阅读说明：本技术 一种circRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带的制备方法及其肿瘤应用 (Preparation method of circRNA-driven DNA nanobelt based on long-chain DNA scaffold and tumor application thereof ) 是由 项阳 焦瑾 李根喜 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种circRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带的制备方法及其肿瘤应用,包括如下步骤：(1)设计一个环状DNA模板,该模板上含有发夹探针H<Sub>1</Sub>和发夹探针H<Sub>2</Sub>两种安装位点,以及可以特异性识别靶标BSJ位点的序列片段；(2)以该环状DNA为模板；(3)将发夹探针H<Sub>1</Sub>和发夹探针H<Sub>2</Sub>通过自组装结合在长链DNA上,所述的发夹探针H<Sub>2</Sub>包含荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1,(4)最终合成了一种BSJ位点驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带。本发明的DNA纳米带可以特异性的识别目标circRNA,用于复杂生物样品中circRNA的直接分析。(The invention discloses a preparation method of a circRNA-driven DNA nanobelt based on a long-chain DNA support and tumor application thereof, which comprises the following steps: (1) designing a circular DNA template containing hairpin probe H 1 Hairpin probe H 2 Two mounting sites, and a sequence segment capable of specifically recognizing a target BSJ site; (2) using the circular DNA as a template; (3) hairpin probe H 1 Hairpin probe H 2 Binding on long-chain DNA by self-assembly, the hairpin probe H 2 Containing a fluorescent group HEX and a quenching group BHQ1, (4) finally synthesizing a DNA nano-belt driven by a BSJ locus and based on a long-chain DNA scaffold. The DNA nanobelt can specifically recognize target circRNA and is used for direct analysis of the circRNA in a complex biological sample.)

一种circRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带的制备方 法及其肿瘤应用

技术领域

本发明涉及生物分析化学领域，尤其涉及一种基于RCA产物长链为支架的并由环状RNA(circular RNA，circRNA)驱动长链上发生级联杂交扩增的DNA 纳米带的构建及应用，具体为构建一种新型的DNA纳米探针，由circRNA驱动，实现在复杂的生物样本中对circRNA的快速直接检测与分析。

背景技术

circRNA是一种新型的非编码RNA，具有共价闭合的环状结构。研究发现， circRNA具有抗外切酶活性的特性(比线性RNA具有更高的稳定性)，常表现为组织或发育阶段特异性表达。circRNA也被认为是一种高效的天然microRNA (miRNA)海绵，大量研究表明circRNA比miRNA更适合用于肿瘤研究并充当肿瘤标志物。miRNA通过竞争性内源RNA(ceRNA)机制的吸附可能调节下游基因的表达，从而在疾病的发生发展中发挥重要的调控作用。例如， hsa_circRNA_0007874(circ-MTO1)可以通过下调miR-9的表达来抑制肝癌的进展。肝癌患者肿瘤细胞中circ-MTO1的表达量降低与患者生存率降低紧密相关，提示circ-MTO1是一个潜在的肝癌预后生物标志物。因此，建立稳健的 circRNA分析方法，对肿瘤的诊断、药效学监测和预后评价都具有重要的临床意义。

circRNA具有独特的闭环结构，与miRNAs和其它线性RNA不同，circRNA 不易通过电泳等常用的分子技术或基于聚腺苷自由RNA末端的方法与其它种类 RNA分离。因此，近年来出现的大量新颖有效分析mRNA和miRNA的方法，几乎均不适合于circRNA的分析。此外，内源性circRNA的丰度普遍较低，体液中的circRNA难以获得，对其进行分析需要从大量样品中提取和纯化 circRNA，这部分操作具有一定的难度和挑战性。例如，实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)是目前分析circRNA表达最常用的实验方法。在qPCR中，首先用RNase-R对样品进行预处理，然后提取样品中的RNA，通过反转录将 circRNA转化为线性cDNA，随后进行扩增步骤，该方法具有高实验成本和高设计复杂度的特点。此外，circRNA的逆转录酶可能会引入大量的模板转换产物和链移位，从而极易导致假阳性结果。近年来，我们也构建了一种基于RNase-R 的circRNA表达分析方法，该方法虽然在特异性circRNA的定量检测方面取得了成功，但仍存在试剂昂贵、操作复杂等缺点。特别是，繁琐的提取和纯化步骤可能会妨碍circRNA的准确定量。

因此，开发在复杂的生物样品中直接，快速，有效地分析circRNA的方法是势在必行的。

由非标准剪接事件产生circRNA的过程称为反剪接，在反剪接过程中形成了circRNA的保守域反剪接连接位点(BSJ)，circRNA的特异性分析均依赖于 BSJ位点的精准识别。非酶催化发夹组装信号放大反应(CHA)在核酸的检测和分析中具有广泛的应用。然而，在实际生物样品(如细胞内，血液和细胞裂解液)中的CHA反应的实用性仍然是有限的，部分原因是样品介质的复杂背景给游离DNA发夹的扩散带来了不可忽视的阻力。结合以上事实，我们设计了一种能被circRNA点亮的DNA纳米带(DNT)，该DNA纳米带可以特异性的识别目标circRNA，用于复杂生物样品中circRNA的直接分析。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种简单高效的分析靶标circRNA由circRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带的制备方法及其肿瘤应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种circRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带的制备方法，包括如下步骤：(1)设计一个环状DNA模板，该模板上含有发夹探针H₁和发夹探针H₂两种安装位点，以及可以特异性识别靶标BSJ位点的序列片段；

(2)以该环状DNA为模板，采用滚环扩增法RCA合成DNA长链作为DNT 的支架；

(3)将发夹探针H₁和发夹探针H₂通过自组装结合在长链DNA上，所述的发夹探针H₂包含荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1，得到可以被circRNA驱动发生发夹探针H₁和发夹探针H₂级联杂交反应的DNT；

在样品中，circRNA的BSJ位点通过特异性识别与H₁探针杂交，被打开的发夹探针H₁进而与发夹探针H₂杂交，此时circRNA被重新释放，发夹探针H₂上的荧光基团HEX远离猝灭基团恢复荧光；

(4)基于邻位效应的优势，被释放下来的靶标circRNA接着与DNT下游的发夹探针H₁和发夹探针H₂持续发生杂交置换反应，点亮整条DNT；并且一个circRNA可以持续点亮多个DNT，在20分钟内即可产生明显的荧光信号增强，从而能够在复杂基质中直接检测circRNA，通过上述的设计，最终合成了一种由 circRNA的BSJ位点驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带。

进一步地，所述的发夹探针H₁的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的发夹探针H₂的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述的RCA模板序列如SEQ ID No.2 所示。

进一步地，在步骤(1)中，首先制备环状DNA模板，混合2μL 10×T4 DNA 连接缓冲液，1μL磷酸化的100μM的线性模板和100μM的5μL连接辅助链，在65℃金属浴加热30min并缓慢降至室温，加入11μL DEPC处理水和100 U/μL的1μL T4 DNA连接酶，然后混合均匀于25℃下孵育2h，然后于65℃加热10min终止反应；接下来用外切酶Ⅰ、外切酶Ⅲ消化未形成环的线性模板链和连接辅助链，再经过PCR产物纯化试剂盒纯化获得环状DNA模板。

更进一步地，在步骤(1)中，DNA模板滚环扩增的步骤如下：在25μL的 RCA反应体系中加入1μL环状DNA模板，2.5μL 10×Phi29缓冲液，10mg/mL 的0.5μL BSA，10mM的6μLdNTPs，10nM的2.5μL连接DNA，13μL DEPC-H₂O和10U/μL的0.5μL Phi29 DNA聚合酶；将该体系于37℃下孵育 90分钟，在65℃下热处理10分钟，以停止反应，最后，用PCR产物纯化试剂盒纯化，并通过Thermo-NanoDrop 2000测定了纯化的RCA产物浓度，环状DNA 和RCA产物均于-20℃保存。

进一步地，在步骤(2)中，DNA纳米带(DNTs)包括一个长DNA单链 (RCA产物)和发夹探针H₁和发夹探针H₂；

首先，将长链DNA，H₁和H₂分别于95℃孵育5分钟，并缓慢冷却至室温，为了组装DNT，将以下物质添加到200μL离心管中：10μM的25μL H₁，10μM 的25μL H₂，0.6μM的25μL longDNA strand‘’和125μL Tris-MgCl₂缓冲液(500mM，pH＝8.0)，混合均匀后于37℃下孵育2小时，发夹探针H₁和发夹探针H₂经过自组装结合到长DNA链上以，制得DNA纳米带DNTs。

本发明所述的CircRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带在复杂生物样品中circRNA的监测中的应用。

进一步地，所述的DNA纳米带可以特异性的识别目标circRNA，用于复杂生物样品中circRNA的直接分析。

有益效果：本发明的DNA纳米带可以特异性的识别目标circRNA，用于复杂生物样品中circRNA的直接分析。

附图说明

图1为本发明的基于circRNA-BSJ驱动的用于circRNA监测的DNA纳米带(DNT)的构建及原理。

图2为本发明的A为DNT在circMTO1(10nM)存在或不存在时的荧光发射光谱；琼脂糖凝胶电泳表征DNT组装成功的过程。B为RCA过程的表征。C 为DNT体系的动力曲线图。

图3为本发明的流式细胞术和共聚焦荧光成像分析HepG2细胞中的 circMTO1。

图4为本发明的A为12中DNT的探针组合办法。B为12种DNT检测 circMTO1时的荧光强度。C为RCA时间和RCA产物浓度对信号放大效果的影响。D为在tris-HCl缓冲液、10％血清和细胞裂解液中分别检测不同浓度的 circMTO1的效果。

图5为本发明的A为加入不同浓度circMTO1后DNT体系的荧光发射光谱。 B为DNT体系在0-5nM浓度范围内荧光强度的相应拟合曲线。C为加入不同浓度circMTO1后传统CHA体系的荧光发射光谱。D为传统CHA体系在5-100nM 浓度范围内荧光强度的相应的拟合曲线。

图6为本发明的A为以miR-21(1nM)为对照，以突变探针检测circMTO1 (1nM)的DNT和CHA体系的特异性评价。B为用流式细胞仪分析HepG2， HBE和MCF-7细胞株中的circMTO1表达量。

具体实施方式

以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。

实施例1

在本发明中，我们设计和合成了一种DNA纳米带，能够直接被circRNA驱动，用于复杂生物样品中circRNA的直接监测，而不需经过RNA的提取和纯化。为达到上述目的，本发明采用如下机理：首先，设计一个环状DNA模板，该模板上含有发夹探针H1和发夹探针H2两种安装位点，以及可以特异性识别靶标 BSJ位点的序列片段。以该环状DNA为模板，采用滚环扩增法(RCA)合成 DNA长链作为DNT的支架。然后将H₁和H₂(包含荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1)探针通过自组装结合在长链DNA上，得到可以被circRNA驱动发生H1 和H2级联杂交反应的DNT。

在样品中，circRNA的BSJ位点通过特异性识别与H1探针杂交，被打开的H₁探针进而与H₂杂交，此时circRNA被重新释放，H₂上的荧光基团HEX远离猝灭基团恢复荧光。基于邻位效应的优势，被释放下来的靶标circRNA接着与DNT下游的H1和H2探针持续发生杂交置换反应，点亮整条DNT。并且一个circRNA可以持续点亮多个DNT，在20分钟内即可产生明显的荧光信号增强，从而能够在复杂基质中直接检测circRNA。通过上述的设计，最终合成了一种 BSJ位点驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带，并用于直接、快速地在复杂样品中进行circRNA分析(附图1)。

根据上述机理，本发明所涉及的这种DNA纳米带的构建和应用，其具体实施过程如下：

DNA支架长链的合成

首先制备环状DNA模板，混合2μL 10×T4 DNA连接缓冲液，1μL磷酸化的线性模板(100μM)和5μL连接辅助链(100μM)，在65℃金属浴加热30min 并缓慢降至室温。加入11μLDEPC处理水和1μL T4 DNA连接酶(100U/μL)，然后混合均匀于25℃下孵育2h，然后于65℃加热10min终止反应。接下来用外切酶Ⅰ、外切酶Ⅲ消化未形成环的线性模板链和连接辅助链，再经过PCR产物纯化试剂盒纯化获得环状DNA模板。滚环扩增的步骤如下：在25μL的RCA 反应体系中加入1μL环状DNA模板，2.5μL 10×Phi29缓冲液，0.5μL BSA(10 mg/mL)，6μLdNTPs(10mM)，2.5μL连接DNA(10nM)，13μL DEPC-H₂O 和0.5μL Phi29 DNA聚合酶(10U/μL)。将该体系于37℃下孵育90分钟，在 65℃下热处理10分钟，以停止反应。最后，用PCR产物纯化试剂盒纯化，并通过Thermo-NanoDrop 2000测定了纯化的RCA产物浓度。环状DNA和RCA产物均于-20℃保存。

1、DNA纳米带的组装

DNA纳米带(DNTs)包括一个长DNA单链(RCA产物)和两种探针(H1， H2)。首先，将长链DNA，H1和H2分别于95℃孵育5分钟，并缓慢冷却至室温。为了组装DNT，将以下物质添加到200μL离心管中：25μL H1(10μM)， 25μL H2(10μM)，25μL long DNA strand(0.6μM)和125μLTris-MgCl₂缓冲液(500mM，PH＝8.0)。混合均匀后于37℃下孵育2小时，H1和H2经过自组装结合到长DNA链上以得到DNTs。

试验例1

BSJ位点驱动的DNA纳米带对circRNA的响应

均一溶液中：首先，将3μL DNT(0.6μM)，12μL circRNA和15μL Tris-MgCl₂缓冲液充分混匀，于37℃下在热循环器中孵育100分钟，然后将反应混合液转移到一个黑色384孔微量滴定板上，利用酶标仪收集550nm到650nm之间的荧光发射光谱，激发光是527nm的激发。

细胞中：实验前将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中24小时。根据先前的报道，细胞在室温下于4％(w/V)多聚甲醛中固定10分钟，然后用PBS洗涤两次。细胞固定后，用0.3％v/v Triton-X100在PBS中室温处理5min，然后用 PBS清洗两次。将细胞与靶标circRNA和0.5μL核糖核酸酶抑制剂(40U/μL) 在37℃下孵育4小时。接下来，细胞在37℃下与DNT孵育2小时，然后用PBS 清洗。最后，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后，于荧光显微镜下成像。发明中用到的详细DNA和RNA序列如表1所示：

表1

试验例2

DNT体外组装表征于可行性分析

通过将RCA的产物和H₁，H₂探针自组装得到DNTs，并利用琼脂糖凝胶电泳表征DNT的组装成功，结果显示在DNA长链支架存在时只有极少量的H1， H2探针迁移到胶的底部，表明大部分探针已成功地组装在DNA支架上。在靶标circMTO1存在时，我们分别检测了传统的CHA系统和DNT系统对circMTO1 的响应。结果中可以看出孵育3h后，DNT系统的荧光强度约为传统CHA的3 倍，说明DNT系统具有较高的信号放大能力和灵敏度。此外，我们还研究了DNT和CHA体系在37℃下的反应效率。在circRNA存在下，DNT体系在60 分钟内达到信号最大生成，而CHA体系在200分钟达到平衡。理论分析与荧光测量结果一致，证明了使用DNA纳米带检测circRNA的快速性和有效性(附图 2)。

试验例3

复杂生物样本中DNT体系对circMTO1的分析

将HepG2细胞与DNTs孵育后，用流式细胞仪对单个细胞的荧光进行定量，并用荧光显微镜成像进行观察细胞内的circMTO1。数据和荧光分析结果表明， DNT系统与CHA系统相比，细胞平均荧光强度有显著提高。然后，用DNT体系检测了不同浓度的circMTO1在tirs-HCL、10％血清和细胞裂解液中的含量。结果表明与tris-HCl缓冲液相比，血清和细胞裂解液中的荧光强度未显示出明显的差异。综上所述，使用DNTs能够实现选择性地和灵敏地检测复杂样本中的 circRNA(附图3)。

试验例4

DNT体系分析条件的优化

首先，分别在25℃和37℃条件下，将DNTs与circMTO1共孵育90min，考察温度的影响。结果表明，37℃条件下荧光强度比25℃的高2倍，这可能是由于较高的温度加速了DNTs上H1，H2探针与靶标之间的杂交和置换效率。另外，RCA的反应时间通过改变DNT的长度，RCA产物的浓度通过改变探针的密度，两者共同影响荧光信号的放大强度。结果表明荧光强度随RCA时间从0 到40分钟而增大，超过50分钟后又随之减小。在40分钟的条件下，分析了RCA产物的浓度对DNT信号放大的影响。结果表明随RCA产物浓度从0增加到90 nm荧光强度不断增加，并在90nm时达到最高值。因此，在后续的研究中，反应温度设置为37℃，RCA时间为40min，RCA产物浓度为600nM。另一方面， DNT上H1和H2探针或H1/H2探针组的组装距离是影响系统效率的关键因素。为了证明这一点，我们准备了12个不同碱基间隔的DNT进行实验。结果显示 10nM circRNA存在时，在H1与H2相距8个碱基，H1/H2探针组相距20个碱基的情况下荧光强度最高。这可能是由于装配距离过远会影响杂交效率，而过近则会产生空间位阻效应(附图4)。

试验例5

DNTs检测circRNA的灵敏度

当用DNTs检测不同浓度的circMTO1时，结果表明随着circMTO1浓度从 0增加到100nM，观察到荧光强度显著增加。荧光强度与0-5nM范围内的 circMTO1浓度呈线性关系，相关方程为F＝1202.5x+1095(R2＝0.9958)，检测限 (LOD)约为1PM。在相同条件下，分析了传统CHA的灵敏度。结果表明，在100nM circMTO1存在时，DNTs体系荧光强度约是CHA体系的37倍。传统CHA体系的LOD约为5nM，DNT体系比传统CHA低3个数量级。并且 DNT体系整个过程只需要小于60min的时间(附图5)。

DNTs的特异性

为了评估DNTs对circRNA检测的特异性，我们对系统进行了多种干扰实验验证，包括碱基突变探针、microRNA和circMTO1表达不同的细胞系。结果表明只有在靶标circMTO1存在时产生明显的荧光信号，而由突变探针和miR-21 引起的响应都可以忽略不计。此外，在相同的条件下，我们用CHA方法进行了测试，结果表明DNT可以更灵敏地识别单碱基突变，并且信号比CHA高约7 倍。通过流式细胞术荧光直方图可以清楚地观察到肝细胞癌细胞系(HepG2)显示低强度荧光信号。这表明HepG2中circMTO1的表达明显低于人支气管正常细胞系(HBE)和乳腺癌细胞系(MCF-7)，与文献报道一致。这些结果有力地证实了DNT的超高选择性，进一步表明了我们的发明可用于复杂生物样品中 circRNA的高特异性检测(附图6)。

结论

由于circRNAs的发现与多种疾病有关，已成为研究热点。然而，circRNA 作为一种流行的生物标志物，缺乏特异性的分析方法是临床应用的关键障碍之一。特别是复杂生物样品中低丰度的circRNA的特异性分析面临挑战。我们在这里合理设计了一种基于circRNA-BSJ的DNTs，该纳米带能够从复杂的生物样品中严格识别目标circRNA，且反应迅速有效，操作简单。与以往报道相比，该发明无需繁琐的样品提取和纯化过程(如RNA酶处理和总RNA提取)，即可实现对circRNA的高效检测。这是由于固定在长DNA链上的两个探针的邻近效应，使得级联位移反应在复杂介质中仍然有效。此外，得益于特定的BSJ识别过程，使得DNT具有高度的特异性，并且显示出单碱基识别能力。我们相信，我们的发明能够快速、特异地检测复杂样品中的circRNAs，对基础研究和临床诊断都具有重要价值。

在本发明的技术构思范围内，可以对本发明中的靶标circMTO1和DNT序列进行变换，该变换属于本发明的保护范围内。另外需要说明的是，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种circRNA驱动的基于长链DNA支架的DNA纳米带的制备方法及其肿瘤应用

<130> 2019

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Primer)

<400> 1

atatggtatg agttgccatg 20

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(cDNA)

<400> 2

ctcataccat atttttcttt cttatccgga agtttttctt tttcatggca a 51

<210> 3

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(发夹探针H1)

<400> 3

tacatgacat ctgacccaaa acaaccccac gacatctacc aacagtgggg ttgttttggg 60

tcagctcata ccatat 76

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(发夹探针H2)

<400> 4

cttatccgga aggtggggtt gttttgggtc agatgtcatg tactgaccca aaacaacccc 60

acgttggtag atgtc 75

<210> 5

<211> 318

<212> RNA

<213> 人工序列(circMTO1)

<400> 5

gucagauguc auguaauccu uccuuuggug gcaucggaaa gggacauuua augagggaag 60

uagaugccuu ggauggccug uguucucgca ucugugacca gucuggugua cauuauaaag 120

uauuaaaccg gcguaaggga ccagcugugu ggggucugag agcucagauu gauaggaaac 180

ucuauaaaca gaacaugcag aaagaaaucu ugaauacacc acugcuuacu guucaggagg 240

gagcuguaga agaucuuauu cuuacagaac cagagccuga acacacuggg aaaugccgug 300

ucaguggggu uguuuugg 318

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(miR-21)

<400> 6

uagcuuauca gacugauguu ga 22