具体实施方式

本发明将4-四唑基苯甲酸Hakin-1、Hakin-2和Hakin-6(来自下文中的化合物#1、#2和#6)

鉴定为能够竞争仅存在于Hakai二聚体中的HYB结合位点的Hakai抑制剂。据报道，Hakai与肿瘤进展有关。因此，Hakai和E-钙粘蛋白之间的相互作用的抑制剂可能可用于癌症的治疗。在这个意义上并且如实施例中所示，本文已经利用化合物#1在体外和体内证明了对肿瘤进展的抑制。类似物#2和#6尚未用于测试，但它们在结构上与化合物#1密切相关，并且本说明书使得这些化合物也抑制肿瘤进展是合理的。

因此，本发明解决了提供具有优异的抗癌作用和低毒性的化合物的技术问题。因此，本发明的化合物可以有利地用作药剂，特别是用于治疗多种癌症，例如癌，特别是包括口(口腔癌)、食道、胃以及小肠和大肠(例如直肠癌或结肠癌)在内的胃肠道癌症。它还包括皮肤癌、乳腺(乳腺癌)、胰腺癌、肺癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胆囊癌、阴茎癌和尿膀胱癌(例如肾癌、前列腺癌或膀胱癌)。事实上，我们的数据(如示例中所示)共同示出了Hakin-1是Hakai介导的泛素化的特异性抑制剂，而不会影响Hakai蛋白水平(实施例1)。此外，Hakin-1能够在Hakai-MDCK细胞中抑制增殖，而在MDCK细胞中没有检测到任何影响(图4c)。Hakin-1还抑制其他上皮细胞系中的细胞增殖，例如乳腺癌MCF7细胞、前列腺癌PC-3细胞、膀胱癌5637细胞、肝癌HepG2细胞和肾癌ACHN细胞。所有这些发现都支持Hakin-1通过作用于细胞增殖、致癌潜能、细胞运动和侵袭的抗肿瘤作用。Hakin-1处理在裸鼠中明显抑制肿瘤生长，而没有全身毒性(图11)。此外，与对照DMSO处理的小鼠相比，Hakin-1导致在Hakai-MDCK异种移植小鼠的肺中检测到的微转移显著减少，而在未转化的MDCK注射小鼠的肺中没有发现检测到(图7f)。该结果强调了Hakin-1抑制了体内的肺转移。

化合物#1(如前所述，也称为Hakin-1)是一种1,5-二取代四唑，是一种常用于药物开发的化学和代谢稳定的药效团片段(Tetrazole Derivatives as PromisingAnticancer Agents,E.A.Popova等人,Anticancer Agents Med Chem.2017Mar 27.doi:10.2174/1871520617666170327143148,Epub ahead of print)。四唑环的1号位被4-羧基苯基取代。在5号位，它通过巯基甲基羰基接头与另一个苯环连接。

重要的物理化学参数，如分子量、计算的亲脂性logP和极性表面积都在不太可能通过血脑屏障的口服吸收药物所需的范围内。根据对Hakai HYB位点中化合物1的对接研究的快照，羧基苯基部分产生了3种重要的与蛋白质的氢键相互作用，并且可能模仿磷酸酪氨酸底物的结合模式。其他氢键由四唑氮原子中的两个形成，这提供了额外的稳定性并以确定的结合模式将四唑-羧基苯基单元保持在两端。因此，以下亚基似乎是必不可少的，并且应被视为鉴定化合物#1的衍生物的核心结构：

化合物#1、#2和#6的共同结构特征。

从这种共同结构核心出发，可以进行许多修饰以优化这些化合物的活性(和其他性质)并提供这些化合物的类似物。从这个意义上来说，有多种机会在分子的不同部分引入修饰，这代表了优化过程和提供化合物#1、#2和#6的类似物的重要目标。从这个意义上来说，药物化学计划将开始关注化合物#1周围的化学空间，而不那么优先关注化合物#2和#6的周围。考虑到这一点，在本文中我们提供一组可用于本发明的化合物#1、#2和#6的不同类似物。值得注意的是，可用作药剂，特别是用于治疗多种癌症，例如癌，特别是源自包括包括口(口腔癌)、食道癌、胃癌以及小肠和大肠(例如直肠癌或结肠癌)在内的胃肠道的上皮层的肿瘤。它还包括皮肤癌、乳腺(乳腺癌)、胰腺癌、肺癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胆囊癌、阴茎癌和尿膀胱癌(例如肾癌、前列腺癌或膀胱癌)。

为了找到与化合物#1和#2相似的那些类似物，通过将核心结构与环结构(Cy＝任何环)连接，从而提供第一类类似物。

这些类型的化合物根据以下结构子类a)至c)分组如下。

a)酮苯基类(包括化合物#1)：

需要注意的是，这些结构可以在苯环上或分子的另一部分中包含取代基，例如，在羧基苯环上或在硫和羰基之间的碳原子上包含取代基。后一种情况举例如下：

此外，以下示例示出了引入修饰，例如环丙基桥，或在羧基苯环上添加取代基：

可用于实施本发明的酮苯基化合物的具体实例如下示出：

4-(5-((2-(4-硝基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-乙酰苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-(甲磺酰基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(2-((1-(4-羧基苯基)-1H-四唑-5-基)硫代)乙酰基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-氨甲酰苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-(4-氨磺酰苯基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-(甲磺酰胺基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-(环丙烷甲酰氨基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-溴苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-氰基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-(4-三氟甲基)苯基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-环丙基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-(环丙基氨基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-吗啉代苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-甲氧基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-(5-氟吡啶-3-基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

b)酮杂芳基类：

通过将核心结构与环结构(Cy＝任何环)连接而提供的其他亚结构在本文中列为酮杂芳基类。从这个意义上说，药物化学中的典型探索是用杂芳基代替化合物#1中存在的苯基，杂芳基代表具有额外杂原子的类似芳环。在本文中我们提供6个属于此类别的类似物的实例：

如下所示的在结构上更接近苯基的6元杂芳基(如吡啶、嘧啶、哒嗪)也形成本发明的一部分：

此外，可用于实施本发明的酮杂芳基类化合物的具体实例如下示出：

4-(5-((2-氧代-2-(吡啶-4-基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(6-氨基吡啶-3-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(6-羟基吡啶-3-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(6-吗啉代吡啶-3-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(5-氰基吡啶-2-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-(嘧啶-4-基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-(哒嗪-4-基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-(吡嗪-2-基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

c)环酰胺类(包括化合物#2)：

通过将核心结构与环结构(Cy＝任何环)连接而提供的又另外的亚结构在本文中列为环酰胺类，如下所示：

特别地，取代的吲哚啉(和吲哚)类似物如下所示：

更特别地，在下文示出苯环上进行取代的任意化合物：

4-(5-((2-(5-溴代吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(5-氰基吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(5-环丙基吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(5-吗啉代吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-(5-(吡啶-3-基)吲哚啉-1-基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(5-氟代吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

1-(2-((1-(4-羧基苯基)-1H-四唑-5-基)硫代)乙酰基)吲哚啉-5-苯甲酸

4-(5-((2-(5-氨甲酰基吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

在分子的其他部分具有修饰：

4-(5-((1-(5-氰基吲哚啉-1-羰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

2-氟代-4-(5-((1-(5-吗啉代吲哚啉-1-羰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(5-氨甲酰基吲哚啉-1-羰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

3-环丙基-4-(5-((2-(5-氟代吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

3-氰基-4-(5-((2-(5-环丙基吲哚啉-1-基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

此外，上述通过将核心结构与环结构(Cy＝任何环)连接而提供的不同亚结构a)至c)可以进一步如下被取代：

1.在巯基乙酰基接头上具有取代的结构的实例

4-(5-((2-甲基-1-(4-硝基苯基)-1-氧代丙-2-基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(4-氨甲酰苯基)-2-甲基-1-氧代丙-2-基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-甲基-1-(4-(甲磺酰胺基)苯基)-1-氧代丙-2-基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(4-氰基苯基)-2-甲基-1-氧代丙-2-基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(4-硝基苯甲酰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(4-氨甲酰苯甲酰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(4-甲磺酰胺基)苯甲酰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-(4-氰基苯甲酰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

2.在羧基苯基部分上具有取代的结构的实例

2-氰基-4-(5-((2-(4-硝基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-氨甲酰苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)-2-氟苯甲酸

2-环丙基-4-(5-((2-(4-(甲磺酰胺基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(4-氰基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)-3-氟苯甲酸

3-氰基-4-(5-((2-(4-硝基苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

3-环丙基-4-(5-((2-(4-(甲磺酰胺基)苯基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

另一方面，衍生自用氮原子、碳原子和环状基团扩展核心结构以提供类似于化合物#6的化合物的全新的一组或一类化合物在本文中在亚类苄酰胺类下提供：

属于该类别的化合物在本文中如下所示：

属于此类化合物的其他化合物是：

4-(5-((2-((3-氰苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-((3-环丙基苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-((3-吗啉代苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-((3-(吡啶-3-基)苄基)氨基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-((3-氨甲酰苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-((3-氟苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

在分子的其他部分具有修饰：

4-(5-((1-((3-氰苄基)氨甲酰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

3-氰基-4-(5-((2-((3-环丙基苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((1-((3-吗啉代苄基)氨甲酰基)环丙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

2-氟代-4-(5-((2-氧代-2-((3-(吡啶-3-基)苄基)氨基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-((3-氨甲酰苄基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)-3-环丙基苯甲酸

4-(5-((1-((3-氟苄基)氨基)-2-甲基-1-氧代丙-2-基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

具有杂芳基：

4-(5-((2-氧代-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-((嘧啶-4-基甲基)氨基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-氧代-2-((哒嗪-4-基甲基)氨基)乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

4-(5-((2-(((5-氰基吡啶-2-基)甲基)氨基)-2-氧乙基)硫代)-1H-四唑-1-基)苯甲酸

所有上述化合物#1、#2和#6，连同归类为通过将核心结构与环结构(Cy＝任何环)连接以提供类似于化合物#1或#2的化合物而提供的那些结构，或作为衍生自用氮原子、碳原子和环状基团扩展核心结构以提供类似于化合物#6的化合物的一类化合物，在本文称为“本发明的化合物”。

在此指出，本发明的所有化合物以及其任何药学上可接受的盐都涵盖在以下通式中：

其中：

-A表示选自芳基、杂芳基和环酰胺的基团，该芳基、杂芳基和环酰胺任选地被1或2个独立地选自以下的基团取代：

e)卤素原子、NO₂、-CN、-N(R^a)R^b、-OR^a、-C(＝O)R^a、-C(＝O)OR^a、-C(＝O)N(R^a)R^b、-OC(＝O)-R^a、-N(R^c)C(＝O)R^b、-NR^cSO₂R^a、-SO₂N(R^a)R^b、-SR^a、-S(O)R^a、-S(O)₂R^a；

f)任选地被1、2或3个卤素原子取代的直链或支链C₁-C₆烷基；

g)任选地包含1或2个选自O、S和N的杂原子的C₃-C₆环烷基，并且其中环任选地被C₁-C₃烷基取代；

h)各自任选地被卤素原子、氰基、C₁-C₃烷基或环丙基取代的苯基或C₅-C₆杂芳基；

-R^a、R^b和R^c各自独立地表示：

e)氢原子；

f)任选地被1、2或3个选自以下的取代基取代的直链或支链C₁-C₁₂烷基、C₃-C₆环烷基和C₄-C₆杂环烷基：羰基、卤素原子、羟基、苯基、C₃-C₆环烷基、直链或支链C₁-C₆烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、直链或支链C₁-C₆烷基羰基；

g)任选地被1、2或3个选自以下的取代基取代的苯基或C₅-C₆杂芳基：卤素原子、氰基、直链或支链C₁-C₆烷基、直链或支链C₁-C₆卤代烷基、羟基、直链或支链C₁-C₆烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基；

h)R^a和R^b与它们所连接的氮原子一起形成3至8元环，该3至8元环任选地还包含选自O、N和S的其他杂原子，并且其中环任选地被1、2或3个选自以下的取代基取代：羰基、直链或支链C₁-C₆烷基、直链或支链C₁-C₆卤代烷基、直链或支链C₁-C₆烷基羰基；

-x和y是独立地选自0和1的整数；

-R¹表示选自氢、环丙基或直链或支链C₁-C₆烷基的基团，其中所述烷基任选地被1、2或3个卤素原子取代；

-当y为0时，则R¹的2或3个碳原子可与相邻的氮原子以及与该氮相连的芳环的2个相邻碳原子一起形成5元或6元环；

-R²和R³各自独立地表示选自氢、环丙基或直链或支链C₁-C₆烷基的基团；任选地，R²和R³可与它们都连接的碳原子一起形成3元或4元螺环；

-z是选自0、1、2或3的整数；

-R⁴表示选自-CN、环丙基或直链或支链C₁-C₆烷基的基团，所述烷基任选地被1、2或3个卤素原子取代；其中基团R⁴若存在则取代存在于与R⁴相连的苯环中的一个基团CH的氢原子。

优选地，R2和R3各自独立地表示选自环丙基或直链或支链C1-C6烷基的基团。

更优选地，R2和R3与它们都连接的碳原子一起形成3元或4元螺环。

更优选地，z是选自1、2或3的整数；R4表示选自-CN、环丙基或直链或支链C1-C6烷基的基团，其中所述烷基任选地被1、2或3个卤素原子取代；以及其中基团R4取代存在于与R4相连的苯环中的一个基团CH的氢原子。

更优选地，整数x和y中的一个或两个等于1，并且A表示选自由芳基、杂芳基和环酰胺组成的列表的基团，所述芳基、杂芳基和环酰胺被1或2个独立地选自以下的基团取代：卤素原子、-CN、-N(Ra)Rb、-ORa、-C(＝O)Ra、-C(＝O)ORa、-C(＝O)N(Ra)Rb、-OC(＝O)-Ra、-N(Rc)C(＝O)Rb、-NRcSO2Ra、-SO2N(Ra)Rb、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra；直链或支链C1-C6烷基，其中所述烷基任选地被1、2或3个卤素取代原子；任选地包含1或2个选自O、S和N的杂原子的C3-C6环烷基，并且其中环任选地被C1-C3烷基取代；各自任选地被卤素原子、C1-C3烷基或环丙基取代的苯基或C5-C6杂芳基。

再更优选地，本发明的化合物是化合物#1、#2和#6中的任意化合物，或以上所鉴定的且归类为通过将核心结构与环结构(Cy＝任何环)连接以提供类似于化合物#1或#2的化合物而提供的结构的任意化合物，或以上所鉴定的且归类为衍生自用氮原子、碳原子和环状基团扩展核心结构以提供类似于化合物#6的化合物的一类化合物的任意化合物。

在优选的实施方式中，可用于实施本发明的“本发明的化合物”选自以下列表中的任一个：

本发明的化合物可以是游离形式或药学上可接受的盐的形式。

药学上可接受的盐的例子包括：无机酸盐，例如，盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐或氢溴酸盐等；有机酸盐，例如，乙酸盐、富马酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或马来酸盐等。另外，当化合物具有例如羧基基团的取代基时，可以列举与碱形成的盐(例如，诸如钠盐、钾盐的碱金属盐等，或诸如钙盐的碱土金属盐等)。

本发明的化合物或其对映异构体或药学上可接受的盐可以是其分子内盐或加合物，或其溶剂化物或水合物中的任一种。

当本发明的化合物或本发明的其药学上可接受的盐用作医学用途的有效成分时，它可以与药学上可接受的载体一起使用。药学上可接受的载体是适合每种给药方法的惰性载体，并且可以配制成常规的药物制剂(片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、注射剂、输注剂等)。作为这样的载体，可以列举例如药学上可接受的粘合剂(例如阿拉伯树胶、明胶、山梨糖醇和聚乙烯吡咯烷酮)、赋形剂(例如乳糖、糖、玉米淀粉和山梨糖醇)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉和聚乙二醇)、崩解剂(例如马铃薯淀粉)等。当将它们用作注射溶液或输注溶液时，可以通过使用注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液来配制。

本发明的化合物和/或本发明的其药学上可接受的盐的给药方法没有特别限制，可以使用常规的口服或肠胃外给药方法(静脉内、肌肉内、皮下、经皮、鼻内及其他，透粘膜、肠内等)。

可以根据要用作有效成分的化合物的效力或特性，将本发明的化合物或本发明的其药学上可接受的盐的剂量任选地设定在足以表现出药理作用的有效量的范围内。剂量可以根据给药方法、患者的年龄、体重或状况而变化。

以下实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明。

实施例

实施例1.合成

本说明书通篇列出的化合物可以按照以下一般合成路线制备：

实施例2.

2.1.材料和方法

蛋白质和配体模型。从蛋白质数据库下载Hakai(PDB 3VK6)的磷酸酪氨酸结合域的X射线晶体结构，并使用适当的对称操作对二聚体进行建模。使用pdb2pqr服务器在7.2的pH值下进行氨基酸质子化。配体的3D模型是使用虚拟筛选和数据管理集成平台(VirtualScreening and Data Management Integrated Platform，VSDMIP)构建的，如其他地方所述。简言之，每个配体的初始3D坐标是用CORINA生成的[Sadowski,J.；Gasteiger,J.；Klebe,G.Comparison of Automatic Three-Dimensional Model Builders Using 639X-Ray Structures.J.Chem.Inf.Comput.Sci.1994,34,1000-1008(DOI:10.1021/ci00020a039)]。之后，使用ALFA[4]生成各种各样的构象异构体，通过采用AM1半经验模型和ESP方法为每个构象异构体分配MOPAC计算的原子部分电荷。所有配体模型都存储在VSDMIP数据库中，以用于不同的虚拟筛选活动。

虚拟筛选。eMolecules目录[https://www.emolecules.com/info/products-screening-compounds.html]中的配体已按上一节所述进行下载和处理。仅考虑呈现能够模拟磷酸酪氨酸残基的羧酸部分和/或磷酸基团的分子。接下来，通过使用CRScore评分函数和BFGS能量最小化器，用CRDOCK将选定的分子嵌入Hakai的结合口袋内。然后根据预测的分数对配体进行排序，并通过使用HYDE评分函数的内部实现来重新评估前350个分子。最后，对最好的20个分子进行可视检查，以选择最终的6个分子的集。

结合口袋分析。为了更好地分析虚拟筛选活动的结果，我们使用我们的内部cGRILL软件[6]基于假设的原子探针的范德华、库仑和氢键相互作用生成在Hakai的磷酸酪氨酸结合域的结合口袋内的亲和力图。使用带负电荷的受体探针(＝O)绘制磷酸酪氨酸残基的分子识别的可能位置，以帮助在对姿态进行可视检查期间滤除对接方案。

质粒、抑制剂和抗体

先前描述了pcDNA-Flag-Hakai、pBSSR-HA-泛素、pSG-v-Src和pcDNA-myc-E-钙粘蛋白质粒。化合物Hakin-1[4-(5-{[2-(4-硝基苯基)-2-氧乙基]硫代}-1H-四唑-1-基)苯甲酸]和Hakin-5[(2E,4E,8E)-7,13-二羟基-4,8,12-三甲基-2,4,8-十四碳三烯酸]分别从ChemBridge Corporation和TimTec或Analyticon Discovery获得。测试的其余类似物(酮苯基类A-1、A-7、A-8、A-9；酮杂芳基类：A-23、A-25；环酰胺类：A-10、A-16；以及苯甲酰胺类：A-6.1)从Vitasmlab获得。将化合物以100mM重悬于DMSO(Sigma)中以进行体外测定，而Hakin-1以100mM进行体内测定。最高浓度的DMSO用作实验的溶媒对照。请注意，Hakin-5的化学结构如图1所示。

细胞培养

MDCK、HEK293T、HepG2、MCF7和ACHN细胞在杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′sModified Eagles Medium，DMEM)中培养。之前已有报道稳定表达Hakai细胞的MDCK(Hakai-MDCK)，并且在含有G418(800μg/ml)的DMEM中生长。如前所述，Hakai-MDCK细胞的不同克隆表现出类似的表型和特征。LoVo细胞和PC-3细胞在F-12K培养基(Kaighn′s Modificationof Ham′s F-12Medium)中培养，HT-29细胞在McCoy's 5a Medium Modified中培养。5637细胞在RPMI培养基中培养。所有培养基都于37℃在具有5％CO2的加湿培养箱中，补充有1％青霉素/链霉素和10％热灭活胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)。细胞每月进行一次支原体污染测试，并且解冻后仅使用1-3个月。LoVo细胞和HT29细胞用StemElite ID系统(Promega)进行验证。对于相衬图像，使用Nikon Eclipse-TI显微镜拍摄培养细胞。

泛素化测定

对于泛素化测定，将750000个HEK293T细胞接种在6孔细胞培养板中，24h后用0.25μg Src、0.75μg Flag-Hakai和0.5μg HA-泛素与Lipofectamin 2000(Invitrogen，Uk)进行转染。转染后6h，细胞用指定浓度的Hakin-1、Hakin-5或测试的其余类似物处理36h。在补充有10mM N-乙基马来酰亚胺的含有10μg/ml亮抑酶肽、10μg/ml抑肽酶和1mM苯甲磺酰氟(Phenylmethanesulphonyl fluoride，PMSF)的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.5、150mMNaCl和1％Triton X-100)中获得全细胞提取物。收获细胞并使用抗HA抗体进行蛋白质印迹以检测泛素化。

免疫沉淀

对于免疫沉淀实验，用3μg Src、4μg Flag-Hakai、以及2μg Ha-泛素和3μg E-钙粘蛋白与Lipofectamin 2000(Invitrogen，英国)对293细胞进行转染。转染后24h，将细胞在补充有10mM N-乙基马来酰亚胺和2.5mM原钒酸钠并含有含有10μg/ml亮抑酶肽、10μg/ml抑肽酶和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)的1ml 1％Triton X-100裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl和1％Triton X-100)中裂解20分钟。以18000g离心10分钟后，将上清液用与60μl蛋白G PLUS-琼脂糖珠结合的2μg抗E-钙粘蛋白抗体免疫沉淀2h，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，并用如前所述指定的抗体进行蛋白质免疫印迹。

活力测定

对于细胞毒性测定，将细胞以1×10⁴个/孔接种到96孔板中。24h后，细胞用指定的抑制剂处理72h，并按照制造商的说明(Sigma Aldrich，StLouis，MO)进行MTT比色细胞活力测定。使用Multiskan Plus Reader(Nanoquant Infinite M200 Tecan Trading AG，瑞士)在570nm和630nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism软件设计剂量反应曲线并计算半数最大抑制浓度(IC₅₀)值。所示的数据是至少三次独立实验的平均值±SEM，每个条件有六个重复。

蛋白质印迹和免疫荧光

对于蛋白质印迹分析，将细胞用指定的抑制剂处理48h，并如前所述获得全细胞提取物。将20微克裂解物在10％聚丙烯酰胺SDS-PAGE上解析，然后如前所述进行蛋白质印迹分析。对于免疫荧光测定，使细胞在玻璃盖玻片上生长24h，并用指定的抑制剂处理48h。将细胞用4％PFA固定15min，用0.5％Triton X-10透化并用E-钙粘蛋白抗体孵育2h。将盖玻片与带荧光素标签的二抗(Dakopatts，Sweden)一起孵育1h。最后用ProLong Gold抗淬灭试剂(LifeTech，UK)固定盖玻片，并使用40倍物镜在落射荧光显微镜(Olympus)中拍摄图像。

增殖试验

对于BrdU测定，将指定细胞以1×10⁴个/孔铺到96孔板中。24h后，用指定的抑制剂处理细胞48h。三次独立的实验对每个条件铺六个重复。用10mM BrdU处理细胞2h。根据制造商的说明(Roche，瑞士)，使用细胞增殖比色免疫测定试剂盒测量新合成的DNA中的BrdU掺入。结果表示为平均值±S.D。结果表示以三次独立实验的阳性细胞百分比(平均值±S.D)表示。

软琼脂集落形成测定

在12孔板上以5×10³个MDCK和MDCK-Hakai细胞/孔或12×10³个HT29细胞/孔的密度一式三份地进行软琼脂集落形成测定。将细胞接种在具有覆盖在0.75％低熔点琼脂糖层上的0.5％低熔点琼脂糖的培养基中(Lonza Rockland，ME，USA)。用指定的抑制剂处理细胞，并使用DMSO作为载体。每3天对处理进行更新，在21天(对于MDCK和MDCK-Hakai细胞)或28天(对于HT29细胞)后，对集落数进行量化。使用Nikon Eclipse-TI显微镜(物镜4倍)拍摄每个条件下的五个随机选择的视野的量化。实验按一式三份进行，并重复三次。数据以平均值±SD表示。

迁移和侵袭测定

对于侵袭测定，用Hakin-1或DMSO作为载体处理细胞48h，在最后24h内使用1％FBS进行处理。将3×10⁵个MDCK、MDCK-Hakai或LoVo细胞接种在包含含有2％FBS的培养基的细胞侵袭室(细胞侵袭测定试剂盒，Chemicon International)中。在72h(对于MDCK和MDCK-Hakai侵袭)和16h(对于LoVo细胞)后，按照制造商的说明，将到达含有30％FBS的下室的侵袭的侵袭性细胞固定并用结晶紫(Sigma Aldrich，StLouis，MO)染色。对于迁移试验，用Hakin-1或DMSO作为载体培养HT29细胞48h，最后24h使用无血清培养基进行处理。在含有无血清培养基的细胞迁移室中接种3×10⁵个HT29细胞(细胞迁移试剂盒，Millipore，Bedford，MA)。16h后，按照制造商的说明，将在含有30％FBS的血清的下室中的迁移的细胞用结晶紫染色，并进行计数。对于侵袭和迁移测定，在用Olympus显微镜使用20倍物镜拍摄的五个视野中对细胞进行计数，对于每种条件按一式三份进行实验，并且重复进行至少三次试验。结果以平均值±SD表示。

肿瘤异种移植模型

根据欧洲共同体法律(86/609/EEC)和西班牙法律(R.D.53/2013)，异种移植实验在INIBIC的手术实验单位-技术培训中心(Experimental Surgery Unit–TechnologicalTraining Center)进行。该实验得到了Xerencia de Xestion Integrada da (XXIAC)动物实验伦理委员会(Ethics Committee for Animal Experimentation)的批准。小鼠处于12h/12h的光/暗循环中，水和食物可随意获得。六周龄的无胸腺nu/nu小鼠随机分组。将一百万个重悬于不含血清和抗生素的DMEM中的MDCK细胞皮下接种到动物的两侧腹，所述动物共两组，每组3只。将相同数量的Hakai-MDCK细胞注射到动物，所述动物有两组，每组4只。接种20天后，Hakai-MDCK中的肿瘤可触知。然后，一半的动物每3天用Hakin-1(5mg/kg)处理，另一半用相同浓度的DMSO处理。用电子卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周监测两次肿瘤生长。肿瘤体积以pLW2/6计算。接种四十天后，处死动物。将肿瘤、肺、肾和肝收集并固定在4％PFA中并包埋在石蜡块中用于组织学和/或免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)分析。

组织学和免疫组织化学

如前所述，将肿瘤和组织脱蜡、再水化并用苏木精和曙红(Haematoxylin andeosin，H&E)染色。肿瘤切片(4μm)也进行脱蜡和水化用于免疫组织化学。通过在柠檬酸盐缓冲液(DakoREAL，Denmark)或EDTA缓冲液中加热样品(2100Retriever；PickCellLaboratories)进行抗原修复。然后，用过氧化物酶阻断剂(DakoCytomation，Denmark)阻断内源性过氧化物酶活性。样品用0.2％BSA和0.1％Tx-100封闭和透化1小时，并于4℃在湿室中与指定的一抗孵育过夜。将载玻片与二抗在室温下孵育1小时，并根据制造商的说明使用DAB(DakoReal Envision试剂盒)进行检测。最后，用Gill苏木精对细胞核进行复染，并用DePeX固定。用Olympus显微镜拍摄照片。对每只动物拍摄5张照片，使用Image J程序进行图像量化，所示的结果以平均值±SEM显示。在用H&E染色的切片中计算有丝分裂的数量。在这种情况下，使用Olympus BX50显微镜(物镜40倍)对每个肿瘤拍摄十张照片，并手动计算有丝分裂的数量。结果以平均值±SEM表示，并示出了每种条件的代表性照片。

来自体内小鼠模型的肺转移的量化

使用实时PCR来研究小鼠肺中转移的存在。使用针对MDCK-Hakai细胞中表达的异位的带HA标签的Hakai中存在的HA表位和Hakai的引物(5′-TCTGGGACGTCGTATGGGTA-3′；5′-TTCTTCATCACCTTGCGGG-3′)进行定量。使用小鼠载脂蛋白B(apob)的引物(5′-CGTGGGCTCCAGCATTCTA-3′；5′-TCACCAGTCATTTCTGCCTTTG-3′)作为内源对照。使用MDCK细胞系作为阴性对照。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen)从石蜡块(4μm)的10-15个切片中提取肺DNA。使用LightCycler 480实时光循环仪(Roche)，通过定量PCR以技术上一式三份(technical triplicates)进行DNA的扩增和定量。相对DNA水平通过2^-ΔΔCt方法计算。

统计分析

使用Shapiro-Wilk检验来考察正态分布，Levene检验来评估方差齐性。数据的统计显著性用进行Bonferroni检验的ANOVA或进行Tukey校正检验的Kruskal-Wallis来确定。图中所示的实验组之间的显著性显示为*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001。如所示的，获得的结果以平均值±SD或平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism软件分析异种移植测定中的存活图，并使用Breslow检验来计算p值。结果以处理细胞相较于未处理细胞所获得的值的倍数变化表示。

用于实施本发明的抗体列表。

体内TUNEL试验

使用标准方案对来自肿瘤的组织切片进行脱蜡和再水化。将载玻片用PBS冲洗两次，并用柠檬酸盐缓冲液(DakoREAL，Denmark)在微波中以350W处理5分钟。然后按照制造商的说明用荧光素法原位细胞死亡检测试剂盒(Cell Death Detection Kit,Fluorescein)(Roche)分析组织切片。然后，将载玻片与Hoechst一起在黑暗中孵育5min。在落射荧光Olympus显微镜下使用20倍物镜观察反应。每个部分拍摄了五张代表性照片。计算阳性细胞的百分比，结果以平均值±SEM表示。

2.2.结果

鉴定推定的选择性Hakai抑制剂

为了找到具有抑制Hakai所需的潜能的候选分子，我们根据可用的结构信息和磷酸酪氨酸结合口袋的性质设计了一个虚拟筛选工作流程，对此的探索在亲和力探针的帮助下进行。作为第一步，我们仅考虑化学库中显示带负电荷的羧酸根或磷酸根基团的分子，这些分子与结合口袋的高正分子静电势互补。然后将选定的分子对接到Hakai二聚体中以评估所有可能的结合姿态，然后使用HYDE后处理评分函数进行排序以估计假想的Hakai-抑制剂复合物的相互作用能。对排行前20的分子可视检查，并选择其中两个用于后续实验验证，即Hakin-1和Hakin-5(图1a)。根据我们的结合模式模型，Hakin-1中存在的苯甲酸酯部分将是磷酸酪氨酸的替代物(图1b，上图)。根据我们的亲和力图估计，羧酸根基团位于对带负电荷的探针极为有利的区域。该区域由残基Lys-126、Tyr-176、His-185和Arg-189排列而成，而苯环将夹在胍基与Arg-174和Arg-189的侧链之间。分子的其余部分将能够与来自两个单体的Arg-174残基的侧链、以及Gln-170主链建立氢键，同时保持所需的形状。尽管Hakin-5(图1b，下图)带有羧酸根基团并呈现出相同数量的氢键相互作用的潜在基团，但其缺乏可以模拟磷酸酪氨酸的苯环。

Hakin-1抑制剂对Hakai诱导的泛素化的影响

我们首先通过使用培养的肿瘤细胞研究了Hakin-1抑制剂对由E3泛素连接酶Hakai诱导的泛素化的影响。在存在Hakin-1抑制剂或作为对照的DMSO作为对照的情况下，用Src、Hakai和泛素转染293T细胞。Hakin-1以剂量依赖性方式强烈减少由Hakai介导的泛素化(图1c)，并且Hakai蛋白水平上未见影响。然而，当Hakai没有过表达时，Hakin-1不影响泛素化，这证实了Hakin-1以Hakai依赖性方式减少泛素化(图1d)。此外，当在通过虚拟筛选鉴定的另一种Hakai抑制剂Hakin-5存在下处理细胞时，没有检测到对Hakai介导的泛素化产生影响(图1e)，这进一步支持了Hakin-1对Hakai诱导的泛素化的特异性影响。最后，当细胞用Hakin-1进行处理时，我们观察到E-钙粘蛋白复合物的Hakai依赖性泛素化减少(图1f)。总的来说，我们的数据表明了，Hakin-1抑制Hakai介导的泛素化而不影响Hakai蛋白水平。

Hakin-1对Hakai的抑制激活肿瘤细胞的上皮分化

接下来，我们研究了Hakai抑制对癌细胞的细胞活力的影响。为此，我们通过在若干种上皮细胞中使用Hakin抑制剂生成了剂量反应曲线，正如我们之前报道的那样。首先，我们分析了Hakin-1对HT-29和LoVo结肠肿瘤细胞系的细胞毒性作用，显示出了重要的抑制反应(图2a)。我们通过使用已广泛用作体外模型系统来研究EMT的正常上皮MDCK细胞系来扩展我们的研究。如前所述，MDCK细胞(Hakai-MDCK)中的Hakai过表达诱导成纤维细胞样表型和基于E-钙粘蛋白的细胞-细胞接触的消失。当用Hakin-1或Hakin-5抑制剂处理这些细胞系时，与更具抗性的正常上皮MDCK相比，Hakai-MDCK细胞系的测试的两个克隆对Hakin-1和Hakin-5处理更敏感(图2b)。这些结果进一步表明，Hakin-1可能对Hakai过表达的癌细胞特别有效，正如在人类结肠癌中所见的，与邻近的正常组织相比，Hakai在结肠癌中明显增加。鉴于先前报道的Hakai在上皮-间充质转化中的作用，我们接下来分析了Hakin-1对肿瘤细胞表型的影响。通过相衬，我们观察到Hakin些许诱导了HT-29和LoVo细胞的上皮表型，然而，重要的是要注意这两种细胞系已经显示出上皮形态(图2c)。此外，我们测试了Hakin-1和Hakin-5抑制剂对Hakai转化的MDCK细胞的间充质表型的影响。我们观察到上皮表型的诱导，增加了细胞-细胞接触，伴随着突起形成的减少。相反，当用特定抑制剂处理上皮MDCK细胞时没有观察到影响(图2d)。鉴于已报道的Hakai在EMT期间通过其对E-钙粘蛋白泛素化、内吞和降解的分子作用，导致细胞-细胞接触的改变的作用，我们进一步研究了Hakin-1抑制剂对EMT逆转的影响。如图3a所示，通过蛋白质印迹，我们观察到Hakin-1能够增加HT-29细胞中的E-钙粘蛋白水平，而间充质波形蛋白标志物减少。我们还分析了Hakin-1对皮层蛋白(另一种报道的Hakai底物)的影响，证实了其对增加表达水平的影响。我们还通过使用另一种上皮肿瘤细胞LoVo细胞证实了这些结果(图3b)。此外，由于细胞-细胞接触处的E-钙粘蛋白丧失被认为是EMT的标志，我们通过免疫荧光研究了E-钙粘蛋白的表达，显示出HT-29和LoVo细胞中细胞-细胞接触处的E-钙粘蛋白水平显著增加(图3c)。然而，当使用Hakin-5时，通过蛋白质印迹或免疫荧光没有检测到对E-钙粘蛋白水平的影响(图8)。最后，为了测试Hakin-1的影响，还使用了间充质Hakai-MDCK细胞。Hakai-MDCK细胞不表达E-钙粘蛋白基础蛋白水平，因此在Hakin-1处理下没有检测到复原。综上所述，这些结果表明Hakin-1诱导不同肿瘤上皮细胞中的上皮分化，伴随着体内间充质标志物的减少。

Hakin-1抑制肿瘤培养细胞的增殖、致癌潜能和侵袭

我们接下来使用标准增殖和软琼脂集落形成测定表征了Hakin-1在肿瘤细胞系中的作用。鉴于Hakai不仅影响细胞间接触，而且影响成纤维细胞和上皮细胞的增殖，我们决定确定Hakin-1在细胞增殖中的可能影响。尽管使用Hakin-5抑制剂未见效果(图4b)，但Hakin-1降低了HT29和LoVo细胞系中的细胞增殖(图4a)，这进一步支持了Hakin-1通过其对细胞增殖进行控制而产生的抗肿瘤作用。我们通过使用Hakai-MDCK细胞与正常上皮MDCK细胞进行对比扩展了我们的分析。正如之前报道的那样，我们证实了，与正常MDCK细胞相比，Hakai转化的MDCK细胞强烈地增加了细胞增殖(图4c)。有趣的是，Hakin-1能够抑制Hakai-MDCK细胞的增殖，而在未转化的上皮MDCK细胞中没有检测到任何影响(图4c)。Hakin-1还抑制其他上皮细胞系中的细胞增殖，例如乳腺癌MCF7细胞、前列腺癌PC-3细胞、膀胱癌5637细胞、肝癌HepG2细胞和肾癌ACHN细胞。(图9)。这些结果表明，当表达高水平的Hakai时，例如这发生在人类腺癌中，Hakin-1可能起到抗增殖剂的作用。通过使用软琼脂集落形成测定，我们评估了Hakin-1在HT-29和Hakai-MDCK肿瘤细胞系中的作用，显示出对两种细胞系中的集落形成的强烈抑制(图4d)。正如我们之前发表的那样，在用Hakin-1处理MDCK未转化细胞时没有检测到集落形成。EMT过程的特点是获得迁移和侵袭能力。我们证明了Hakin-1强烈降低了LoVo细胞中的细胞侵袭(图5a)。此外，虽然在MDCK细胞中没有检测到细胞侵袭，但Hakai过表达诱导了在正常上皮MDCK细胞中侵袭的能力，在这些Hakai-MDCK细胞中，Hakin-1也降低了细胞侵袭(图5b)。最后，考虑到HT-29细胞在这些实验条件下无法侵袭，我们测试了Hakin-1对细胞运动的影响，显示出在Hakin-1处理下细胞迁移显著减少(图5c)。所有这些发现都支持Hakin-1通过作用于细胞增殖、致癌潜能、细胞运动和侵袭的抗肿瘤作用。

Hakin-1在肿瘤异种移植物中的体内抗肿瘤作用

在EMT期间获得迁移和侵袭能力是形成远处转移的关键事件，因此把这些事件作为目标是癌症治疗的理想方法。由于我们已经证明了Hakin-1有效抑制细胞培养中的细胞增殖、致癌潜能以及细胞侵袭和运动，因此我们决定研究Hakin-1对体内抑制预先存在的肿瘤的功效。为此，将MDCK和Hakai-MDCK细胞皮下注射到裸鼠的侧腹。如先前所报道的，Hakai-MDCK细胞形成原发性肿瘤，而亲代MDCK细胞则不能如此。Hakin-1显示出在体内抑制异种移植肿瘤生长的有效作用(图6a)。在形态学上，异种移植肿瘤细胞表现出未分化和纺锤形的表型、大的细胞核和细胞质大小减小。这种形态被Hakin-1处理强烈改变，显示出诱导了肿瘤分化和细胞质大小的增加(图6b)。此外，我们发现了血管中存在肿瘤细胞浸润，而在Hakin-1处理的异种移植肿瘤中没有检测到浸润(图6c)。此外，通过分析两种增殖标志物Ki67和有丝分裂指数，表明Hakin-1显著减少Ki67阳性细胞的数量和有丝分裂指数(图6d-e)，而没有检测到对细胞凋亡的影响(图10)，这进一步强调了Hakin-1对体内细胞增殖的抑制作用。我们还使用CD31血管生成标志物通过免疫组织化学使肿瘤切片中的血管可视化。与未处理的肿瘤相比，量化了Hakin-1处理的异种移植肿瘤中血管数量的显著减少，表明其对血管生成的抑制作用(图6f)。有趣的是，在Hakin-1处理的裸鼠的肺和肾组织中没有观察到损伤，显示出正常的形态结构，这支持了Hakin-1处理抑制裸鼠的肿瘤生长，并且显然没有全身毒性(图11)。

Hakin-1处理在体内降低了肺中的肿瘤异种移植的N-钙粘蛋白间充质标志物和微转移形成

我们进一步评估了Hakin-1对EMT逆转的体内影响，这是肿瘤进展和细胞侵袭的关键过程。首先，我们证实了Hakai蛋白表达水平不受裸鼠的异种移植肿瘤中的Hakin-1作用的影响(图7a)，这进一步支持了先前的体外结果，该体外结果表明Hakin-1通过对其泛素连接酶活性的作用来抑制Hakai活性，而不改变Hakai蛋白表达(图1)。鉴于E-钙粘蛋白在Hakai-MDCK细胞中完全消失，正如预期的那样，在存在或不存在Hakin-1的情况下，在裸鼠的Hakai-MDCK异种移植肿瘤中没有检测到E-钙粘蛋白(图7b)。然而，当我们研究N-钙粘蛋白间充质标志物(EMT的另一个标志)的表达水平时，我们发现与DMSO处理的小鼠相比，用Hakin-1处理的肿瘤异种移植物中的N-钙粘蛋白的表达强烈地降低(图7c)。这些数据进一步支持了Hakin-1通过减少N-钙粘蛋白间充质标志物来抑制间充质型肿瘤细胞。鉴于Hakai的最佳描述的靶标E-钙粘蛋白在Hakai-MDCK间充质肿瘤中完全不存在，我们还通过分析Hakai的另一个描述的靶标皮层蛋白来扩展我们的研究。皮层蛋白是一种细胞骨架蛋白，也是Src激酶的主要底物之一。有趣的是，仅在Hakai-MDCK异种移植肿瘤的细胞质中检测到皮层蛋白表达，并且其表达通过Hakin-1处理得以恢复(图7d)，这进一步支持了Hakin-1可以抑制Hakai对皮层蛋白的泛素化和降解的诱导。为了确定Hakin-1是否可能影响癌症转移，通过H&E染色分析来自裸鼠的肺组织，然而，在实验条件下没有检测到远处转移(图7e)。因此，为了检测可能存在的微转移，我们通过分析肺中Hakai-MDCK DNA的存在进行了定量PCR。为此，通过使用两种不同的特异性引物(一种针对HA表位设计，第二种引物针对Hakai设计)来测量Hakai-MDCK细胞中存在的带HA标签的Hakai。与对照DMSO处理的小鼠相比，Hakin-1导致在Hakai-MDCK异种移植小鼠的肺中检测到的微转移显著减少，而在MDCK注射小鼠的肺中没有发现检测到(图7f)。该结果强调了Hakin-1在体内抑制了向肺转移。

Hakin-1类似物对细胞毒性和Hakai诱导的泛素化的影响

接下来，我们研究了所选类似物对HT29结肠癌细胞的影响。首先，我们分析了以下类似物对HT-29结肠肿瘤细胞系的细胞毒性作用：酮苯基类：A-1、A-7、A-8和A-9；酮杂芳基类：A-23和A-25；环酰胺类：A-10和A-16；以及苯甲酰胺类：A-6.1。显示出酮苯基类A-7、A-8、A-9和酮杂芳基类A-23、A-25的重要抑制反应，但是没有通过酮苯基类A-1、环酰胺类A-10和A-16、以及苯甲酰胺类A-6.1的作用检测到细胞毒性作用(图12)。然后，我们通过使用培养的肿瘤细胞研究了特定选择的类似物对E3泛素连接酶Hakai诱导的泛素化的影响。在特定类似物抑制剂或作为对照的DMSO的存在下，用Src、Hakai和泛素转染293T细胞。通过使用酮苯基类A-7类似物，观察到由Hakai介导的泛素化以剂量依赖性方式显著降低(图13)，显示出对Hakai活性降低的影响，而不影响Hakai蛋白水平。另一方面，类似物酮苯基类A-9在测试浓度下减少了Hakai介导的泛素化，但降低了Hakai蛋白水平。此外，环酰胺类A-10和A-16些许降低了Hakai介导的泛素化，而不影响蛋白质水平。最后，还检测到低浓度的酮杂芳基类A-23对Hakai活性的抑制作用。