阅读说明：本技术 一种肿瘤免疫调节剂及其用途 (Tumor immunomodulator and application thereof ) 是由 尹汉维 曾慧慧 于 2018-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于肿瘤治疗技术领域,公开了一种肿瘤免疫调节剂及其用途。所述免疫调节剂至少包括苯并异硒唑衍生物,优选包括苯并异硒唑衍生物和铂类抗癌药物,所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的摩尔比为(1～99):(1～99)。该免疫调节剂能够用于肿瘤治疗,例如早期肿瘤免疫调节和术后肿瘤复发免疫调节。BS本身具有的凋亡诱导+免疫调节的协调作用,使BS能够作为长期使用的、且使患者机体受益的术后肿瘤复发控制调节剂。进一步的,BS与顺铂联合应用则会放大该协调作用,从而使临床更多患者受益。(The invention belongs to the technical field of tumor treatment, and discloses a tumor immunomodulator and application thereof. The immunomodulator at least comprises a benzisoselenazole derivative, preferably comprises a benzisoselenazole derivative and a platinum anti-cancer drug, and the molar ratio of the benzisoselenazole derivative to the platinum anti-cancer drug is (1-99) to (1-99). The immunomodulator can be used for tumor therapy, such as early tumor immunomodulator and postoperative tumor recurrence immunomodulator. The BS has the coordination of apoptosis induction and immunoregulation, so that the BS can be used as a postoperative tumor recurrence control regulator which is used for a long time and benefits the organism of a patient. Further, the use of BS in combination with cisplatin amplifies this coordination and thereby benefits more patients clinically.)

一种肿瘤免疫调节剂及其用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种肿瘤免疫调节剂及其用途。

背景技术

肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖的现象，称为肿瘤免疫逃逸。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些“非己”细胞，抵御肿瘤的发生发展。然而，恶变细胞在某些情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤。也就是说：一方面，机体可通过天然和获得性免疫抵抗肿瘤的发生；另一方面，肿瘤细胞可通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。肿瘤的发生与否及转归如何都取决于这两方面的总体作用。肿瘤免疫逃逸机制主要有以下几个方面：一、低免疫原性；二、被识别为自体抗原；三、抗原调变作用；四、肿瘤诱导的免疫抑制作用；五、肿瘤诱导产生豁免区域。

目前肿瘤的治疗手段包括手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段，其中，手术、放疗和化疗一直是***无法撼动的三大“主角”，但手术、放疗和化疗过程，会造成机体免疫能力下降，更为严重的还会出现机体免疫抑制，使残存肿瘤细胞继续存在和进一步转移，给肿瘤患者造成致命的威胁。尤其是手术作为一种机械手段，局部治疗彻底，但癌症细胞的转移性决定了癌症发病后，就会有癌症细胞脱落，并通过局部扩散、血管、***等途径向四周及远处增殖或转移。进一步的，手术后很长一段时间内患者的自身免疫力都会处于极为薄弱的状态，无法发挥正常机体免疫能力，如何提升术后机体免疫力、稳定术后机体免疫系统，是控制术后肿瘤复发的一个难题。据我国疾病预控中心癌情监测数据显示，我国癌症患者术后3个月复发转移率为50％，6个月复发转移率高达69％，手术五年后复发或转移率高达90％以上。

进入21世纪以后，随着肿瘤学与免疫学发展不断深入，围绕人体免疫系统来***逐步被科研界与产业界所接受，而成为新药研发的热门领域。所谓肿瘤免疫治疗(Immuno-oncology，I/O)，是指在治疗过程中直接或者间接利用人体免疫系统对肿瘤患者进行有效治疗的方法。例如，通过干扰细胞过度生长、转化和转移的直接抗肿瘤作用或激活免疫系统的效应细胞及其所分泌的因子来达到对肿瘤进行杀伤或抑制的目的。

因此，研发一种能够提高机体的免疫能力，尤其是能够提高术后肿瘤机体免疫力，低毒、长期使用、且使患者机体受益的术后肿瘤复发免疫调节剂，成为亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明提供一种肿瘤免疫调节剂，所述免疫调节剂至少包括苯并异硒唑衍生物。

根据本发明，所述苯并异硒唑衍生物具有如式A所示化合物的结构，其选自式A所示化合物、其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、前药和溶剂合物中的至少一种，

其中，R₁、R₂相同或不同，彼此独立的选自H、或下列基团：C_1-12烷基、C_3-20环烷基；优选地，选自H、或下列基团：C_1-6烷基、C_3-10环烷基；示例性地，R₁、R₂选自H。

其中，R选自C_1-12亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚三苯基，或者

其中M代表Pt、Pd或Rh；优选地，R代表C_1-6亚烷基，如C_1-4亚烷基，例如R为亚丁基。

优选地，所述式A所示化合物中，R₁、R₂相同或不同，彼此独立的选自H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-C(CH₃)₃、-CH(CH₂)₄、或-CH(CH₂)₅；R选自-CH₂-、-C₂H₄-、-C₄H₈-、亚苯基-C₆H₄-。

根据本发明示例性的技术方案，所述苯并异硒唑衍生物选自1,2-二[2-(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]-丁烷(BS)，其结构如下所示：

根据本发明，所述肿瘤免疫调节剂包括苯并异硒唑衍生物和铂类抗癌药物。具体地，所述肿瘤免疫调节剂由苯并异硒唑衍生物和铂类抗癌药物适度联用，显示出免疫调节作用。

本发明，所述铂类抗癌药物选自顺铂(CDDP)、卡铂(CBP)、奥沙利铂(1-OHP)、奈达铂(CDGP)等中的至少一种；示例性地，所述铂类抗癌药物选自顺铂(CDDP)。

根据本发明，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的摩尔比为(1～99):(1～99)；例如摩尔比为(50～90):(1～30)，(60～70):(1～10)，(1～40):(1～40)，(1～25):(1～25)，(1～10):(1～10)，(1～6):(1～6)；示例性地，摩尔比为1:1、2:1(体外联用)或60:1，70:1，80:1等(体内联用)。具体地，当苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物摩尔比相差不大时，例如摩尔比(1～10):(1～10)，(1～6):(1～6)，示例性地，摩尔比为1:1、2:1时，二者联用作为免疫调节剂，优选可以施用于体外肿瘤细胞。在体内联用时，由于药物体内代谢达到肿瘤部位浓度和体内性质有很大的关系，口服苯并异硒唑衍生物用量需要远大于铂类抗癌药物(常规注射给药)用量，即当苯并异硒唑衍生物用量远大于铂类抗癌药物时，例如摩尔比为(50～90):(1～30)，(60～70):(1～10)，示例性地，摩尔比为60:1，70:1，80:1时(体内联用)，二者作为免疫调节剂，优选可以施用于体内肿瘤细胞。

优选地，所述肿瘤免疫调节剂还可任选地包含至少一种药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。

例如，所述稀释剂选自乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。例如，所述抗氧化剂选自维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。例如，所述pH调节剂选自盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。例如，所述防腐剂选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。例如，所述润滑剂选自硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

所述免疫调节剂的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

进一步的，本发明还提供上述免疫调节剂在肿瘤治疗中的应用。

优选地，以施用对象(例如小鼠)重量计，所述免疫调节剂的用量为10～500mg/kg；例如50～400mg/kg；示例性地，用量为90、180、360mg/kg。

优选地，所述免疫调节剂可以选用苯并异硒唑衍生物、以及苯并异硒唑衍生物和铂类抗癌药物联合应用。当所述免疫调节剂选用苯并异硒唑衍生物和铂类抗癌药物联合应用时，以施用对象(例如小鼠)重量计，所述铂类抗癌药物的用量为0.1～5mg/kg；例如0.5～4mg/kg、1～3mg/kg；示例性地，用量为2mg/kg。

根据本发明的一个技术方案，所述免疫调节剂用于早期肿瘤免疫调节。示例性地，所述免疫调节剂用于促使免疫器官(如脾脏、胸腺等)系数升高，促使外周血白细胞数量增多。再如，所述免疫调节剂用于抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，促进细胞因子(如IFN-γ、IL-2、TNF-α)的分泌；又如，所述免疫调节剂用于促使淋巴细胞CD₈ ⁺亚群阳性细胞百分数升高；又如，所述免疫调节剂用于促使干扰素(如颗粒酶B，Gz～B)分泌。

根据本发明另一个技术方案，所述免疫调节剂还可以用于术后肿瘤复发免疫调节。示例性地，所述肿瘤免疫调节剂用于促进免疫活性物质(如穿孔素和颗粒酶B)的分泌，提高细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的杀伤活性；又如，所述肿瘤免疫调节剂用于促进淋巴细胞增殖；又如，所述肿瘤免疫调节剂用于上调淋巴细胞表面NKG2D活化性受体的表达，优选地，上调淋巴细胞表面NKG2D配体RAE-1的表达。

根据本发明，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤，可以是良性的和恶性的。例如，所述肿瘤包括但不限于：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、***癌、骨癌、脑癌、直肠癌、食管癌、舌癌、淋巴癌、口腔上皮癌、上皮***或慢性髓系白血病。具体地，可以选用肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包括人癌细胞和小鼠癌细胞。所述人癌细胞包括但不限于：人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞Be17402、人肝癌细胞Huh7721、人结直肠癌细胞LoVo、人结直肠癌细胞RKO、人结直肠癌细胞SW480、人肺癌细胞A549、人肺癌细胞H1299、人肺癌细胞SPCA-1、人上皮***细胞HeLa、人乳腺癌细胞MCF-7、人慢性髓性白血病细胞k562、人食管癌细胞KYSE150、人食管癌细胞KYSE450或人食管癌细胞KYSE510。所述小鼠癌细胞包括但不限于：小鼠肝癌细胞H22、小鼠肝癌细胞Hepa 1-6、小鼠红白血病细胞MEL、小鼠肾癌细胞Renca、小鼠淋巴瘤细胞EL-4、小鼠肺癌细胞Lewis、小鼠乳腺癌细胞4T1。示例性地，选用小鼠肝癌细胞H22、小鼠肺癌细胞Lewis、小鼠乳腺癌细胞4T1。

进一步的，本发明还提供上述肿瘤免疫调节剂***或术后肿瘤复发的方法，将治疗有效量的所述免疫调节剂施用于有此需求的个体。

优选地，所述个体可以为哺乳动物，如人类或小鼠。

优选地，所述肿瘤具有如上文所述的含义，优选为肝癌、肺癌、乳腺癌。

本发明的有益效果是：

本发明出人意料地发现，BS毒性极低，不但可以明显改善药物带给机体的毒性损伤，还可以促使免疫器官(如脾脏、胸腺等)系数升高，促使外周血白细胞数量增多。例如，可以明显抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，促进细胞因子(如IFN-γ、IL-2、TNF-α)的分泌；可以促使细胞毒性T淋巴细胞CD₈ ⁺亚群阳性细胞百分数升高；可以促使干扰素(如颗粒酶B，Gz～B)分泌。说明BS具有免疫增强功能和减弱对机体的毒性损伤功能，作为免疫调节剂能够提高机体的细胞免疫水平，进而抑制肿瘤细胞增殖和术后肿瘤复发。

本发明还出人意料地发现，BS与铂类抗癌药物(尤其是顺铂CDDP)联用时，可以协同促进免疫活性物质(如穿孔素和颗粒酶B)的分泌，提高细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的杀伤活性；可以促进淋巴细胞增殖；可以上调淋巴细胞表面NKG2D配体RAE-1的表达。说明BS和CDDP可以协同促进免疫活性物质的分泌，作为免疫调节剂能够提高机体的免疫力，抑制肿瘤细胞增殖和术后肿瘤复发。

BS以及BS和顺铂联合使用表现的免疫调节功能对于术后肿瘤复发控制起到重要的作用。目前，术后复发控制临床上多以治疗和/或化疗药物直接杀伤肿瘤，来控制肿瘤复发，本发明出人意料地发现，BS在启动细胞凋亡杀伤肿瘤同时还表现出优异的免疫调节作用，更符合术后控制肿瘤复发治疗阶段患者身体情况，即需要调整和恢复自身的免疫功能。而目前临床进一步使用的化学杀伤药物在一定程度上会损伤机体免疫功能，出现免疫抑制反应，例如，使用铂类药物后，患者机体产生的不良反应(例如，肾脏毒性：多次高剂量和短期内重复用药，会出现不可逆的肾功能障碍；骨髓抑制：白细胞和/或血小板的减少)，进而会逐渐导致最终身体无法承受。

BS以及BS和顺铂联合表现出的对NK活性提高，对于抑制肿瘤生长将在其细胞凋亡作用基础上产生叠加药理作用功能，BS药物本身具有的凋亡诱导+免疫调节的协调作用，以及BS极低的毒性，可以明显改善长期服用带给机体的毒性损伤，使BS能够作为长期使用的、且使患者机体受益的术后肿瘤复发控制调节剂。进一步的，BS与顺铂联合应用则会放大该协调作用，从而使临床更多患者受益。

术语定义和说明

除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。

术语“C_1-12烷基”应理解为优选表示具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，优选为C_1-6烷基。“C_1-6烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5、6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5、6个碳原子(“C_1-6烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2、3或4个碳原子(“C_1-4烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或丁基。

术语“C_3-20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～20个碳原子，优选“C_3-10环烷基”。术语“C_3-10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C_3-10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。

术语“C_1-12亚烷基”应理解为优选表示丢失两个氢原子的具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，优选为C_1-4亚烷基。“C_1-4亚烷基”应理解为优选表示丢失两个氢原子的具有1、2、3、4个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述亚烷基是例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基。

术语“有效量”或者“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于如下定义的疾病治疗)的本发明所述化合物的量。治疗有效量可以取决于以下因素而改变：预期应用(体外或者体内)，或者所治疗的受试者和疾病病症如受试者的重量和年龄、疾病病症的严重性和给药方式等，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。具体剂量将取决于以下因素而改变：所选择的特定化合物、所依据的给药方案、是否与其它化合物组合给药、给药的时间安排、所给药的组织和所承载的物理递送系统。

附图说明

图1是实施例1中BS对小鼠体重和肿瘤体积的影响图；

其中，A：小鼠体重变化；B：小鼠相对体重变化。数据表示为平均值±标准差(n＝6)。

图2是实施例1中各组小鼠出瘤时间及出瘤率图。

图3是实施例1中各组小鼠肿瘤生长情况图；

其中，(a)：实验结束时各组肿瘤照片；(b)：各组小鼠肿瘤体积变化情况。。

图4是实施例1中BS对肿瘤组织细胞PD-L1表达的抑制作用图。

图5是实施例1中淋巴细胞CD4⁺、CD8⁺亚群阳性细胞百分率图；

其中，A：对照组(control)；B：BSL；C：BSM；D：BSH。

图6是实施例1中小鼠体重变化情况图；

其中，(a)：小鼠在给药过程中体重变化情况；(b)：各组小鼠给药过程中体重增长情况。

图7是实施例2中小鼠体重变化情况；

其中，(a)：小鼠在给药过程中体重变化情况；(b)：各组小鼠给药过程中体重增长情况。

图8是实施例2中小鼠体重变化情况；

其中，(a)：小鼠在给药过程中体重变化情况；(b)：各组小鼠给药过程中体重增长情况。

图9是实施例3中小鼠肿瘤组织RAE-1蛋白表达水平；

其中，(a)：小鼠肿瘤组织RAE-1表达水平；(b)：RAE-1的相对表达量。数据表示为平均值±标准差，n＝3。*P<0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实验方法：

1.试验药品、细胞及动物：

BS：化学名1,2-二[2-(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]-丁烷，参考中国专利第02158917.8号申请。

顺铂(CDDP)：购自华中海威(北京)基因科技有限公司。

鼠肝癌细胞系H22：由北京大学肿瘤防治研究所方家椿研究员馈赠。

小鼠肺癌细胞系Lewis：购自协和医科大学基础医学院。

小鼠乳腺癌细胞系4T1：购自协和医科大学基础医学院。

昆明远交系小鼠(KM小鼠)：雄性，4周，体重为18～22g，购自北京大学医学部实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(京)2012-0036。饲养环境清洁级，饲养温度25±2℃，12小时光照12小时黑暗，充足食水供应。

Balb/c小鼠：4周龄，体重16～18g，雄性(肺癌和肝癌术后复发)和雌性(乳腺癌术后复发)，购自北京大学医学部实验动物中心，实验动物生产许可证号SYXK(京)2012-0036。饲养环境清洁级，饲养温度25±2℃，12h光照12h黑暗，充足食水供应。

2.试验方法：

小鼠H22肝癌/Lewis肺癌/4T1乳腺癌移植瘤切除模型

分别取出H22(肝癌)冻存细胞/Lewis(肺癌)冻存细胞/4T1(乳腺癌)冻存细胞，37℃1-2min，变为液体后立即取出；重悬后离心，1200rpm/min离心2min后，弃上清，1mL无血清培养基重悬，腹腔注射细胞。

约一周后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，抽取腹水。先用剪刀镊子轻轻在小鼠腹腔外皮减一个小口，而后用止血钳轻轻两边拉开，使露出腹部，用注射器抽取腹水。

取Balb/c小鼠腹水，制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法计数活细胞数，细胞存活率应大于95％；将肿瘤细胞悬液注射于体重为16g-18g的雄性Balb/c小鼠右腋皮下，每只10⁶个细胞。

2.1小鼠H22肝癌移植瘤切除模型

对皮下移植鼠肝癌细胞H22的Balb/c小鼠进行了如下的局部肿瘤切除术：待小鼠右侧腋下肿瘤达到大约500mm³时，腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.08mL/10g)进行麻醉并备毛。待小鼠进入全麻状态后，在肿瘤附近剪一个1-2cm的切口，将肿瘤组织钝性剥离并切除90％，残留大概50mm³的瘤组织，最后使用无菌的医用丝线进行缝合，在伤口处涂抹碘伏进行消毒。以上操作均在超净台内完成。将小鼠安置到洁净、温暖的地方，并给予无菌的葡萄糖水供其苏醒后饮用。手术当天被认为是手术后0天。待小鼠全部苏醒后随机分为4组，每组6只，药物治疗方案如下：

空白对照组(5‰CMC-Na,i.g.,q.d.)；

BS低剂量组(90mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；

BS中剂量组(180mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；

BS高剂量组(360mg·kg^-1,i.g.,q.d.)。

实验期间隔天记录小鼠体重，肿瘤体积及活动状况。给药八天后处死小鼠，摘除眼球取血，用于血清中TrxR活性检测。迅速分离肿瘤、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏，观察并称重。肿瘤组织液氮保持，以备后续实验。

2.2小鼠Lewis肺癌移植瘤切除模型

同上，对皮下移植鼠肺癌细胞Lewis的Balb/c小鼠进行了如下的局部肿瘤切除术：待小鼠右侧腋下肿瘤达到大约500mm³时，腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.08mL/10g)进行麻醉并备毛。待小鼠进入全麻状态后，在肿瘤附近剪一个1-2cm的切口，将肿瘤组织钝性剥离并切除90％，残留大概50mm³的瘤组织，最后使用无菌的医用丝线进行缝合，在伤口处涂抹碘伏进行消毒。以上操作均在超净台内完成。将小鼠安置到洁净、温暖的地方，并给予无菌的葡萄糖水供其苏醒后饮用。手术当天被认为是手术后0天。待小鼠全部苏醒后随机分为4组，每组6只，药物治疗方案如下：

空白对照组(5‰CMC-Na,i.g.,q.d.)；

BS低剂量组(90mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；

BS中剂量组(180mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；

BS高剂量组(360mg·kg^-1,i.g.,q.d.)。

实验期间隔天记录小鼠体重，肿瘤体积及活动状况。给药八天后处死小鼠，摘除眼球取血，用于血清中TrxR活性检测。迅速分离肿瘤、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏，观察并称重。肿瘤组织液氮保持，以备后续实验。

2.3小鼠4T1乳腺癌移植瘤切除模型

同前，对皮下移植鼠乳腺癌细胞4T1的Balb/c小鼠进行了如下的局部肿瘤切除术：待小鼠右侧腋下肿瘤达到大约500mm³时，腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.08mL/10g)进行麻醉并备毛。待小鼠进入全麻状态后，在肿瘤附近剪一个1-2cm的切口，将肿瘤组织钝性剥离并切除90％，残留大概50mm³的瘤组织，最后使用无菌的医用丝线进行缝合，在伤口处涂抹碘伏进行消毒。以上操作均在超净台内完成。将小鼠安置到洁净、温暖的地方，并给予无菌的葡萄糖水供其苏醒后饮用。手术当天被认为是手术后0天。待小鼠全部苏醒后随机分为4组，每组6只，药物治疗方案如下：

空白对照组(5‰CMC-Na,i.g.,q.d.)；

BS低剂量组(90mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；

BS中剂量组(180mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；

BS高剂量组(360mg·kg^-1,i.g.,q.d.)。

实验期间隔天记录小鼠体重，肿瘤体积及活动状况。给药八天后处死小鼠，摘除眼球取血，用于血清中TrxR活性检测。迅速分离肿瘤、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏，观察并称重。肿瘤组织液氮保持，以备后续实验。

2.4 Western Blot方法：

提取组织总蛋白并测定蛋白浓度(30-50μg)加入5×上样缓冲液，以RIPA裂解液补足体积，混匀后95℃变性处理10min。充分混匀后，加入洁净的1.5mm制胶板至适当位置正丁醇进行水封。加入1mL 1×分离胶缓冲液，室温放置过夜；***1.5mm加样梳，室温静置2h等待胶凝。

拔去加样梳，常法上样；80V恒压电泳，至溴酚蓝前沿进入分离胶，将电压提高至160V继续恒压电泳，至溴酚蓝迁移接近分离胶末端时停止电泳。

精确剪取与分离胶同样大小的6张滤纸和一张0.2μm PVDF膜，将PVDF膜于甲醇中浸泡10s，去离子水中浸泡3min，电转缓冲液中浸泡3min；

电转三明治由正极到负极的顺序依次安放：一张海绵、三张滤纸、PVDF膜、分离胶、三张滤纸、一张海绵(全部预先用电转缓冲液浸泡)，每层之间用玻璃棒赶出气泡，夹好电转夹连同冰盒一起放入电转槽；

将电转槽置于冰水浴中，250mA恒流电转2h。

电转完毕后，将PVDF膜取出，置于5％封闭；TBST洗膜3次，将PVDF膜与稀释适当比例的二抗溶液一同封闭于杂交袋中，室温孵育1h，TBST洗膜3次，显影；

打开凝胶成像系统，将ECL发光液的A液和B液等体积混匀后均匀分布在PVDF膜上，进行曝光分析。

2.5 ELISA法：按照ELISA商用试剂盒说明书方法进行检测。

实施例1 BS对小鼠免疫系统的影响

采用24只体重为18-22g的正常雄性KM鼠随机分为4组，分别为BS低、中、高剂量组和对照组，每组6只动物，于接种鼠肝癌H22细胞(2×10⁶个/只)后第2天开始给药。给药剂量为：空白对照组(5‰CMC-Na,i.g.,q.d.)；BS低剂量组(90mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；BS中剂量组(180mg·kg^-1,i.g.,q.d.)；BS高剂量组(360mg·kg^-1,i.g.,q.d.)。每天观察小鼠状态，连续8天。

下文中以BSL、BSM、BSH代表BS低、中、高剂量组。

1.1 BS对小鼠体重的影响

如图1所示，图1概括了给药过程中各组小鼠体重的变化情况。与对照组相比，给药组小鼠体重未见明显差异。实验结束时，BS低、中、高剂量处理组小鼠体重分别增加到初始体重的1.11、1.10、1.12倍，说明BS对小鼠没有明显的毒副作用。

1.2 BS对小鼠出瘤时间及出瘤率的影响

每天观察小鼠状态及出瘤情况，根据Kaplan-Meier法绘制出瘤时间曲线，结果如图2所示。接种H22细胞后，第四天开始出瘤，在同等时间内给药组出瘤率明显低于对照组或与之相当，且呈剂量相关性，说明BS对小鼠肝癌H22细胞的增殖具有一定的抑制作用。各组小鼠第7天全部出瘤完毕，各组肿瘤发生率在结束时均为100％，说明BS的抑制作用在早期效果更好。组间对数秩检验P＝0.098，未见明显差异。

1.3 BS对小鼠肿瘤体积的影响

如图3所示，随着给药浓度的增加，肿瘤体积增加减少，呈现一定的剂量依赖性，在前6天，肿瘤生长趋势明显缓于对照组，有较好的肿瘤生长抑制效果，也说明了BS在肿瘤早期治疗阶段作用更为显著。

给药8天后，我们对小鼠肿瘤体积进行了统计，各组小鼠肿瘤体积见表1。BS中、高组肿瘤体积分别为388.8±69.8mm³、215.1±42.9mm³，肿瘤增殖抑制率为35.5％、64.3％，与对照组相比具有明显差异。

表1实验结束时各组小鼠肿瘤体积

数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

1.4 BS对小鼠脏器系数及血常规的影响

为考察BS对小鼠的影响，实验结束时摘取小鼠的免疫器官胸腺、脾脏以及肝、肾进行观察，称重，同时检测了外周血中白细胞、红细胞、血小板的数量，结果如表2所示。与对照组相比，BS给药组脾脏系数、胸腺系数明显升高，相应的外周血白细胞数呈明显的增高趋势，具有显著性差异(P＜0.05)，说明BS具有一定的免疫增强功能。同时小鼠肝脏系数、肾脏系数组间无明显差异，说明BS未见明显的肝肾毒性。

表2 BS对脏器系数及血常规的影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；**P＜0.01，表示与对照组相比具有统计学差异。BSL、BSM、BSH指BS低、中、高剂量组；RBC：红细胞数；WBC：白细胞数；PLT：血小板数。

1.5 BS下调小鼠肿瘤组织细胞表面PD-L1表达

检测BS是否影响小鼠的免疫系统。我们首先考察BS对小鼠肿瘤细胞表面PD-L1蛋白表达的影响，我们将肿瘤组织研磨、计数后染色，采用流式细胞仪检测肿瘤细胞表面PD-L1的变化，结果如图4所示，随着BS剂量的增高，肿瘤细胞表面PD-L1的表达量呈剂量依赖性地下降；当BS浓度达到360mg·kg^-1时，肿瘤细胞表面PD-L1的表达降低了51.41％，BS能够显著抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达。

1.6 BS对小鼠淋巴细胞CD₄ ⁺、CD₈ ⁺亚群阳性细胞百分数的影响

研究BS对脾淋巴细胞的影响，我们考察了BS处理后淋巴细胞CD₄ ⁺、CD₈ ⁺亚群阳性细胞百分率的变化。将已分离的荷瘤KM鼠脾淋巴细胞，用FITC标记的CD₄ ⁺单克隆抗体和PE标记的CD₈ ⁺单克隆抗体染色，流式细胞仪检测淋巴细胞CD₄ ⁺、CD₈ ⁺亚群阳性细胞百分率，如图5所示。

将所得结果进行统计分析，如表3所示，BSL组的脾淋巴细胞CD₄ ⁺阳性率与对照组相比有明显的提高(P＜0.01)；BSM、BSH组的脾淋巴细胞CD₈ ⁺阳性率与对照组相比有明显的提高，且随着剂量的增高，脾淋巴细胞CD₈ ⁺亚群阳性细胞含量随之增加。以上实验结果表明，BS对免疫系统的影响主要作用于CD₈ ⁺毒性T细胞，能够提高机体的细胞免疫水平。该结果也与分子水平BS对PD-L1的下调一致。

表3 BS对小鼠淋巴细胞CD4⁺、CD8⁺亚群阳性细胞百分数的影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；**P＜0.01，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P＜0.01，表示与BSL组相比具有统计学差异；^※P＜0.05，表示与BSM组有统计学差异。

1.7 BS对小鼠脾淋巴细胞活性的影响

有文献报道，当PD-L1激活时，多种细胞炎性因子的表达会降低，如IFN-γ、IL-2等。我们已经在肿瘤细胞表面观察到了PD-L1表达的下降，为了进一步确认BS是通过调控PD-L1发挥的免疫调节作用，我们提取了各组荷瘤小鼠的脾淋巴细胞，给予离子霉素和PMA各20ng·mL^-1的浓度进行刺激，观察淋巴细胞的活化情况，48h后收取上清，ELISA法考察淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌情况，结果如表4所示。

离子霉素、PMA刺激24h后，在镜下能明显观察到BS给药组脾淋巴细胞成团的数量多于对照组，成团的大小高于对照组；在刺激48h后，脾淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌量明显升高，与对照组相比具有统计学差异；且随着给药浓度的增加，细胞因子的分泌量也随之增加，呈现剂量依赖性。这说明BS能够下调肿瘤PD-L1蛋白表达，从而促进细胞因子的分泌，增强免疫作用。

表4 BS对小鼠淋巴细胞免疫因子分泌情况的影响。

注：数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P＜0.01，表示与BSL组相比具有统计学差异；^※P＜0.05，表示与BSM组有统计学差异。

BS对荷瘤KM小鼠的影响研究发现。BS，尤其是在肿瘤发生早期，能够较好的抑制肿瘤生长，且对小鼠的体重、肝脏系数、肾脏系数无明显影响，既能发挥肿瘤生长抑制作用，又未见明显的肝肾毒性及副作用。BS的肿瘤生长抑制作用同时可对肿瘤细胞表面PD-L1的发生实质影响、对小鼠淋巴细胞CD4⁺、CD8⁺亚群阳性细胞百分数的影响及PD-L1下游细胞因子分泌情况研究发现，BS能够显著下调肿瘤细胞表面PD-L1的表达，并呈现剂量依赖性；与此同时，BS中、高剂量组淋巴细胞CD8⁺亚群阳性细胞百分数也呈现升高趋势，说明PD-L1主要作用于T细胞。PD-L1下游细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌情况在BS高剂量组也呈现升高的趋势，说明BS能够通过下调肿瘤细胞表面PD-L1发挥肿瘤抑制作用，在一定程度上抑制肿瘤经由PD-L1发生的免疫逃逸，促进细胞因子的分泌，增强机体的肿瘤免疫。

实施例2 BS在术后复发模型中的免疫观察

2.1 BS对荷瘤H22小鼠体重影响

在Balb/c小鼠建立小鼠H22肝癌移植瘤切除模型中，小鼠在给药过程中的体重变化监测显示如图6所示，各给药组与对照组相比，体重没有显著性差异，均逐渐增长，第八天时低剂量给药组和高剂量给药组体重略有下降，无统计学差异。对照组，BS的低(90mg/kg)、中(180mg/kg)、高(360mg/kg)剂量给药组在第八天时体重分别增长到初始体重的1.12±0.06，1.12±0.05，1.15±0.15，1.10±0.07倍，未见显著性差异，说明BS对小鼠没有明显毒性。

2.2 BS对荷瘤H22小鼠各脏器系数的影响

实验结束后，分别摘取小鼠的肝脏，肾脏，脾脏和胸腺进行观察，称重。在解剖小鼠的过程中发现各组小鼠各脏器均正常，无坏死，肿大等器质性改变。结果如表5所示。各组小鼠的肝脏，肾脏和脾脏的脏器系数没有显著性差异。脾脏系数各剂量组相对对照组增大，但没有显著性差异。肝脏系数和肾脏系数略微减小也未见显著性差异。各剂量给药组的胸腺系数均显著性增大，具有显著性差异(P＜0.05)，显示可能具有提高荷瘤小鼠免疫力的作用，其中中剂量给药组提高免疫力的作用最大。

表5 BS对脏器系数的影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

2.3 BS对荷瘤Lewis肺癌小鼠体重影响

选择Balb/c小鼠建立小鼠Lewis肺癌移植瘤切除模型，并在手术的第二天连续给药八天后处死。小鼠在给药过程中的体重变化监测显示如图7，图7显示了小鼠在给药过程中的体重变化情况。可以观察到，各给药组与对照组相比，体重没有显著性差异，均逐渐增长,无统计学差异。对照组，BS的低、中、高剂量给药组在第八天时体重分别增长到初始体重的1.16±0.10，1.14±0.05，1.13±0.06，1.12±0.06倍，未见显著性差异，说明BS对小鼠没有明显毒性。

2.4 BS对荷瘤Lewis肺癌小鼠各脏器系数的影响

实验结束后，分别摘取小鼠的肝脏，肾脏，脾脏和胸腺进行观察，称重。在解剖小鼠的过程中发现各组小鼠各脏器均正常，无坏死，肿大等器质性改变。结果如表6所示。各组小鼠的肝脏，肾脏和脾脏的脏器系数没有显著性差异。中，高剂量给药组的胸腺系数增大，其中中等剂量给药组具有显著性差异(P＜0.05)，说明BS具有提高荷瘤小鼠免疫力的作用，其中，中剂量给药组提高免疫力的作用最大。

表6 BS对脏器系数的影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

2.5 BS对荷瘤4T1乳腺癌小鼠体重影响

选择Balb/c小鼠建立小鼠4T1乳腺癌移植瘤切除模型，并在手术的第二天连续给药八天后处死。图8显示了小鼠在给药过程中的体重变化情况。可以观察到，各给药组与对照组相比，体重没有显著性差异，均逐渐增长,无统计学差异。对照组，BS的低、中、高剂量给药组在第八天时体重分别增长到初始体重的1.14±0.04，1.15±0.03，1.13±0.02，1.10±0.02倍，未见显著性差异，说明BS对小鼠没有明显毒性。

2.6 BS对荷瘤4T1乳腺癌小鼠各脏器系数的影响

实验结束后，分别摘取小鼠的肝脏，肾脏，脾脏和胸腺进行观察，称重。在解剖小鼠的过程中发现各组小鼠各脏器均正常，无坏死，肿大等器质性改变。结果如表7所示。各剂量给药组脾脏系数和肾脏系数有所增大，但没有显著性差异。各剂量给药组的胸腺系数均显著性增大(P＜0.05)，高剂量给药组的胸腺系数最大，具有剂量依赖性。说明BS具有提高荷瘤小鼠免疫力的作用，其中高剂量给药组提高免疫力的作用最大。

表7 BS对小鼠脏器系数的影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

实施例3 BS与顺铂(CDDP)术后联合用药对免疫调节作用诱导

BS给药组(180mg/kg)：称取BS原药180mg，溶于5mL 5‰CMC-Na溶液中，制成混悬液，给药剂量为5mL/kg；

顺铂给药组(2mg/kg)：称取顺铂2mg，溶于5mL生理盐水中，制成溶液，给药剂量为5mL/kg。

联合给药组：BS(180mg/kg)和顺铂(2mg/kg)同时给药，给药剂量为5mL/kg。

选择Balb/c小鼠建立小鼠Lewis肺癌移植瘤切除模型，并在手术的第二天连续给药八天后处死，解剖小鼠，完整剥离出肿瘤，称重测量体积并进行相应分析。用于体内时，由于药物体内代谢达到肿瘤部位浓度和体内性质有很大的关系，口服苯并异硒唑衍生物用量需要远大于铂类抗癌药物(常规注射给药)用量。

3.1对免疫活性物质分泌的影响

通常干扰素IFN-γ由活化T细胞和自然杀伤细胞NK细胞产生，具有抗病毒，免疫调节和抑制肿瘤生长的特性。穿孔素(perforin)和颗粒酶B(Granzyme B)是细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞产生的，是细胞杀伤靶细胞的主要效应分子。

评估BS药物作用对免疫调剂和诱导作用，采用了Elisa方法检测经过20ng/mLPMA，20ng/mL的离子霉素和100U/mL的IL-2刺激了48h后的淋巴细胞分泌物，结果如表8所示。发现CDDP单药可以显著性提高穿孔素的分泌(P＜0.05)；BS显著性提高了颗粒酶的分泌(P＜0.05)；联合给药组同时显著性提高了穿孔素和颗粒酶的分泌且分泌量均大于单药组(P＜0.05)；BS和联合给药组都可以提高干扰素的分泌水平。说明BS和CDDP可以协同促进免疫活性物质的分泌，提高细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的杀伤活性，提高机体的免疫力，从而抑制肿瘤生长。

表8 BS和CDDP联用对小鼠免疫活性物质的影响

数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有显著性差异。

3.2淋巴细胞增殖活性检测

将提取到的淋巴细胞用含20ng/mL PMA，20ng/mL的离子霉素和100U/mL的IL-2刺激的培养基铺板，分别检测培养0h和培养48后各孔的细胞活力。结果如表9所示，对照组，BS给药组，CDDP给药组和联合给药组的细胞数分别增长到原来的151.5±41.0，285.4±44.7，136.1±26.3，355.9±21.2％；BS给药组，CDD给药组和联合给药组的增长率分别为对照组的1.88，0.90和2.35倍。说明BS和CDD具有协同促进淋巴细胞增殖的作用。

表9 BS和CDDP联用对淋巴细胞增殖活性的影响

数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有显著性差异。

3.3淋巴细胞杀伤活性检测

将提取到的淋巴细胞和Lewis肺癌细胞调整浓度用含20ng/mL PMA，20ng/mL的离子霉素100U/mL的IL-2刺激的培养基按照前面所述的方式铺板，培养24h后计算各淋巴细胞对Lewis肺癌细胞的杀伤活力。结果如表10所示，对照组，BS给药组，CDDP给药组和联合给药组的淋巴细胞对Lewis肺癌细胞的杀伤活力分别为17.06±2.45，22.78±3.22，19.80±4.10，29.71±2.55％。结果表明BS和CDDP具有协同提高淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤活性。

表10 BS和CDDP联用对淋巴细胞杀伤活性的影响

数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有显著性差异。

3.4小鼠淋巴细胞表面NKG2D配体表达检测

NKG2D在所有人和小鼠NK细胞和T细胞亚群表面表达，是在肿瘤免疫抑制中起关键作用的活化性受体。肿瘤可以通过降低体内的NKG2D受体来达到抑制免疫反应，从而免疫逃逸的目的。使用流式细胞术检测了小鼠淋巴细胞表面的NKG2D受体的表达，结果如表11所示，对照组，BS给药组，CDDP给药组和联合给药组分别为15018±2581，27187±1453，19789±1720，34001±4426；BS给药组，CDDP给药组和联合给药组NKG2D表达分别增长了31.8，81.0，126.4％。说明BS和CDDP具有协同上调淋巴细胞表面NKG2D活化性受体表达的作用。

表11 BS和CDDP联用对NKG2D表达的影响

数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有显著性差异。#P＜0.05，表示与CDDP组相比具有显著性差异。

3.5小鼠肿瘤细胞表面RAE-1受体表达检测

RAE-1是在小鼠肿瘤细胞表面表达的NKG2D活化性配体。肿瘤细胞通常可以通过下调RAE-1表达来阻止细胞毒性淋巴细胞对其识别，达到免疫逃逸的目的。我们使用WesternBlot方法检测小鼠肿瘤细胞表面RAE-1的表达，结果如图9所示，BS给药组，CDDP组和联合给药组的RAE-1水平相对对照组都上调，其中联合给药组有显著性差异(P＜0.05)。结果表明BS和CDDP联合可以协同促进小鼠肿瘤细胞表面NKG2D配体RAE-1的表达，从而提高细胞毒性淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫识别和杀伤，抑制肿瘤生长。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。