，并使用与流动相相同的溶液通过HP-SEC进行分析。通过测量280nm处的紫外吸光度进行检测。将十字花科蛋白和芸苔籽蛋白的相对贡献(％)计算为每种蛋白质的峰面积相对于两个峰面积之和的比率。

植酸盐水平

根据Ellis等人的方法(Anal.Biochem.(1977)77,536-539)，使用QD495方法在Eurofins测量植酸盐。

比较例1：

从经冷榨的油菜籽油籽粕中制备天然油菜籽蛋白质分离物

油菜籽蛋白质分离物是由油含量(以干物质计)低于15％的经冷榨的油菜籽油籽粕制成的，经过清洗并在低于75℃下进行处理。经冷榨的油菜籽油籽粕中的酚类化合物含量为17000-17600mg/kg。

在萃取步骤中，将经冷榨的油菜籽油籽粕与盐水溶液(1-5％氯化钠)在40-75℃的温度下混合。油籽粕与盐水溶液的比例为1:5至1:20。在约30分钟至1小时后，将富含蛋白质的溶液(提取物)与不溶性物质分离。将提取物的pH调节至中性，并对该提取物进行进一步加工以净化物质并去除非蛋白质物质。在脱脂步骤中，使用离心去除残留的脂肪。在使植酸根沉淀的盐(例如氯化钙)存在下，通过将材料的pH值调节至中性来去除非蛋白质物质。通过固/液分离步骤(例如膜压滤器或离心)去除形成的沉淀物，在该固/液分离步骤中将杂质以固体盐形式(例如植酸钙)去除。然后在超滤/渗滤(UF/DF)步骤中将提取物浓缩并洗涤。最后，将经洗涤的浓缩物在喷雾干燥器中使用在150℃至200℃范围内的入口温度和在50℃至100℃范围内的出口温度干燥，从而产生油菜籽蛋白质分离物。制备并测试几个批次。

在2.5至11.5范围内的pH下，所得的天然油菜籽蛋白质分离物在2％溶液中的电导率小于4000μS/cm。

蓝色非变性PAGE：在242和480kDa MW标记之间观察到大约300kDa的主条带。一些染色可见为拖尾，是较低分子量(150kDa及以下)。在150kDa处未观察到清晰的条带。基于这些结果，油菜籽产品包含12S形式的十字花科蛋白。所得的天然油菜籽蛋白质分离物包含在40％至65％范围内的十字花科蛋白和35％至60％范围内的芸苔籽蛋白。

所得的天然油菜籽蛋白质分离物含有少于0.26重量％的植酸盐，并且酚类化合物的量为3500-7400mg/kg。

当在23±2℃的温度下在3至10的pH范围内测量时，所得的天然油菜籽蛋白质分离物具有至少88％的溶解度，如下表中的两批所示。

实施例1

在L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠存在下从经冷榨的油菜籽油籽粕制备油菜籽蛋白质分离物

在pH 5.9下采用不同提取液浓度的以下添加剂以七种不同的方式重复如在比较例1中所述的工序：

I.无(对照)

II.L-抗坏血酸(0.5g/kg)

III.焦亚硫酸钠(0.1g/kg)

IV.L-抗坏血酸(0.5g/kg)+焦亚硫酸钠(0.1g/kg)

V.L-抗坏血酸(0.5g/kg)+焦亚硫酸钠(0.05g/kg)

VI.L-抗坏血酸(0.25g/kg)+焦亚硫酸钠(0.1g/kg)

VII.L-抗坏血酸(0.25g/kg)+焦亚硫酸钠(0.05g/kg)

L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠的每种组合的执行次数如下表所示：

在通过固/液分离步骤进行沉淀物去除之后并且在浓缩和洗涤之前，在振荡水浴中(56℃；100rpm；0-3h)中在50ml Greiner管(密闭盖)中执行孵育。在t＝0小时，t＝1.5小时和t＝3小时的时候，从温育管中采集用于HP-SEC和颜色分析的样品。在t＝3h时，将样品冷冻贮存(-20℃)。在贮存10周后，通过将样品解冻和离心(10000g；5min)并如上所述继续培养来继续进行实验。每约2h采集一次样品进行颜色分析。图1中给出了使用上述方法和紫外分光光度计进行颜色测量的结果。

在t＝0小时，t＝1.5小时和t＝3小时的时候下，在没有(对照)或具有L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠的经净化的提取物温育过程中，测定芸苔籽蛋白的产量(％)。将在t＝0小时时对照的芸苔籽蛋白浓度设定为100％，[芸苔籽蛋白]_t＝0小时＝7.55mg/g。参见下表：

添加剂	t＝0小时	t＝1.5小时	t＝3小时
				无	100	100	100
L-抗坏血酸，0.5g/kg	102	102	102
				焦亚硫酸钠(0.1g/kg)	100	100	99
L-抗坏血酸(0.25g/kg)+焦亚硫酸钠(0.05g/kg)	99	98	99
				L-抗坏血酸(0.25g/kg)+焦亚硫酸钠(0.1g/kg)	100	97	98
L-抗坏血酸(0.5g/kg)+焦亚硫酸钠(0.05g/kg)	97	99	100
				L-抗坏血酸(0.5g/kg)+焦亚硫酸钠(0.1g/kg)	101	99	98

对于中心点(L-抗坏血酸(0.25g/kg)加上焦亚硫酸钠(0.05g/kg))获得的颜色分析的标准偏差、十字花科蛋白、芸苔籽蛋白和十字花科蛋白/芸苔籽蛋白比值如下：

关于颜色，观察到焦亚硫酸钠导致了颜色初始去除(即，较低的100-L值)，该颜色的初始去除随着时间的推移不是持久的，事实上在9小时温育后100-L超过了未处理的对照的100-L。对于L-抗坏血酸，观察到了较小的颜色初始去除，然而该效果随着时间的推移更加稳定并且最终导致100-L值显著低于对照的100-L值。当将L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠组合时，观察到了另外的效果。这适用于前三个小时期间的所有测试组合，即L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)、L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kgkg)、L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)和L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kg)，持续3小时。对于其中L-抗坏血酸为至少0.5g/kg和/或焦亚硫酸钠为至少0.1g/kg的组合，在随后的7小时期间也观察到了效果。通常，在3-5h的温育之间，在对照与用L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠两者处理的提取物之间的相对颜色差异是最大的(约50％)。

对于芸苔籽蛋白，针对对照和任何测试浓度的L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠均未观察到明显的产率下降，在前三小时的温育内均保持为远高于对照的初始芸苔籽蛋白浓度的95％。

实施例2

在L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠存在下从经冷榨的油菜籽油籽粕制备油菜籽蛋白质分离物

在一系列制备物中，以试验厂规模重复比较例1中所述的工序，其中在提取步骤期间添加L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠(下表中的百分比为相对于油菜籽油籽粕和盐水溶液的混合物的重量)。用Hunterlab分光光度计使用上述方法测定两批干燥产物的颜色。在pH 6下在0.2M磷酸盐缓冲液中制备1％的溶液。在测量之前，将样品在0.45μm的过滤器上过滤以去除颗粒(如果存在)。测量值如下：

#	L-抗坏血酸(％)	焦亚硫酸钠(％)	L	a	B	Yl E313
							1	0	0	87.33	-2.64	22.13	44.72
2	0	0	87.98	-3.36	24.15	48.03
							3	0.044	0.006	91.08	-4.74	22.41	41.79
4	0.044	0.006	89.45	-4.34	22.72	43.51
							5	0.044	0.006	88.69	-4.65	23.81	45.90
6	0.044	0.006	89.13	-4.69	24.54	47.16
							7	0.044	0.006	89.66	-4.93	24.09	45.78
8	0.088	0.0082	92.87	-5.86	24.25	43.79
							9	0.088	0.0082	93.43	-8.7	32.13	56.95
10	0.088	0.0082	92.38	-8.58	33.57	60.57
							11	0.088	0.0082	93.32	-5.78	23.8	42.75

用L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠处理过的样品的酚类化合物含量为2000-3000mg/kg。

实施例3

甜的天然油菜籽蛋白质分离物的制备

在55℃的8L饮用水中制成2％的氯化钠溶液。将该溶液用顶置式搅拌器充分混合，并使用连接至水浴的双层夹套容器保持温度。缓慢加入实施例2的干燥的天然油菜籽蛋白质分离物(152g样品，其中使用0.088％的L-抗坏血酸和0.0082％的焦亚硫酸钠)，并混合1小时以建立完全增溶。使用盖子使蒸发最小化。使用JM Separation F-PV030 C/D的实验室规模的错流系统，将获得的溶液在两个膜上进行浓缩/渗滤。

为了获得天然油菜籽蛋白质分离物级分I(>50kDa)，在Millipore的50kDa PESCDUF006TQ膜上将溶液浓缩3.6-4倍(采用的条件：以55℃/错流340至360L/h/TMP<1.5巴)并用10体积的饮用水渗滤(与浓缩的条件类似)。将渗余物尽可能地浓缩(直到系统的空隙体积)，然后用3体积的饮用水渗滤(与浓缩的条件类似)。排出渗余物，并且用400mL至450mL水洗涤系统以获得更多产物。将渗余物和洗涤液合并(天然油菜籽蛋白质分离物级分I)，并在冻干瓶中冷冻过夜(-20℃)。收集渗透物和各种渗滤液，并在4至6℃下储存过夜。

为了获得天然油菜籽蛋白质分离物级分II(5至50kDa)，在5kDa的再生纤维素膜(Millipore CDUF006LC膜)上将合并的渗透液和渗滤液浓缩21倍(采用条件：55℃/错流340至360L/h/TMP<3.5巴)。随后将获得的渗余物用10体积的饮用水渗滤(采用条件：55℃/错流340至360L/h/TMP<3.5巴)。将渗余物尽可能地浓缩(直到系统的空隙体积)，然后用3体积的饮用水渗滤(与浓缩的条件类似)。排出渗余物，并且用400mL至450mL水洗涤系统以获得更多产物。将渗余物和洗涤液合并(天然油菜籽蛋白质分离物级分II)，并在冻干瓶中冷冻过夜(-20℃)。

用SalmenKipp Christ Freeze Dryer D-DV007(Beta 2-8LD plus)进行冷冻干燥。凝冰器设定点为-90℃，真空设定点为0.0055毫巴。将冷冻的样品连接至冷冻干燥器，并在约1.5周内将样品进行干燥。

芸苔籽蛋白和十字花科蛋白的组成测定为如下表所示。可以看出，级分II含有高度纯化的芸苔籽蛋白。

实施例4

甜度比较

食品成分的甜度特性可以通过比较水溶液来评估。在此，在室温下制备由比较例1和实施例3中获得的材料制成的2％水溶液。八人对蛋白质溶液进行评估，将三种溶液进行比较，并根据甜度对它们进行排名，如下表所示。

代码	2％水溶液	甜度的感官描述
			A	(比较例1的)天然油菜籽蛋白质分离物样品1	微甜；不如C甜
B	级分I(实施例3)	不甜
			C	级分II(实施例3)	甜；明显比A甜

实施例5

甜度的测定

食品成分的风味特征可以由感官专家使用本领域已知的技术来评估。这里，考虑到良好感官规范(Good Sensory Practices)，受过甜度测定训练的小组(n＝5)评估本发明的天然油菜籽蛋白质分离物。

制备实施例3的级分II的2％天然油菜籽蛋白质分离物溶液，并在室温下提供给小组成员。制备了五种蔗糖溶液(1.5％，2％，3％，4％和5％)并进行了编码，以使小组成员不受影响。这些参考产品逐个以不同的随机顺序分给小组成员个人。将产物施用在白色聚苯乙烯杯中。指示小组成员首先饮用参考杯，然后饮用天然油菜籽蛋白质分离物溶液II，并确定后者是否不如参考甜或与参考同样甜或比参考更甜。在两次测定之间，小组成员用普通饼干、碳酸水和白开水使口腔中立化。

从下表中的数据中可以得出，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的甜度等效因子为1.5至2；即2重量％的水溶液提供与30至40g/L蔗糖相似的甜度。

表对本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的2％水溶液与参考蔗糖溶液的甜度进行评分的小组成员人数(n＝5)

	级分II少甜	级分II具有相似的甜味	级分II更甜
				蔗糖1.5％	0	0	5
蔗糖2％	0	0	5
				蔗糖3％	1	2	2
蔗糖4％	4	0	1
				蔗糖5％	5	0	0

实施例6

将增甜的杏仁奶强化至与牛奶相当的蛋白质水平

作为参考，制备了添加3重量％乳清蛋白质分离物和3重量％糖的未增甜杏仁奶(3％的糖是商售的增甜杏仁奶中的常规糖含量)。普通杏仁奶含0.5％的蛋白质，通过添加额外3％的蛋白质，总蛋白质含量为3.5％，与普通牛奶相当。

从未增甜的杏仁奶开始，添加3重量％的实施例3的级分II和x％的糖(x＝1重量％，1.5重量％，2重量％和2.5重量％)，制备了一系列产品(导致总共3.5％的蛋白质，与参考产品中类似)。发现添加3重量％的实施例3的级分II和1.5％至2％的糖的未增甜的杏仁奶的甜度提供了与参考类似的甜度。

在该实例中，当用本发明的天然油菜籽蛋白质分离物强化杏仁乳至与牛奶相当的蛋白质水平时，可以减少33％至50％的总加糖量。

实施例7

用天然油菜籽蛋白质分离物对杏仁奶增甜

作为测试产品，制备了添加3重量％的实施例3的级分II的未增甜的杏仁奶。将该食品的甜度与一系列产品进行比较，从添加x％糖(x＝2％，2.5％，3％，3.5％和4％)的未增甜杏仁奶开始。

发现测试产品与添加本发明的3％天然油菜籽蛋白质分离物的未增甜杏仁奶的甜度提供了与添加有3.5％至4％蔗糖的未增甜的杏仁奶相似的甜度。

在此实例中，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物的甜度等效因子为1.2至1.3；即，30g/L的本发明的天然油菜籽蛋白质分离物提供与食品中30-40g/L的蔗糖相似的甜度。同时，添加的天然油菜籽蛋白质分离物使杏仁奶强化到牛奶的蛋白质水平。